Summary
Nous décrivons ici les procédures développées dans notre laboratoire pour la préparation de poudres de cristaux de petites molécules pour des expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED).
Abstract
Un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour les expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED) est décrit. MicroED a été développé pour résoudre des structures de protéines et de petites molécules à l’aide d’un équipement standard de cryomicroscopie électronique (cryo-EM). De cette façon, de petites molécules, des peptides, des protéines solubles et des protéines membranaires ont récemment été déterminés à des résolutions élevées. Les protocoles sont présentés ici pour la préparation de grilles de produits pharmaceutiques à petites molécules en utilisant le médicament carbamazépine comme exemple. Les protocoles de dépistage et de collecte des données sont présentés. Des étapes supplémentaires du processus global, telles que l’intégration des données, la détermination de la structure et le raffinement, sont présentées ailleurs. Le temps nécessaire à la préparation des grilles de petites molécules est estimé à moins de 30 min.
Introduction
La diffraction électronique microcristalline (MicroED) est une méthode de cryomicro-microscopie électronique (cryo-EM) pour déterminer les structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille inférieureau micromètre 1,2. Les cristaux sont appliqués sur des grilles de microscope électronique à transmission standard (MET) et congelés en plongeant dans de l’éthane liquide ou de l’azote liquide. Les grilles sont ensuite chargées dans un TEM fonctionnant à des températures cryogéniques. Les cristaux sont situés sur la grille et criblés pour la qualité initiale de la diffraction. Les données MicroED à rotation continue sont collectées à partir d’un sous-ensemble des cristaux filtrés, où les données sont enregistrées à l’aide d’une caméra rapide comme film3. Ces films sont convertis en un format cristallographique standard et traités presque à l’identique comme une expérience de cristallographie aux rayons X4.
MicroED a été développé à l’origine pour étudier les microcristaux de protéines 1,2. Un goulot d’étranglement dans la cristallographie des protéines fait pousser de gros cristaux bien ordonnés pour les expériences traditionnelles de diffraction des rayons X synchrotron. Comme les électrons interagissent avec des ordres de grandeur de matière plus forts que les rayons X, les limites de la taille des cristaux nécessaires pour produire une diffraction détectable sont considérablement plus petites5. De plus, le rapport entre les événements de diffusion élastiques et inélastiques est plus favorable pour les électrons, ce qui suggère que des données plus utiles peuvent être collectées avec une exposition globale plus faible5. Des développements constants ont permis de recueillir des données MicroED à partir des microcristaux les plus difficiles 6,7,8,9.
Récemment, MicroED s’est avéré être un outil puissant pour déterminer les structures de produits pharmaceutiques à petites molécules à partir de matériaux apparemment amorphes10,11,12,13. Ces poudres peuvent provenir directement d’une bouteille de réactif acheté, d’une colonne de purification, ou même de l’écrasement d’une pilule en une poudre fine10. Ces poudres semblent amorphes à l’œil, mais peuvent être entièrement composées de nanocristaux ou simplement contenir des traces de dépôts nanocristallins dans une fraction amorphe non cristalline plus grande. L’application du matériau à la grille est facile, et les étapes ultérieures d’identification des cristaux, de criblage et de collecte de données pourraient même être automatisées dans un proche avenir14. Alors que d’autres peuvent utiliser des méthodes différentes pour la préparation des échantillons et la collecte de données, ici les protocoles développés et utilisés dans le laboratoire Gonen pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour MicroED et pour la collecte de données sont détaillés.
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Protocol
1. Préparation d’échantillons de petites molécules
- Transférer une petite quantité (0,01 à 1 mg) de poudre, de liquide ou de solides dans un petit flacon ou un tube.
- Pour les échantillons déjà sous forme de poudre, scellez le tube à l’aide du bouchon jusqu’à ce que l’échantillon soit nécessaire. Sécher les échantillons liquides en poudres avant de tenter la méthode 1 (étape 3) ou 2 (étape 4).
NOTA: Les échantillons dissous dans un liquide peuvent utiliser la méthode 3 (5.X) ci-dessous.
2. Préparation des grilles TEM
REMARQUE : Certains TEM équipés de systèmes de chargeur automatique exigent que les grilles soient clipsées et placées dans une cassette avant d’être chargées dans la colonne TEM. L’écrêtage consiste à fixer physiquement la grille TEM de 3 mm dans un anneau métallique que le chargeur automatique peut manipuler. Cette étape et les étapes suivantes peuvent être effectuées à l’aide de grilles TEM normales ou de grilles TEM qui ont été tronquées. Pour ces expériences, il est souvent plus facile de manipuler les grilles si elles ont été découpées à l’avance.
- Enroulez un film plastique autour d’une extrémité d’une lame de couvercle en verre.
- Placez les grilles TEM sur le film sur le dessus de la diapositive de couverture, le côté carbone vers le haut. Identifiez les deux côtés de la grille sous une lumière. Le côté cuivre brille et apparaît métallique, tandis que le côté carbone apparaît d’une couleur terne et brune (Figure 1C, D). Pour les grilles clipsées, le côté carbone doit faire face à la face plate de l’anneau de clip.
- Placez la glissière avec des grilles dans la chambre de décharge luminescente. Décharge luminescente du couvercle pendant environ 30 s en utilisant le réglage négatif à 15 pA. Rangez les grilles sur la lame de couverture à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre tapissée de papier filtre avant d’ajouter l’échantillon aux grilles.
3. Application de l’échantillon sur des grilles en créant une poudre fine homogène (méthode 1)
- Retirez une grille TEM à décharge luminescente de la boîte de Petri couverte à l’aide d’une pince à épiler. Placez la grille sur un papier filtre circulaire avec le côté carbone vers le haut.
- À l’aide d’une petite spatule, retirez une très petite cuillère de poudre (environ 0,1 mg) et placez-la sur une petite feuille de verre carrée juste à côté de la grille TEM sur le papier filtre. Placez une autre petite lame de verre carrée ou une lamelle de couverture sur la poudre.
- Avec les doigts, frottez doucement les deux lames de verre ensemble pour obtenir une poudre fine.
- Inclinez les lamelles de couverture et placez-les juste au-dessus de la grille TEM sur le papier filtre et continuez à frotter les lamelles ensemble, à quelques cm seulement au-dessus de la grille TEM déchargée à la lueur (Figure 1).
- Observez pour voir si la poudre tombe vers la grille. Découvrir la poudre finement broyée en retirant l’une des deux lamelles de couvercle en verre. Badigeonner doucement la fine poudre de la lamelle de couverture à l’aide d’un morceau de papier filtre sur la grille TEM (Figure 1).
4. Application de l’échantillon aux grilles en appliquant la méthode de l’agitation (méthode 2)
- Prenez une grille à l’aide d’une pince à épiler et déposez-la dans le flacon ou le tube de l’échantillon de poudre. Fermez le flacon à l’aide du capuchon en plastique pour vous assurer qu’aucun matériau ne s’échappera lorsqu’il sera secoué.
- En saisissant le flacon dans la main, secouez le flacon de manière à ce que la poudre et la grille bougent pendant environ 10 à 30 s.
- Vider le contenu du flacon sur un papier filtre circulaire. En saisissant la grille sur un bord, tapotez doucement le bord de la grille sur le papier filtre pour enlever tout excès de matériau de la grille.
NOTE: Selon le type de flacon et la taille, on peut également utiliser une pince à épiler pour retirer la grille TEM sans vider le contenu.
5. Application de l’échantillon aux grilles à l’aide de la méthode d’évaporation (méthode 3)
- Placez une grille (clipsée ou non) au centre d’un morceau circulaire de papier filtre avec le côté carbone vers le haut et le côté cuivre vers le bas.
- À l’aide d’une seringue étanche aux gaz de 10 μL, appliquer une petite goutte (environ 1 à 3 μL) de composé dissous sur le côté carbone de la grille.
- Déplacez délicatement le papier filtre avec des grilles dans une chambre de dessiccation sous vide. Couvrez la chambre et allumez l’aspirateur. Laissez les grilles sous vide sécher jusqu’à une journée.
- Éteignez l’aspirateur et laissez la chambre s’évacuer pendant 5 min. La ventilation de la chambre évite que les grilles se déplacent ou s’envolent lorsqu’elles sont découvertes.
6. Congélation et chargement des grilles dans le GDT
- Saisissez le bord de la grille TEM à l’aide d’une pince à épiler, en vous assurant que les pointes ne perforent aucun des carrés de la grille. Soulevez la grille de 1 à 2 cm au-dessus du papier filtre et inclinez la grille à 90° par rapport au papier en dessous. Tapotez doucement la pince à épiler tout en gardant la grille fermement serrée pour enlever toute poudre en vrac.
- Congelez la grille en déplaçant la pointe de la pince à épiler avec la grille directement dans un récipient d’azote liquide à la main. Ce conteneur est généralement la station de chargement du réseau pour le TEM, mais il peut s’agir de tout conteneur sûr, tel qu’un thermos à azote liquide, qui peut être transféré ou stocké. L’azote liquide est de -196 °C.
- Attendez que la grille et la pince à épiler cessent de bouillir avant de poursuivre les manipulations.
- Sous l’azote liquide ou dans les vapeurs d’azote, placez la grille dans le porte-échantillon avec le côté carbone orienté de telle sorte que l’échantillon sera frappé par le faisceau avant le film de support de carbone.
- Charger le porte-échantillon dans le TEM en s’assurant que la grille est maintenue à la température de l’azote liquide en tout temps.
- Pour les systèmes de chargement automatique, placez les grilles clipsées dans une cassette dans un récipient refroidi à l’azote liquide. Cette cassette transférée dans un conteneur de navette permet à la robotique du chargeur automatique d’accepter la cassette tout en gardant les échantillons en sécurité pour la navette entre le chargeur automatique et la colonne.
- Pour les installations TEM à entrée latérale, fixer le réseau à un support TEM commercial à entrée latérale. Ces supports ont un récipient de préparation d’échantillon rempli d’azote liquide pour permettre le transfert de la grille au support sans réchauffer l’échantillon. Le porte-entrée latérale est inséré dans le TEM directement avec l’échantillon fixé à l’extrémité.
7. Collecte de données MicroED
- Localisation et criblage des nanocristaux
- Ouvrez les vannes de colonne TEM. Ajustez le grossissement à l’aide des panneaux manuels au grossissement le plus bas possible. Trouvez le faisceau en ajustant le bouton d’intensité sur les panneaux de main de manière à ce qu’une zone ronde et lumineuse soit visible sur l’écran fluorescent.
- Prenez un atlas toutes grilles à faible grossissement (50 - 300x) à l’aide du logiciel approprié14,15,16 (Figure 2). Assurez-vous que le microscope est bien aligné pour l’imagerie à faible et à fort grossissement avant de collecter des données MicroED haute résolution.
- Identifiez les carrés de grille sans carbone cassé et ayez un matériau/des grains noirs ou foncés visibles sur le film (Figure 2). Naviguez autour de la grille, soit physiquement à l’aide du joystick sur les panneaux de main, soit virtuellement sur l’Atlas collecté, afin de rechercher des carrés de grille qui ne sont pas cassés et contiennent des microcristaux.
- Ajoutez le centre de chacun de ces carrés à une liste d’emplacements de grille à examiner. Ces emplacements peuvent être ajoutés à un ordinateur portable, dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel d’automatisation du microscope.
- Augmentez le grossissement à 500-1 300x et ajustez la hauteur eucentrique à chaque emplacement de grille stocké et mettez à jour la valeur Z enregistrée aux positions indiquées dans 7.1.4.
- Recherchez sur l’écran fluorescent ou sur une caméra rapide à ce grossissement plus élevé les petites taches noires / grains sur la grille. Un bon échantillon avec souvent des arêtes vives à fort grossissement, suggérant un ordre cristallin.
- Déplacez un cristal de potentiel localisé vers le centre de l’écran et augmentez le grossissement de sorte que le TEM passe en mode de grossissement élevé.
REMARQUE: Ceci est appelé mode à grossissement élevé, Zoom2 ou SA sur différents instruments et correspond généralement à des grossissements de 3 000x ou plus. - Insérez une ouverture de zone sélectionnée. Modifiez l’ouverture pour une taille plus grande ou plus petite pour vous assurer que la zone sélectionnée est juste plus grande que le cristal (Figure 3).
- Passez en mode diffraction en appuyant sur le bouton de diffraction sur les panneaux manuels TEM, en vous assurant que l’écran fluorescent est inséré. Ajustez la longueur de la caméra à l’aide du bouton d’agrandissement de sorte que le bord ait une résolution d’au moins 1 Å.
REMARQUE : L’étalonnage des longueurs de diffraction doit être effectué par un technicien de service à l’aide d’un réseau de gaufres en or ou d’un échantillon connu avant de tenter des expériences MicroED. - Ajustez la mise au point de diffraction de manière à ce que la tache centrale soit aussi nette et petite que possible. À l’aide des boutons de changement de vitesse de diffraction, déplacez le faisceau central vers le centre de l’écran fluorescent
- Insérez la butée du faisceau et assurez-vous que le faisceau est derrière lui. Soulevez l’écran fluorescent. Prenez une courte exposition (environ 1 s) sur l’appareil photo (Figure 4).
- Inspectez le diagramme de diffraction correspondant. Un bon candidat pour la collecte d’un ensemble de données complet aura des points pointus qui sont régulièrement disposés en colonnes et en lignes, et la diffraction s’étendra au-delà de 2 Å, de préférence au moins à 1 Å (Figure 4). Enregistrez les coordonnées cristallines dans l’interface utilisateur TEM ou en les écrivant.
- Répéter le criblage par diffraction pour tous les cristaux potentiels d’intérêt sur le carré de la grille actuelle.
- Collecte de données
- Centrez un cristal grillagé sur l’écran à fort grossissement (> 1 000x). Ajustez la hauteur eucentrique du cristal à l’aide d’une routine automatique ou à la main.
- Insérez l’ouverture de zone sélectionnée qui correspond le mieux à la taille et à la forme du cristal, telles que déterminées au point 7.1.8 (figure 3). Inclinez la scène dans les directions négative et positive jusqu’à ce que l’image soit obstruée par les barres de grille (Figure 3). Notez ces angles à des fins de collecte de données.
- Déterminez le nombre d’images qui seront nécessaires pour couvrir le coin angulaire total du jeu de données. Il est typique d’utiliser des coins de 0,5 à 1,0° pour chaque image, les images étant lues toutes les 1 à 5 secondes en fonction de la sensibilité de la caméra. Par exemple, un coin s’étendant de -30° à +30°, tournant à une vitesse constante de 1° s-1 avec un cadre lu toutes les 1s, nécessiterait 60 images au total.
- Compte tenu de la plage d’inclinaison totale maximale de -72° à +72°, commencez à faire pivoter la scène à une vitesse constante de 1° s-1 , puis commencez à lire les données toutes les 1s sur un appareil photo moderne avec un mode de lecture à obturateur roulant (Movie 1). Ce processus peut être effectué manuellement ou à l’aide d’un logiciel spécifique à la GDT.
- Réglez la vitesse de rotation en spécifiant le % de la vitesse d’inclinaison maximale et quand s’arrêter dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel dédié. Dans cette étude, cela a été mesuré à 0,3 ° s-1 pour chaque % de vitesse maximale, mais devra être vérifié indépendamment pour chaque microscope.
REMARQUE: L’inclinaison et la collecte de données de caméra sont configurées indépendamment ici, mais les logiciels14 peuvent coordonner cela pour simplifier le processus. - Écarter environ 1° de chaque côté de la cale spécifiée dans la plupart des cas comme temps mort, lorsque l’étage monte en puissance ou ralentit jusqu’à la vitesse de rotation souhaitée.
- Réglez la vitesse de rotation en spécifiant le % de la vitesse d’inclinaison maximale et quand s’arrêter dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel dédié. Dans cette étude, cela a été mesuré à 0,3 ° s-1 pour chaque % de vitesse maximale, mais devra être vérifié indépendamment pour chaque microscope.
- Enregistrez les données dans une variété de formats sous forme d’images individuelles ou sous forme de pile d’images (film 1).
- Convertissez ces images de diffraction dans un format cristallographique typique à l’aide des outils MicroED - disponibles ici (https://cryoem.ucla.edu). Les images de diffraction enregistrées au format SMV sont facilement traitées à l’aide d’un logiciel cristallographique documenté17,18.
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Representative Results
MicroED est une méthode cryoEM qui exploite les interactions fortes entre les électrons et la matière, ce qui permet d’étudier des cristaux de plus en plus petits12,13. Après ces étapes, on s’attend à ce qu’un film de diffraction en format cristallographique prélevé sur des microcristaux (film 1). Ici, la technique est démontrée à l’aide de carbamazépine12. Les résultats montrent un ensemble de données MicroED à rotation continue à partir d’un microcristal de carbamazépine identifié sur une grille TEM (film 1). Un bon ensemble de données a des points forts et clairs qui ne sont pas maculés ou divisés, et n’a qu’un seul treillis sur chaque image qui peut facilement être suivi en parcourant le film19. Ces données sont facilement indexées, intégrées et mises à l’échelle à l’aide d’un logiciel standard de cristallographie aux rayons X4. Des taches fendues peuvent être vues à partir d’un cristal qui a été fissuré, et deux orientations du même cristal sont étroitement alignées, mais pas tout à fait coïncidentes19. Plusieurs réseaux peuvent également se produire, en particulier pour ces cristaux à petites molécules, où plusieurs monocristaux se sont collés ensemble dans un amas sur la grille. Un autre scénario courant se produit lorsque les cristaux ont été gelés de manière incorrecte ou traités trop durement lors de la fragmentation, et qu’aucune diffraction n’est observée9.
Après la collecte, l’intégration et la solution de structure des données, on s’attend à ce qu’une structure à haute résolution soit déterminée (Figure 5). L’obtention d’une solution de structure claire dépendra en fin de compte de la qualité et de l’exhaustivité des données.
Figure 1 : Préparation d’une grille TEM pré-écrêtée pour l’étude des petites molécules. (A) Un tube avec une petite portion d’échantillon pour l’investigation. (B) Échantillon écrasé entre deux lames de microscope. (C) Le côté carbone de la grille préclipsée, et (D) le côté cuivre de la grille préclipsée. E) Une grille TEM préclipsée après que la poudre broyée y a été lâchée. Barres d’échelle de 3 mm en (C), (D) et (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identification de cristaux de petites molécules dans le TEM. (A) Un atlas ou un montage à faible grossissement. (B) Une seule image à faible grossissement utilisée pour le dépistage. (C) Image à grossissement plus élevé utilisée pour identifier les grains plus petits. (D) Micrographie à fort grossissement d’un cristal à petite molécule aggloméré. Barre d’échelle 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Criblage et alignement des microcristaux pour la collecte de données MicroED. (A) Micrographie à fort grossissement d’un microcristal. (B) Micrographie du cristal isolé dans l’ouverture de la zone sélectionnée. (C) Le même microcristal dans l’ouverture avec la platine inclinée à -69°. Barres d’échelle toutes les 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Exemples de données MicroED. (A) données MicroED de haute qualité avec des points nets et nets adaptés à la détermination de structures à haute résolution. (B) Données MicroED faibles, maculées avec une mauvaise définition du réseau. Dans cet exemple, l’alignement est également désactivé, de sorte que la diffraction n’est apparente que sur un côté de l’image (C) Données MicroED médiocres montrant plusieurs réseaux et des taches fendues et / ou maculées. Encart de zone bleue amélioré en bas à droite montrant des taches maculées et fendues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Structure MicroED de la carbamazépine. Modèle atomique représenté sous forme de bâtons avec des atomes de carbone colorés en blanc, rouge oxygène et bleu azote. La carte 2Fo-F c est profilée au niveau 1,5 σ et colorée en bleu. La carte Fo-F c montrant les hydrogènes est profilée au niveau 3,0 σ et colorée en vert. Cette figure a été adaptée des cartes déposées de EMDB-928410. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film 1 : Ensemble de données MicroED à partir de carbamazépine. L’ensemble de données s’étend sur près de 90°, de -68° à +20°. Chaque diagramme de diffraction s’étend sur un coin de 0,5° dans l’espace réciproque et correspond à une exposition de 1s à un taux d’exposition de 0,01 e- Å-2 s-1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
La préparation des échantillons est généralement un processus itératif, où des optimisations sont effectuées après des séances de dépistage et de collecte de données. Pour les échantillons de petites molécules, il est souvent prudent de tenter d’abord la préparation de la grille sans décharge luminescente les grilles, car de nombreux produits pharmaceutiques ont tendance à être hydrophobes10,11. Si les grilles ont trop peu de dépôts nanocristallins, c’est une bonne idée de réessayer après la première décharge luminescente des grilles. Il se peut que les cristaux de poudres lyophilisées soient trop gros et épais pour recueillir de bonnes données. Dans ces cas, il peut être possible de collecter des données à partir d’un bord ou d’une partie plus mince d’un cristal plus grand. Si cela s’avère difficile, il peut être nécessaire de broyer la poudre à une consistance plus fine en utilisant une surface plus rugueuse, telle qu’un mortier et un pilon.
Les données MicroED sont généralement collectées avec le TEM fonctionnant en mode microsonde 4,20. Ici, la taille du faisceau TEM qui correspond à un taux d’exposition de 0,01 e- Å-2 s-1 est généralement d’environ 10 μm de diamètre, ce qui est beaucoup plus grand que les microcristaux typiques 1,21. Le signal est ensuite isolé des cristaux d’intérêt à l’aide d’une ouverture de zone sélectionnée (Figure 3)2,20. Différentes tailles d’ouverture permettent un ajustement rapide de la configuration à différentes tailles de cristaux. Alternativement, il est possible de collecter des données avec le TEM fonctionnant en mode nano-sonde. Cela réduit la taille du faisceau d’environ un facteur 5. Un faisceau plus petit correspond à un taux d’exposition proportionnellement plus élevé dans l’empreinte du faisceau. Étant donné que de nombreux MET sont deux systèmes de lentilles à condensateur, la condition parallèle dictera que le faisceau soit d’une taille unique en mode microsonde ou nanosonde. Atteindre un taux d’exposition de 0,01 e- Å-2 s-1 dans une nanosonde sans ajuster la lentille du pistolet est un défi. Le choix entre les deux appartient à l’utilisateur. Un avantage de la nanosonde est qu’il est moins nécessaire d’insérer et de rétracter l’ouverture de zone sélectionnée entre le criblage en mode d’imagerie et de diffraction. Cependant, avec les microscopes modernes, l’insertion et la rétraction de l’ouverture SA sont automatiques et précises. Microprobe offre une plus grande flexibilité dans l’isolement de la diffraction en ayant accès à plusieurs tailles d’ouvertures de zone sélectionnées. Le plus grand faisceau dans la microsonde peut également exposer des cristaux voisins, tandis que la nanosonde peut cibler plus précisément des cristaux individuels.
Le protocole présenté est l’approche standard de la collecte de données MicroED pour les petites molécules utilisées dans notre laboratoire10,11,12,13. De nombreuses adaptations et modifications pourraient être mises en œuvre. La meilleure approche pour créer des grilles à haute densité cristalline dépend le plus de la familiarité de l’utilisateur avec une approche donnée. Il existe de nombreux cas où les médicaments sont présents sous forme de gros cristaux trop fragiles pour se fragmenter physiquement sans perdre leur pouvoirdiffractaire 19. Dans ces cas, la méthode récemment adaptée de broyage par faisceau d’ions focalisé pour amincir les cristaux afin de les rendre plus accessibles à MicroED 6,7,8,9,22.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le laboratoire Gonen est soutenu par des fonds du Howard Hughes Medical Institute. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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