Summary
ここでは、微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子結晶粉末を調製するために私たちの研究室で開発された手順について説明します。
Abstract
微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子サンプルを調製するための詳細なプロトコルについて説明します。MicroEDは、標準的なクライオ電子顕微鏡(クライオEM)装置を用いてタンパク質や低分子の構造を解明するために開発されました。このようにして、低分子、ペプチド、可溶性タンパク質、および膜タンパク質が最近高解像度に決定されている。例として薬物カルバマゼピンを使用して低分子医薬品のグリッドを調製するためのプロトコルがここに提示される。データのスクリーニングと収集のためのプロトコルが提示されます。データ統合、構造決定、改良など、プロセス全体の追加ステップは、他の場所で紹介されています。低分子グリッドの調製に要する時間は30分未満と推定される。
Introduction
微結晶電子回折(MicroED)は、サブマイクロメートルサイズの結晶から原子分解能構造を決定するためのクライオ電子顕微鏡(クライオEM)法です1,2。結晶は標準的な透過型電子顕微鏡(TEM)グリッドに適用され、液体エタンまたは液体窒素に突入することによって凍結されます。次に、グリッドは極低温で動作するTEMにロードされます。結晶はグリッド上に配置され、初期回折品質についてスクリーニングされます。連続回転マイクロEDデータは、スクリーニングされた結晶のサブセットから収集され、そこでデータは高速カメラを使用してムービー3として保存されます。これらの動画は、標準的な結晶学フォーマットに変換され、X線結晶学実験4とほぼ同じように処理されます。
MicroEDはもともとタンパク質の微結晶を調べるために開発されました1,2。タンパク質結晶構造解析のボトルネックは、従来のシンクロトロンX線回折実験のために大きく整然とした結晶を成長させることです。電子はX線よりも桁違いに強い物質と相互作用するため、検出可能な回折を生成するために必要な結晶サイズの限界はかなり小さくなります5。さらに、弾性散乱イベントと非弾性散乱イベントの比率は電子にとってより有利であり、より小さな全体的な曝露でより有用なデータを収集できることを示唆しています5。絶え間ない開発により、最も困難な微結晶からMicroEDデータを収集できるようになりました6、7、8、9。
最近、MicroEDは、明らかに非晶質材料から低分子医薬品の構造を決定するための強力なツールであることが示されている10、11、12、13。これらの粉末は、購入した試薬のボトル、精製カラムから直接、または錠剤を微粉末に粉砕することからでも得る10。これらの粉末は、目で見るとアモルファスに見えるが、完全にナノ結晶で構成されているか、または単により大きな非結晶性のアモルファス画分に微量のナノ結晶堆積物を含むことができる。グリッドへの材料の塗布は容易であり、結晶の同定、スクリーニング、およびデータ収集の後続のステップは、近い将来自動化される可能性さえあります14。他の人はサンプル調製とデータ収集に異なる方法を使用するかもしれませんが、ここでは、MicroED用の低分子のサンプルを調製し、データ収集するためにGonenラボで開発および使用されているプロトコルが詳しく説明されています。
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Protocol
1. 低分子サンプルの調製
- 少量(0.01〜1 mg)の粉末、液体、または固体を小さなバイアルまたはチューブに移します。
- すでに粉末状のサンプルの場合は、サンプルが必要になるまでキャップを使用してチューブを密封します。方法1(ステップ3)または2(ステップ4)を試す前に、液体サンプルを粉末に乾燥させます。
注:液体に溶解したサンプルは、以下の方法3(5.X)を使用できます
2. TEMグリッドの準備
注:オートローダーシステムを備えた一部のTEMでは、TEMカラムにロードする前に、グリッドをクリップしてカセットに配置する必要があります。クリッピングでは、3 mm TEM グリッドを、オートローダが操作できる金属リングに物理的に固定します。このステップと後続のステップは、通常のTEMグリッド、またはクリップされたTEMグリッドのいずれかを使用して実行できます。これらの実験では、グリッドが事前にクリップされている方が簡単なことがよくあります。
- スライドガラスカバーの一方の端にプラスチックフィルムを巻き付けます。
- TEMグリッドをカバースライド上部のフィルムに置き、カーボン側を上に向けて配置します。ライトの下のグリッドの両側を特定します。銅側は輝いて金属的に見えますが、炭素側はくすんだ茶色に見えます(図1C、D)。クリップされたグリッドの場合、カーボン側はクリップリングの平らな面に面している必要があります。
- グリッド付きのスライドをグロー放電チャンバーに配置します。15pAの負の設定を使用して、カバーサイドを約30秒間グロー放電します。グリッドにサンプルを追加する前に、ろ紙で裏打ちされたガラスペトリ皿の内側のカバースライドにグリッドを保管します。
3.均質な微粉末を作成してサンプルをグリッドに適用する(方法1)
- ピンセットを使用して、覆われたペトリ皿からグロー放電TEMグリッドを取り外します。カーボン面を上に向けて、グリッドを円形のろ紙に置きます。
- 小さなへらを使用して、非常に小さな粉末スクープ(約0.1 mg)を取り除き、ろ紙のTEMグリッドのすぐ隣にある小さな正方形のガラスカバーガラスの上に置きます。パウダーの上に別の小さな正方形のスライドガラススライドまたはカバーガラスを置きます。
- 指で、2つのスライドガラスをそっとこすり合わせて微粉末を作ります。
- カバーガラスを傾けてろ紙のTEMグリッドのすぐ上に配置し、グロー放電TEMグリッドのわずか数cm上でカバーガラスをこすり合わせ続けます(図1)。
- 粉末がグリッドに向かって落下しているかどうかを確認します。2つのガラスカバーガラスの1つを取り除いて、細かく粉砕された粉末のカバーを外します。フィルター紙を使用してカバーガラスから微粉末をTEMグリッドにそっと払い落とします(図1)。
4.「シェイク」法を適用してグリッドにサンプルを適用する(方法2)
- ピンセットを使用してグリッドをつかみ、粉末サンプルのバイアルまたはチューブにドロップします。プラスチックキャップを使用してバイアルを閉じ、振ったときに材料が逃げないようにします。
- バイアルを手に取り、粉末とグリッドの両方が約10〜30秒間動くようにバイアルを振る。
- バイアルの内容物を円形のろ紙に空にします。グリッドの端をつかみ、ろ紙のグリッドの端を軽くたたいて、グリッドから余分な材料を取り除きます。
注:バイアルの種類とサイズによっては、ピンセットを使用して内容物を空にせずにTEMグリッドを取り外すこともできます。
5.蒸発法によるグリッドへのサンプルの適用(方法3)
- カーボン面を上向き、銅面を下に向けて円形のろ紙の中央にグリッド(クリップされているかどうか)を配置します。
- 10 μLの気密シリンジを使用して、溶解した化合物の小滴(約1〜3 μL)をグリッドのカーボン側に塗布します。
- グリッド付きのろ紙を真空乾燥チャンバーにそっと移動します。チャンバーを覆い、真空をオンにします。グリッドを真空下に置いて、最大1日間乾燥させます。
- 真空をオフにし、チャンバーを5分間通気させます。チャンバーを通気することで、覆われていないときにグリッドが移動したり飛んだりするのを防ぐことができます。
6. TEMへのグリッドの凍結とロード
- ピンセットのセットを使用してTEMグリッドの端をつかみ、先端がグリッドの正方形に穴を開けないようにします。グリッドをろ紙から1〜2 cm上に持ち上げ、グリッドを下の紙に対して90°傾けます。グリッドをしっかりとピンセットしたままピンセットを軽くたたいて、緩い粉を取り除きます。
- ピンセットの先端をグリッドで液体窒素容器に直接手で移動して、グリッドを凍結します。この容器は、典型的には、TEMのためのグリッドローディングステーションであるが、液体窒素安全魔法瓶などの任意の安全な容器であり得るが、移送または貯蔵のために許容される。液体窒素は-196°Cである。
- グリッドとピンセットの沸騰が止まるまで待ってから、さらに操作してください。
- 液体窒素下または窒素蒸気中で、カーボン支持フィルムの前にサンプルがビームに当たるように、カーボン側を向けたサンプルホルダーにグリッドを配置します。
- サンプルホルダーをTEMにロードし、グリッドが常に液体窒素温度に保たれるようにします。
- オートローダーシステムの場合は、クリップされたグリッドを液体窒素冷却容器のカセットに配置します。このカセットは、オートローダーロボットがオートローダーとカラムの間を往復するためにサンプルを安全に保ちながらカセットを受け入れることを可能にするよりも、往復コンテナに転送されます。
- サイドエントリーTEMセットアップの場合は、グリッドを市販のサイドエントリーTEMホルダーに固定します。これらのホルダーには、液体窒素で満たされたサンプル調製容器があり、サンプルを温めることなくグリッドをホルダーに移動できます。サイドエントリーホルダーはTEMに直接挿入され、サンプルは最後に固定されます。
7. マイクロEDデータの収集
- ナノ結晶の探索とスクリーニング
- TEMカラムバルブを開きます。ハンドパネルを使用して倍率を可能な限り低い倍率に調整します。ハンドパネルの強度ノブを調整して、蛍光スクリーンに丸い明るい領域が表示されるようにして、ビームを見つけます。
- 適切なソフトウェア14、15、16を使用して、低倍率(50〜300倍)で全グリッドアトラスを取得します(図2)。高解像度のMicroEDデータを収集する前に、顕微鏡が低倍率と高倍率の両方のイメージングに対して適切に位置合わせされていることを確認してください。
- カーボンが壊れていないグリッドの正方形を特定し、フィルム上に黒または暗い材料/粒子が見えるようにします(図2)。ハンドパネルのジョイスティックを使用して物理的に、または収集されたアトラスを仮想的に使用してグリッド内をナビゲートし、壊れておらず、微結晶を含むグリッドの正方形を検索します。
- これらの各四角形の中心を、調査用のグリッド位置のリストに追加します。これらの場所は、ノートブック、顕微鏡ユーザーインターフェイス、または顕微鏡自動化ソフトウェアに追加できます。
- 倍率を500〜1,300倍に増やし、保存されている各グリッド位置のユーセントリック高さを調整し、保存したZ値を7.1.4に記載されている位置に更新します。
- 蛍光スクリーンまたは高速カメラで、グリッド上の小さな黒い斑点/粒子をこの高い倍率で検索します。良好なサンプルは、高倍率で鋭いエッジを持つことが多く、結晶秩序を示唆しています。
- 位置したポテンシャル結晶を画面の中央に移動し、TEMが高倍率モードに入るように倍率を上げます。
注意: これは、さまざまな機器では高倍率、Zoom2、またはSAモードと呼ばれ、通常は3,000倍以上の倍率に対応します。 - 選択した領域の絞りを挿入します。絞りを大きいサイズまたは小さいサイズに変更して、選択した領域が水晶振動子よりも大きくなるようにします(図3)。
- TEMハンドパネルの回折ボタンを押して回折モードに切り替え、蛍光スクリーンが挿入されていることを確認します。拡大ノブを使用して、エッジが少なくとも1 Åの解像度になるようにカメラの長さを調整します。
注意: 回折長のキャリブレーションは、MicroED実験を試みる前に、金ワッフル格子または既知の試料を使用してサービスエンジニアが実行する必要があります。 - 中心スポットができるだけシャープで小さくなるように回折焦点を調整します。回折シフトノブを使用して、中央ビームを蛍光スクリーンの中央に移動します
- ビームストップを挿入し、ビームがその後ろにあることを確認します。蛍光スクリーンを持ち上げます。カメラで短時間(約1秒)の露出を取ります(図4)。
- 対応する回折パターンを調べます。完全なデータセットを収集するのに適した候補は、列と行に規則的に配置された鋭いスポットを持ち、回折は2 Åを超える、できれば少なくとも1 Åまでの範囲になります(図4)。結晶座標をTEMユーザーインターフェイスに保存するか、書き留めて保存します。
- 現在のグリッド正方形上の関心のあるすべての潜在的な結晶に対して回折スクリーニングを繰り返します。
- データ収集
- スクリーンされたクリスタルを高倍率(>1,000倍)で画面の中央に配置します。クリスタルのユーセントリック高さは、自動ルーチンまたは手作業を使用して調整します。
- 7.1.8で決定した水晶のサイズと形状に最適な領域開口部を挿入します(図3)。画像がグリッドバーで遮られるまで、ステージを負方向と正方向に傾けます(図3)。データ収集のために、これらの角度に注意してください。
- データセットの角度ウェッジ全体にまたがるために必要なフレーム数を決定します。フレームごとに0.5〜1.0°のウェッジを使用するのが一般的で、カメラの感度に応じて1〜5秒ごとにフレームが読み取られます。たとえば、-30°から+30°に及ぶウェッジが1°s-1 の一定の速度で回転し、1秒ごとにフレームが読み出されると、合計60フレームが必要になります。
- -72°から+72°の最大総傾斜範囲を考慮して、ステージを1°s-1 の一定の速度で回転させ始め、ローリングシャッター読み出しモードを備えた最新のカメラで1秒ごとにデータの読み取りを開始します(動画1)。このプロセスは、手動で、またはTEM固有のソフトウェアを使用して実行できます。
- 最大チルト速度の%と停止するタイミングを顕微鏡のユーザーインターフェースまたは専用ソフトウェアで指定して回転速度を設定します。この調査では、これは最高速度の%ごとに0.3°s-1 と測定されましたが、顕微鏡ごとに個別に検証する必要があります。
注:傾きおよびカメラデータ収集は、ここでは独立して設定されるが、ソフトウェアプログラム14 は、プロセスを簡素化するためにこれを調整することができる。 - ほとんどの場合、指定されたウェッジの両側で約1°をデッドタイムとして破棄し、ステージが目的の回転速度まで上昇または減速します。
- 最大チルト速度の%と停止するタイミングを顕微鏡のユーザーインターフェースまたは専用ソフトウェアで指定して回転速度を設定します。この調査では、これは最高速度の%ごとに0.3°s-1 と測定されましたが、顕微鏡ごとに個別に検証する必要があります。
- データをさまざまな形式で、個々のフレームまたは画像のスタックとして保存します(ムービー1)。
- これらの回折フレームを、MicroEDツールを使用して一般的な結晶学的形式に変換します-ここで入手できます(https://cryoem.ucla.edu)。SMVフォーマットで保存された回折画像は、文書化された結晶学ソフトウェア17,18を用いて容易に処理される。
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Representative Results
MicroEDは、電子と物質の間の強い相互作用を利用するクライオ電子顕微鏡法であり、消えるほど小さな結晶の研究を可能にします12,13。これらの工程の後、微結晶から収集された結晶学的形式の回折ムービーを有することが期待される(Movie 1)。ここでは、カルバマゼピン12を用いてこの手法を実証する。結果は、TEMグリッド上で同定されたカルバマゼピン微結晶からの連続回転MicroEDデータセットを示しています(動画1)。優れたデータセットは、汚れたり分割されたりしない強力で明確なスポットを持ち、各フレームに1つの格子しかなく、ムービー19をステップスルーすることで簡単に追跡できます。これらのデータは、標準のX線結晶構造解析ソフトウェア4を使用して簡単にインデックス化、統合、およびスケーリングできます。割れた結晶から割れたスポットが見られ、同じ結晶の2つの方位が密接に整列していますが、完全には一致していません19。複数の格子も発生する可能性があり、特にこれらの低分子結晶では、複数の単結晶がグリッド上の塊でくっついています。別の一般的なシナリオは、結晶が誤って凍結されたり、フラグメンテーション中に厳しすぎる処理が行われ、回折が観察されない場合に発生します9。
データ収集、統合、および構造ソリューションの後、高解像度の構造が決定されることが期待されます(図5)。明確な構造ソリューションの取得は、最終的にはデータの品質と完全性に依存します。
図1:低分子調査用のプレクリップTEMグリッドの準備 。 (A)調査用のサンプルのごく一部が入ったチューブ。(B)2つの顕微鏡スライドの間でサンプルを粉砕します。(C)プレクリップされたグリッドのカーボン側、および(D)プレクリップされたグリッドの銅側。(E)粉砕された粉末がその上に落とされた後の事前にクリップされたTEMグリッド。スケールバーは、(C)、(D)、および(E)で3mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TEMにおける低分子結晶の同定 。 (A)低倍率での全格子アトラスまたはモンタージュ。(B)スクリーニングに使用される単一の低倍率画像。(C)より小さな粒子を識別するために使用される高倍率の画像。(d)凝集した低分子結晶の高倍率顕微鏡写真。スケールバーは、(A)で750μm、(B)で50μm、(C)で10μm、(D)で1μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MicroEDデータ収集のための微結晶のスクリーニングと整列 。 (a)微結晶の高倍率顕微鏡写真。(B)選択された領域開口部内の孤立した結晶の顕微鏡写真。(C)ステージを-69°に傾けたアパーチャ内の同じ微結晶。スケールバーはすべて1μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロEDデータの例 。 (A)高解像度の構造決定に適した、明確で鋭いスポットを備えた高品質のMicroEDデータ。(B)格子の定義が不十分な、弱く、汚れたMicroEDデータ。この例では、アライメントもオフになっているため、回折は画像の片側でのみ明らかです(C)複数の格子と分割および/または汚れたスポットを示す貧弱なMicroEDデータ。右下に強調された青い領域の挿入図は、汚れた分割されたスポットを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:カルバマゼピンのマイクロED構造。原子モデルは、炭素原子が白、酸素赤、窒素青に着色された棒として示されています。2Fo-F cマップは、1.5 σレベルで輪郭が描かれ、青色に着色されています。水素を示すFo-Fcマップは、3.0 σレベルで輪郭が描かれ、緑色に着色されています。この図は、EMDB-928410の寄託された地図から適応されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:カルバマゼピンからのマイクロEDデータセット。データセットは、-68°から+20°まで、ほぼ90°に及びます。各回折パターンは、逆数空間で0.5°のくさびにまたがり、0.01 e-Å-2 s-1の露光速度で1秒の露光に対応します。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
サンプル調製は通常反復的なプロセスであり、スクリーニングとデータ収集のセッションの後に最適化が行われます。低分子サンプルの場合、多くの医薬品は疎水性である傾向があるため、グリッドをグロー放電せずに最初にグリッド調製を試みることが賢明であることがよくあります10,11。グリッドのナノ結晶堆積物が少なすぎる場合は、最初にグリッドをグロー放電した後に再試行することをお勧めします。凍結乾燥粉末からの結晶が大きすぎて厚すぎて、良好なデータを収集できない場合があります。このような場合、より大きな結晶の端または薄い部分からデータを収集できる場合があります。これが難しい場合は、乳鉢や乳棒などの粗い表面を使用して、粉末をより細かい粘稠度に粉砕する必要があるかもしれません。
マイクロEDデータは、典型的には、マイクロプローブモード4、20で動作するTEMを用いて収集される。ここで、0.01e−Å−2s−1の露光速度に対応するTEMビームのサイズは、典型的には直径約10μmであり、これは典型的な微結晶1,21よりもはるかに大きい。次に、選択した領域開口部を使用して、目的の結晶から信号を分離します(図3)2,20。さまざまな開口部サイズにより、さまざまなサイズの結晶に合わせてセットアップをすばやく調整できます。あるいは、ナノプローブモードで動作するTEMでデータを収集することもできます。これにより、ビームのサイズが約5倍に縮小されます。ビームが小さいほど、ビームフットプリントの露出率が比例して高くなります。多くのTEMは2つのコンデンサーレンズシステムであるため、並列条件により、ビームはマイクロプローブモードまたはナノプローブモードのいずれかで単一のサイズになります。ガンレンズを調整せずにナノプローブで0.01 e-Å-2 s-1の露光率に到達することは困難です。2 つの間の選択はユーザー次第です。ナノプローブの利点は、イメージングおよび回折動作モードにおけるスクリーニングの間に選択された領域開口部を挿入および収縮させる必要性が少ないことである。しかし、最新の顕微鏡では、SA絞りの挿入と収縮は自動的かつ正確です。マイクロプローブは、選択した領域アパーチャの複数のサイズにアクセスできるため、回折の分離においてより大きな柔軟性を提供します。マイクロプローブのより大きなビームは近くの結晶も露出する可能性がありますが、ナノプローブはより正確に個々の結晶をターゲットにすることができます。
提示されたプロトコルは、私たちの研究室で使用される低分子のMicroEDデータ収集への標準的なアプローチです10,11,12,13。実装できる多くの適応と変更があります。高い結晶密度のグリッドを作成するための最良のアプローチは、特定のアプローチに対するユーザーの習熟度に最も依存します。薬物は、回折力を失うことなく物理的に断片化するには壊れやすい大きな結晶として存在する多くのケースがあります19。このような場合、最近採用された集束イオンビームミリングの方法で結晶を薄くし、MicroED 6,7,8,9,22にアクセスしやすくします。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
ゴネンラボは、ハワードヒューズ医学研究所からの資金によってサポートされています。この研究は、国立衛生研究所P41GM136508によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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