Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул

Published: March 15, 2021 doi: 10.3791/62313
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

Summary

Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).

Abstract

Описан подробный протокол подготовки образцов малых молекул для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED). MicroED был разработан для решения структур белков и малых молекул с использованием стандартного оборудования электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, небольшие молекулы, пептиды, растворимые белки и мембранные белки недавно были определены с высоким разрешением. Представлены протоколы подготовки сеток низкомолекулярных лекарственных препаратов на примере препарата карбамазепин. Представлены протоколы скрининга и сбора данных. Дополнительные этапы общего процесса, такие как интеграция данных, определение структуры и уточнение, представлены в другом разделе. Время, необходимое для подготовки низкомолекулярных сеток, оценивается менее чем в 30 минут.

Introduction

Микрокристаллическая дифракция электронов (MicroED) - это метод электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) для определения структур атомного разрешения из кристаллов субмикрометрового размера 1,2. Кристаллы наносятся на сетки стандартного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и замораживаются путем погружения в жидкий этан или жидкий азот. Затем решетки загружаются в ПЭМ, работающую при криогенных температурах. Кристаллы располагаются на сетке и экранируются на начальное дифракционное качество. Данные MicroED непрерывного вращения собираются из подмножества экранированных кристаллов, где данные сохраняются с помощью быстрой камеры в виде видеоролика3. Эти фильмы преобразуются в стандартный кристаллографический формат и обрабатываются почти так же, как эксперимент по рентгеновской кристаллографии4.

MicroED был первоначально разработан для исследования белковых микрокристаллов 1,2. Узким местом в кристаллографии белков является выращивание больших, хорошо упорядоченных кристаллов для традиционных экспериментов по синхротронной рентгеновской дифракции. Поскольку электроны взаимодействуют с веществом на порядки сильнее, чем рентгеновские лучи, ограничения размера кристалла, необходимого для получения обнаруживаемой дифракции, значительно меньше5. Кроме того, соотношение событий упругого и неупругого рассеяния более благоприятно для электронов, что позволяет предположить, что при меньшем общем воздействии можно собрать больше полезных данных5. Постоянные разработки позволили собирать данные MicroED из самых сложных микрокристаллов 6,7,8,9.

Недавно было показано, что MicroED является мощным инструментом для определения структур низкомолекулярных фармацевтических препаратов из явно аморфных материалов10,11,12,13. Эти порошки могут поступать прямо из бутылки с покупным реагентом, очистительной колонки или даже из измельчения таблетки в мелкий порошок10. Эти порошки кажутся аморфными на глаз, но могут либо полностью состоять из нанокристаллов, либо просто содержать следовые количества нанокристаллических отложений в большей некристаллической, аморфной фракции. Нанесение материала на сетку является простым, и последующие этапы идентификации кристаллов, скрининга и сбора данных могут быть даже автоматизированы в ближайшем будущем14. В то время как другие могут использовать другие методы для подготовки образцов и сбора данных, здесь подробно описаны протоколы, разработанные и используемые в лаборатории Гонена для подготовки образцов малых молекул для MicroED и для сбора данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образцов малых молекул

  1. Переведите небольшое количество (0,01 - 1 мг) порошка, жидкости или твердых веществ в небольшой флакон или пробирку.
  2. Для образцов, уже находящихся в виде порошка, запечатайте пробирку с помощью колпачка до тех пор, пока образец не понадобится. Высушите жидкие образцы в порошки перед попытками метода 1 (шаг 3) или 2 (шаг 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, растворенных в жидкости, можно использовать метод 3 (5.X), приведенный ниже

2. Подготовка сеток ТЕА

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ТЕА с системами автоматического заряжания требуют, чтобы решетки обрезались и помещались в кассету перед загрузкой в колонну ТЕА. Клиппинг включает в себя физическое закрепление 3-миллиметровой сетки TEM в металлическом кольце, которым может манипулировать автозагрузчик. Этот шаг и последующие шаги могут быть выполнены либо с использованием обычных сеток ТЕА, либо с использованием обрезанных сеток ТЕА. Для этих экспериментов часто легче манипулировать сетками, если они были обрезаны заранее.

  1. Оберните полиэтиленовую пленку вокруг одного конца предметного стекла.
  2. Поместите сетки ПЭМ на пленку в верхней части предметного стекла крышки карбоновой стороной вверх. Определите две стороны сетки под светом. Медная сторона блестит и кажется металлической, тогда как карбоновая сторона имеет тусклый коричневый цвет (рис. 1C, D). Для обрезанных сеток карбоновая сторона должна быть обращена к плоской поверхности зажимного кольца.
  3. Поместите предметное стекло с решетками в камеру тлеющего разряда. Тлеющий разряд крышки в течение примерно 30 с, используя отрицательную настройку при 15 пА. Храните решетки на предметном стекле внутри стеклянной чашки Петри, выстланной фильтровальной бумагой, прежде чем добавлять образец в сетки.

3. Нанесение образца на сетки путем создания однородного мелкодисперсного порошка (метод 1)

  1. Удалите с помощью пинцета тлеющую разряженную ПЭМ-сетку с закрытой чашки Петри. Поместите сетку на круглую фильтровальную бумагу карбоновой стороной вверх.
  2. Используя небольшой шпатель, удалите очень маленькую мерную ложку порошка (примерно 0,1 мг) и поместите ее на маленькое квадратное стеклянное стекло рядом с сеткой TEM на фильтровальной бумаге. Положите еще одно небольшое квадратное предметное стекло или покровное стекло поверх порошка.
  3. Пальцами аккуратно потрите два предметных стекла друг о друга, чтобы получился мелкий порошок.
  4. Наклоните покровные стекла и расположите их чуть выше сетки ПЭМ на фильтровальной бумаге и продолжайте тереть покровные стекла друг о друга, всего на несколько см выше тлеющей разряженной сетки ПЭМ (рис. 1).
  5. Наблюдайте, падает ли порошок на сетку. Раскройте мелко измельченный порошок, сняв одно из двух стеклянных покровных стекол. Аккуратно смахните мелкий порошок с покровного стекла с помощью кусочка фильтровальной бумаги на сетку ПЭМ (рис. 1).

4. Нанесение образца на сетки методом «встряхивания» (Метод 2)

  1. Возьмите сетку с помощью пинцета и бросьте ее во флакон или пробирку с образцом порошка. Закройте флакон пластиковым колпачком, чтобы при встряхивании материал не вытекал.
  2. Взяв флакон в руку, встряхните флакон так, чтобы порошок и сетка двигались примерно 10 - 30 с.
  3. Вылейте содержимое флакона на круглую фильтровальную бумагу. Взявшись за сетку за край, аккуратно постучите по краю сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить излишки материала с сетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа флакона и размера можно также использовать пинцет для удаления сетки ПЭМ без опорожнения содержимого.

5. Нанесение пробы на решетки методом выпаривания (Метод 3)

  1. Поместите сетку (обрезанную или нет) в центр круглого листа фильтровальной бумаги углеродной стороной вверх, а медной стороной вниз.
  2. Используя газонепроницаемый шприц объемом 10 мкл, нанесите небольшую каплю (примерно 1-3 мкл) растворенного соединения на углеродную сторону решетки.
  3. Аккуратно переместите фильтровальную бумагу с решетками в вакуумную камеру осушения. Накройте камеру крышкой и включите пылесос. Оставьте решетки под вакуумом для высыхания на срок до одного дня.
  4. Выключите вакуум и дайте камере выйти на вентиляцию в течение 5 минут. Вентиляция камеры предотвращает смещение или разлет решеток при ее открытии.

6. Замораживание и загрузка решеток в ТЭМ

  1. Возьмитесь за край сетки ТЕМ с помощью пинцета, убедившись, что кончики не проколют ни один из квадратов сетки. Поднимите сетку на 1-2 см над фильтровальной бумагой и наклоните сетку под углом 90° к бумаге внизу. Аккуратно постучите по пинцету, удерживая сетку плотно прижатым, чтобы удалить рассыпчатый порошок.
  2. Заморозьте сетку, переместив кончик пинцета с сеткой прямо в контейнер с жидким азотом вручную. Этот контейнер, как правило, является сетчатой загрузочной станцией для ТЕА, но может быть любым безопасным контейнером, таким как термос, безопасный для жидкого азота, приемлемый для транспортировки или хранения. Жидкий азот -196 °C.
  3. Дождитесь, пока сетка и пинцет перестанут кипеть, прежде чем приступать к дальнейшим манипуляциям.
  4. Под жидким азотом или в парах азота поместите решетку в держатель образца так, чтобы углеродная сторона была ориентирована таким образом, чтобы образец был поражен лучом перед углеродной опорной пленкой.
  5. Загрузите держатель образца в ПЭМ, убедившись, что решетка постоянно поддерживается при температуре жидкого азота.
    1. Для систем автозагрузчика поместите обрезанные решетки в кассету в контейнере с жидким азотом. Эта кассета переносится в челночный контейнер, что позволяет робототехнике автозагрузчика принимать кассету, сохраняя при этом образцы в безопасности для перемещения между автоматом загрузки и колонной.
    2. Для установок ТЕА с боковым входом прикрепите решетку к коммерческому держателю ТЕА с боковым входом. Эти держатели имеют контейнер для пробоподготовки, который заполнен жидким азотом, чтобы можно было перенести решетку на держатель без нагрева образца. Держатель бокового входа вставляется непосредственно в ТЕА, а образец закрепляется на конце.

7. Сбор данных MicroED

  1. Локализация и скрининг нанокристаллов
    1. Откройте клапаны колонны ТЭМ. Отрегулируйте увеличение с помощью ручных панелей на минимально возможное увеличение. Найдите луч, отрегулировав ручку интенсивности на ручных панелях таким образом, чтобы на флуоресцентном экране была видна круглая яркая область.
    2. Возьмите атлас с полной сеткой с малым увеличением (50 - 300x), используя соответствующее программное обеспечение14,15,16 (рис. 2). Перед сбором данных MicroED с высоким разрешением убедитесь, что микроскоп хорошо выровнен для получения изображений как с малым, так и с большим увеличением.
    3. Определите квадраты сетки без разрушенного углерода и с видимым черным или темным материалом / зернами на пленке (рис. 2). Перемещайтесь по сетке, либо физически с помощью джойстика на ручных панелях, либо виртуально по собранному Атласу, чтобы искать квадраты сетки, которые не разбиты и содержат микрокристаллы.
    4. Добавьте центр каждого из этих квадратов в список расположений сетки для исследования. Эти местоположения могут быть добавлены в ноутбук, в пользовательский интерфейс микроскопа или в программное обеспечение для автоматизации микроскопа.
    5. Увеличьте увеличение до 500-1,300x и отрегулируйте эуцентрическую высоту в каждом месте сохраненной сетки и обновите сохраненное значение Z до позиций, указанных в 7.1.4.
    6. Ищите на флуоресцентном экране или на быстрой камере с этим большим увеличением небольшие черные пятна/зерна на сетке. Хороший образец часто имеет острые края при большом увеличении, что предполагает кристаллический порядок.
    7. Переместите расположенный потенциальный кристалл в центр экрана и увеличьте увеличение таким образом, чтобы ПЭМ перешел в режим большого увеличения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это называется режимом с большим увеличением, Zoom2 или SA на разных инструментах и обычно соответствует увеличению 3,000x или выше.
    8. Вставьте выбранную область апертуры. Измените апертуру на больший или меньший размер, чтобы убедиться, что выбранная область просто больше, чем кристалл (рис. 3).
    9. Переключитесь в режим дифракции, нажав кнопку дифракции на ручных панелях ПЭМ, убедившись, что флуоресцентный экран вставлен. Отрегулируйте длину камеры с помощью ручки увеличения таким образом, чтобы разрешение края было не менее 1 Å.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка дифракционных длин должна выполняться сервисным инженером с использованием золотой вафельной решетки или известного образца перед попыткой экспериментов MicroED.
    10. Отрегулируйте дифракционный фокус таким образом, чтобы центральное пятно было как можно более резким и маленьким. С помощью ручек дифракционного сдвига переместите центральный луч в центр флуоресцентного экрана
    11. Вставьте упор балки и убедитесь, что балка находится за ней. Поднимите флуоресцентный экран. Сделайте короткую (примерно 1 с) экспозицию на камере (рис. 4).
    12. Проверьте соответствующую дифракционную картину. Хороший кандидат для сбора полного набора данных будет иметь острые пятна, которые регулярно располагаются в столбцах и строках, и дифракция будет простираться за пределы 2 Å, предпочтительно, по крайней мере, до 1 Å (рис. 4). Сохраните координаты кристалла либо в пользовательском интерфейсе TEM, либо записав их.
    13. Повторите дифракционный скрининг для всех интересующих потенциальных кристаллов на текущем квадрате сетки.
  2. Сбор данных
    1. Центрируйте экранированный кристалл на экране с большим увеличением (> 1,000x). Отрегулируйте эуцентрическую высоту кристалла с помощью автоматической процедуры или вручную.
    2. Вставьте выбранную область апертуры, которая наилучшим образом соответствует размеру и форме кристалла, как определено в 7.1.8 (рис. 3). Наклоняйте сцену в отрицательном и положительном направлениях до тех пор, пока изображение не будет закрыто полосами сетки (рис. 3). Обратите внимание на эти углы для сбора данных.
    3. Определите количество кадров, которое потребуется для охвата общего углового клина набора данных. Обычно для каждого кадра используются клинья под углом 0,5 - 1,0°, при этом кадры считываются каждые 1-5 секунд в зависимости от чувствительности камеры. Например, клин в диапазоне от -30° до +30°, вращающийся с постоянной скоростью 1° с-1 с кадром, считываемым каждые 1 с, потребует 60 кадров.
    4. Учитывая максимальный суммарный диапазон наклона от -72° до +72°, начните вращать столик с постоянной скоростью 1° с-1 , а затем начните считывать данные каждые 1 с на современной камере с режимом считывания со скользящим затвором (Видео 1). Этот процесс может быть выполнен вручную или с помощью специального программного обеспечения TEM.
      1. Установите скорость вращения, указав % максимальной скорости наклона и время остановки в пользовательском интерфейсе микроскопа или в специальном программном обеспечении. В этом исследовании было измерено, что это составляет 0,3 ° с-1 на каждый процент максимальной скорости, но необходимо будет провести независимую проверку для каждого микроскопа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон и сбор данных камеры здесь настраиваются независимо друг от друга, но программы14 могут координировать это для упрощения процесса.
      2. Отбрасывайте примерно по 1° с каждой стороны указанного клина в большинстве случаев как мертвое время, когда ступень либо увеличивается, либо замедляется до желаемой скорости вращения.
    5. Сохраняйте данные в различных форматах как в виде отдельных кадров, так и в виде стопки изображений (Фильм 1).
    6. Преобразуйте эти дифракционные кадры в типичный кристаллографический формат с помощью инструментов MicroED, доступных здесь (https://cryoem.ucla.edu). Дифракционные изображения, сохраненные в формате SMV, легко обрабатываются с использованием документированного кристаллографического программного обеспечения17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MicroED - это метод криоЭМ, который использует сильные взаимодействия между электронами и веществом, что позволяет исследовать исчезающе малые кристаллы12,13. Ожидается, что после этих этапов будет получен дифракционный фильм в кристаллографическом формате, собранный из микрокристаллов (ролик 1). Здесь методика демонстрируется с использованием карбамазепина12. Результаты показывают набор данных MicroED непрерывного вращения из микрокристалла карбамазепина, идентифицированного на сетке ПЭМ (ролик 1). Хороший набор данных имеет сильные, четкие пятна, которые не размазываются и не расщепляются, и имеет только одну решетку на каждом кадре, за которой можно легко проследить, пройдя через фильм19. Эти данные легко индексируются, интегрируются и масштабируются с помощью стандартного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии4. Расколотые пятна можно увидеть на кристалле, который был треснул, и две ориентации одного и того же кристалла тесно выровнены, но не совсем совпадают19. Также могут возникать множественные решетки, особенно для этих низкомолекулярных кристаллов, где несколько монокристаллов слиплись в комок на сетке. Другой распространенный сценарий возникает, когда кристаллы были заморожены неправильно или обработаны слишком жестко во время фрагментации, и дифракция не наблюдается9.

Ожидается, что после сбора данных, интеграции и структурного решения будет определена структура с высоким разрешением (рис. 5). Получение четкого структурного решения в конечном итоге будет зависеть от качества и полноты данных.

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка предварительно обрезанной сетки ПЭМ для исследования малых молекул . А) Пробирка с небольшой частью образца для исследования. (B) Измельченный образец между двумя предметными стеклами микроскопа. (C) углеродная сторона предварительно обрезанной сетки и (D) медная сторона предварительно обрезанной сетки. е) предварительно обрезанная сетка ТЕА после того, как на нее был нанесен измельченный порошок. Масштабные линейки 3 мм в (C), (D) и (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Идентификация низкомолекулярных кристаллов в ПЭМ . (A) Полностью сетчатый атлас или монтаж при малом увеличении. (B) Одно изображение с малым увеличением, используемое для скрининга. (C) Изображение с большим увеличением, используемое для идентификации более мелких зерен. (D) Микрофотография слипшегося низкомолекулярного кристалла с большим увеличением. Масштабная линейка 750 мкм в (A), 50 мкм в (B), 10 мкм в (C), 1 мкм в (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Скрининг и выравнивание микрокристаллов для сбора данных MicroED . (A) Микрофотография микрокристалла с большим увеличением. (B) Микрофотография изолированного кристалла в пределах выбранной области апертуры. (С) Тот же микрокристалл в апертуре с наклоненной до -69° ступенью. Масштабные линейки все 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Примеры данных MicroED. (A) высококачественные данные MicroED с четкими, четкими пятнами, подходящими для определения структуры с высоким разрешением. (B) Слабые, размазанные данные MicroED с плохим определением решетки. В этом примере выравнивание также отключено, поэтому дифракция очевидна только на одной стороне изображения (C) Плохие данные MicroED, показывающие множественные решетки и расщепленные и/или размазанные пятна. Вставка синей области, увеличенная в правом нижнем углу, показывает размазанные, разделенные пятна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Структура MicroED карбамазепина. Атомная модель показана в виде палочек с атомами углерода, окрашенными в белый цвет, красный кислород и синий азот. Карта 2Fo-F c очерчена на уровне 1,5 σ и окрашена в синий цвет. Карта Fo-F c , показывающая водород, очерчена на уровне 3,0 σ и окрашена в зеленый цвет. Этот рисунок был адаптирован из депонированных карт EMDB-928410. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1: Набор данных MicroED из карбамазепина. Набор данных охватывает почти 90°, от -68° до +20°. Каждая дифракционная картина охватывает клин 0,5° в обратном пространстве и соответствует экспозиции 1 с при скорости экспозиции 0,01 e-Å-2 с-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Пробоподготовка обычно представляет собой итеративный процесс, при котором оптимизация производится после сеансов скрининга и сбора данных. Для низкомолекулярных образцов часто целесообразно сначала попытаться получить решетку без тлеющей разрядки решеток, поскольку многие фармацевтические препараты имеют тенденцию быть гидрофобными10,11. Если в сетках слишком мало нанокристаллических отложений, рекомендуется повторить попытку после первого тлеющего разряда решеток. Может случиться так, что кристаллы из лиофилизированных порошков слишком большие и толстые, чтобы собрать хорошие данные. В этих случаях может быть возможно собрать данные с края или более тонкой части более крупного кристалла. Если это окажется трудным, может потребоваться измельчение порошка до более мелкой консистенции с использованием более шероховатой поверхности, такой как ступка и пестик.

Данные MicroED обычно собираются с помощью ПЭМ, работающего в режимемикрозонда 4,20. Здесь размер пучка ПЭМ, соответствующий скорости экспозиции 0,01 e-Å-2 s-1, обычно составляет около 10 мкм в диаметре, что намного больше, чем типичные микрокристаллы 1,21. Затем сигнал изолируют от интересующих кристаллов с помощью выбранной области апертуры (рис. 3)2,20. Различные размеры апертуры позволяют быстро адаптировать установку к различным размерам кристаллов. В качестве альтернативы можно собирать данные с помощью ПЭМ, работающего в режиме нанозонда. Это уменьшает размер луча примерно в 5 раз. Меньший луч соответствует соизмеримо более высокой интенсивности экспозиции в следе луча. Поскольку многие ПЭМ представляют собой две системы конденсорных линз, параллельное условие будет диктовать, что луч должен быть одного размера либо в режиме микрозонда, либо в режиме нанозонда. Достижение коэффициента экспозиции 0,01 e-Å-2 s-1 в нанозонде без регулировки объектива пистолета является сложной задачей. Выбор между ними остается за пользователем. Преимущество нанозонда заключается в том, что меньше необходимости вставлять и втягивать выбранную апертуру области между экранированием в режимах визуализации и дифракции. Однако в современных микроскопах вставка и втягивание апертуры SA происходит автоматически и точно. Микрозонд обеспечивает большую гибкость в изоляции дифракции, имея доступ к различным размерам выбранных апертур области. Больший луч в микрозонде может также обнажить близлежащие кристаллы, тогда как нанозонд может более точно нацеливаться на отдельные кристаллы.

Представленный протокол является стандартным подходом к сбору данных MicroED для малых молекул, используемых в нашей лаборатории10,11,12,13. Есть много адаптаций и модификаций, которые могут быть реализованы. Наилучший подход к созданию решеток с высокой плотностью кристаллов в наибольшей степени зависит от знакомства пользователя с данным подходом. Есть много случаев, когда лекарства присутствуют в виде больших кристаллов, которые слишком хрупки, чтобы физически фрагментироваться без потери дифракционной силы19. В этих случаях недавно был адаптирован метод сфокусированного ионно-лучевого фрезерования для утончения кристаллов, чтобы сделать их более доступными для MicroED 6,7,8,9,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Лаборатория Гонена поддерживается средствами Медицинского института Говарда Хьюза. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения P41GM136508.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-1.5mL Eppendorf tubes Fisher Scientific 14-282-300 Any vial or tube will do.
Autogrid clips Thermo-Fisher 1036173 Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-rings Thermo-Fisher 1036171
Carbamazapine Sigma C4024-1G Any amount will suffice for these experiments
CMOS based detector Thermo-Fisher CetaD 16M We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. 
Delphi software Thermo-Fisher N/A Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D software Thermo-Fisher N/A Commercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slides Hampton HR3-231
Glow discharger Pelco easiGlow
High PrecisionTweezers EMS 78325-AC Any high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vessel Spear Lab FD-800 A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM software UC Boulder N/A Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM grids Quantifoil/EMS Q310CMA Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. 
transmission electron microscope (TEM) Thermo-Fisher Talos Arctica
Whatman circular filter paper Millipore-Sigma WHA1001090 90mm or larger

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
  3. Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
  4. Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
  5. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  6. Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
  7. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
  8. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
  9. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  10. Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
  11. Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
  12. Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
  13. Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
  14. de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  17. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  18. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  19. de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
  20. Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
  21. Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
  22. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 169
Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martynowycz, M. W., Gonen, T.… More

Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules. J. Vis. Exp. (169), e62313, doi:10.3791/62313 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter