Summary
Aquí, describimos los procedimientos desarrollados en nuestro laboratorio para preparar polvos de cristales de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED).
Abstract
Se describe un protocolo detallado para preparar muestras de moléculas pequeñas para experimentos de difracción de electrones de microcristales (MicroED). MicroED se ha desarrollado para resolver estructuras de proteínas y moléculas pequeñas utilizando equipos de criomicroscopía electrónica estándar (crio-EM). De esta manera, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas solubles y proteínas de membrana se han determinado recientemente a altas resoluciones. Aquí se presentan protocolos para preparar cuadrículas de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas utilizando el medicamento carbamazepina como ejemplo. Se presentan protocolos para la selección y recopilación de datos. Los pasos adicionales en el proceso general, como la integración de datos, la determinación de la estructura y el refinamiento, se presentan en otra parte. El tiempo requerido para preparar las rejillas de moléculas pequeñas se estima en menos de 30 minutos.
Introduction
La difracción electrónica de microcristales (MicroED) es un método de criomicroscopía electrónica (crio-EM) para determinar estructuras de resolución atómica a partir de cristales de tamaño submicrométrico 1,2. Los cristales se aplican a las rejillas estándar del microscopio electrónico de transmisión (TEM) y se congelan sumergiéndolos en etano líquido o nitrógeno líquido. Luego, las rejillas se cargan en un TEM que opera a temperaturas criogénicas. Los cristales se ubican en la rejilla y se criban para la calidad de difracción inicial. Los datos MicroED de rotación continua se recopilan de un subconjunto de los cristales apantallados, donde los datos se guardan utilizando una cámara rápida como una película3. Estas películas se convierten a un formato cristalográfico estándar y se procesan casi idénticamente como un experimento de cristalografía de rayos X4.
MicroED fue desarrollado originalmente para investigar microcristales de proteínas 1,2. Un cuello de botella en la cristalografía de proteínas está creciendo cristales grandes y bien ordenados para experimentos tradicionales de difracción de rayos X de sincrotrón. Como los electrones interactúan con órdenes de magnitud de materia más fuertes que los rayos X, las limitaciones del tamaño del cristal necesario para producir difracción detectable son considerablemente menores5. Además, la relación de eventos de dispersión elástica a inelástica es más favorable para los electrones, lo que sugiere que se pueden recopilar datos más útiles con una exposición general más pequeña5. Los desarrollos constantes han permitido que los datos de MicroED se recopilen de los microcristales más desafiantes 6,7,8,9.
Recientemente, MicroED ha demostrado ser una herramienta poderosa para determinar las estructuras de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas a partir de materiales aparentemente amorfos10,11,12,13. Estos polvos pueden provenir directamente de una botella de reactivo comprado, una columna de purificación o incluso de triturar una píldora en un polvo fino10. Estos polvos parecen amorfos a simple vista, pero pueden estar compuestos completamente de nanocristales o simplemente contener trazas de depósitos nanocristalinos en una fracción amorfa no cristalina mayor. La aplicación del material a la cuadrícula es fácil, y los pasos posteriores de identificación de cristales, cribado y recopilación de datos podrían incluso automatizarse en un futuro próximo14. Mientras que otros pueden utilizar diferentes métodos para la preparación de muestras y la recolección de datos, aquí se detallan los protocolos desarrollados y utilizados en el laboratorio de Gonen para preparar muestras de moléculas pequeñas para MicroED y para la recolección de datos.
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Protocol
1. Preparación de muestras de moléculas pequeñas
- Transfiera una pequeña cantidad (0.01 - 1 mg) de polvo, líquido o sólidos a un vial o tubo pequeño.
- Para muestras que ya están en forma de polvo, selle el tubo con la tapa hasta que se necesite la muestra. Seque las muestras líquidas en polvos antes de intentar el método 1 (paso 3) o 2 (paso 4).
NOTA: Las muestras disueltas en líquido pueden utilizar el método 3 (5.X) a continuación
2. Preparación de cuadrículas TEM
NOTA: Algunos TEM con sistemas de cargador automático requieren que las rejillas se recorten y se coloquen en un casete antes de cargarlas en la columna TEM. El recorte implica asegurar físicamente la rejilla TEM de 3 mm en un anillo de metal que el cargador automático puede manipular. Este paso y los pasos posteriores se pueden realizar utilizando cuadrículas TEM normales o cuadrículas TEM que se han recortado. Para estos experimentos, a menudo es más fácil manipular las cuadrículas si se han recortado antes de tiempo.
- Envuelva la película de plástico alrededor de un extremo de un portaobjetos de cubierta de vidrio.
- Coloque las rejillas TEM en la película en la parte superior de la diapositiva de la cubierta con el lado de carbono hacia arriba. Identifique los dos lados de la rejilla bajo una luz. El lado de cobre brilla y parece metálico, mientras que el lado de carbono aparece de un color marrón monótono (Figura 1C, D). Para rejillas recortadas, el lado de carbono debe mirar hacia la cara plana del anillo de clip.
- Coloque el portaobjetos con rejillas en la cámara de descarga incandescente. El resplandor descarga el lado de la cubierta durante aproximadamente 30 s utilizando el ajuste negativo a 15 pA. Guarde las rejillas en el portaobjetos de la cubierta dentro de una placa de Petri de vidrio forrada con papel de filtro antes de agregar la muestra a las rejillas.
3. Aplicación de la muestra a las rejillas mediante la creación de un polvo fino homogéneo (Método 1)
- Retire una rejilla TEM descargada con brillo de la placa de Petri cubierta con pinzas. Coloque la rejilla en un papel de filtro circular con el lado de carbono hacia arriba.
- Con una espátula pequeña, retire una cucharada muy pequeña de polvo (aproximadamente 0,1 mg) y colóquela en una cubierta de vidrio pequeña y cuadrada justo al lado de la rejilla TEM en el papel de filtro. Coloque otro pequeño portaobjetos cuadrados de vidrio o cubreobjetos encima del polvo.
- Con los dedos, frote suavemente los dos portaobjetos de vidrio para hacer un polvo fino.
- Incline los cubreobjetos y colóquelos justo encima de la rejilla TEM en el papel de filtro y continúe frotando los cubreobjetos, solo unos centímetros por encima de la rejilla TEM descargada con brillo (Figura 1).
- Observe para ver si el polvo está cayendo hacia la rejilla. Destape el polvo finamente molido quitando uno de los dos cubreobjetos de vidrio. Cepille suavemente el polvo fino del cubreobjetos con un trozo de papel de filtro en la rejilla TEM (Figura 1).
4. Aplicación de la muestra a las cuadrículas aplicando el método de "agitación" (Método 2)
- Tome una rejilla con un par de pinzas y colóquela en el frasco o tubo de muestra de polvo. Cierre el vial con la tapa de plástico para asegurarse de que no se escape ningún material cuando se agite.
- Agarrando el vial en la mano, agite el vial de tal manera que el polvo y la rejilla se muevan durante aproximadamente 10 a 30 s.
- Vacíe el contenido del vial en un papel de filtro circular. Agarrando la rejilla en un borde, golpee suavemente el borde de la rejilla en el papel de filtro para eliminar cualquier exceso de material de la rejilla.
NOTA: Dependiendo del tipo de vial y tamaño, también se pueden usar pinzas para quitar la rejilla TEM sin vaciar el contenido.
5. Aplicación de la muestra a las rejillas utilizando el método de evaporación (método 3)
- Coloque una rejilla (recortada o no) en el centro de un trozo circular de papel de filtro con el lado de carbono hacia arriba y el lado de cobre hacia abajo.
- Con una jeringa hermética al gas de 10 μL, aplique una pequeña gota (aproximadamente 1 - 3 μL) de compuesto disuelto en el lado de carbono de la rejilla.
- Mueva suavemente el papel de filtro con rejillas a una cámara de desecación al vacío. Cubra la cámara y encienda la aspiradora. Deje las rejillas al vacío para que se sequen hasta por un día.
- Apague la aspiradora y deje que la cámara se ventile durante 5 minutos. La ventilación de la cámara evita que las rejillas se muevan o se alejen volando cuando se descubre.
6. Congelación y carga de rejillas en el TEM
- Agarre el borde de la cuadrícula TEM con un conjunto de pinzas, asegurándose de que las puntas no perforen ninguno de los cuadrados de la cuadrícula. Levante la rejilla de 1 a 2 cm por encima del papel de filtro e incline la rejilla a 90° con respecto al papel de abajo. Golpee suavemente las pinzas mientras mantiene la rejilla firmemente pinzada para eliminar cualquier polvo suelto.
- Congele la rejilla moviendo la punta de las pinzas con la rejilla directamente a un recipiente de nitrógeno líquido a mano. Este contenedor suele ser la estación de carga de la red para el TEM, pero puede ser cualquier contenedor seguro, como un termo seguro para nitrógeno líquido, es aceptable para la transferencia o el almacenamiento. El nitrógeno líquido es -196 °C.
- Espere hasta que la rejilla y las pinzas dejen de hervir antes de nuevas manipulaciones.
- Bajo nitrógeno líquido o en vapores de nitrógeno, coloque la rejilla en el portamuestras con el lado de carbono orientado de tal manera que la muestra sea golpeada por el haz antes de la película de soporte de carbono.
- Cargue el portamuestras en el TEM asegurándose de que la rejilla se mantenga a temperaturas de nitrógeno líquido en todo momento.
- Para los sistemas de carga automática, coloque las rejillas recortadas en un casete en un recipiente refrigerado por nitrógeno líquido. Este casete se transfiere a un contenedor de transporte que permite que la robótica del cargador automático acepte el casete mientras mantiene las muestras seguras para el transporte entre el cargador automático y la columna.
- Para configuraciones TEM de entrada lateral, asegure la cuadrícula a un soporte TEM de entrada lateral comercial. Estos soportes tienen un recipiente de preparación de muestras que se llena con nitrógeno líquido para permitir la transferencia de la rejilla al soporte sin calentar la muestra. El soporte de entrada lateral se inserta en el TEM directamente con la muestra asegurada en el extremo.
7. Recopilación de datos de MicroED
- Localización y cribado de nanocristales
- Abra las válvulas de columna TEM. Ajuste el aumento utilizando los paneles manuales al menor aumento posible. Encuentra el haz ajustando la perilla de intensidad en los paneles de mano de modo que un área redonda y brillante sea visible en la pantalla fluorescente.
- Tome un atlas de toda la cuadrícula con un aumento bajo (50 - 300x) utilizando el software apropiado14,15,16 (Figura 2). Asegúrese de que el microscopio esté bien alineado para imágenes de bajo y alto aumento antes de recopilar datos MicroED de alta resolución.
- Identifique los cuadrados de la cuadrícula sin carbono roto y que tengan un material/granos negros u oscuros visibles en la película (Figura 2). Navegue por la cuadrícula, ya sea físicamente usando el joystick en los paneles de mano, o virtualmente en el Atlas recopilado, para buscar cuadrados de cuadrícula que no estén rotos y contengan microcristales.
- Agregue el centro de cada uno de estos cuadrados a una lista de ubicaciones de cuadrícula para la investigación. Estas ubicaciones se pueden agregar a un portátil, en la interfaz de usuario del microscopio o en el software de automatización del microscopio.
- Aumente el aumento a 500-1.300x y ajuste la altura eucéntrica en cada ubicación de cuadrícula almacenada y actualice el valor Z guardado a las posiciones indicadas en 7.1.4.
- Busque en la pantalla fluorescente o en una cámara rápida con este aumento más alto para pequeños puntos negros / granos en la cuadrícula. Una buena muestra con frecuencia tiene bordes afilados a gran aumento, lo que sugiere un orden cristalino.
- Mueva un cristal potencial localizado al centro de la pantalla y aumente el aumento de tal manera que el TEM entre en modo de aumento alto.
NOTA: Esto se conoce como modo de gran aumento, Zoom2 o SA en diferentes instrumentos y generalmente corresponde a aumentos de 3,000x o más. - Inserte una abertura de área seleccionada. Cambie la apertura a un tamaño mayor o menor para asegurarse de que el área seleccionada sea más grande que el cristal (Figura 3).
- Cambie al modo de difracción presionando el botón de difracción en los paneles manuales TEM, asegurando que se inserte la pantalla fluorescente. Ajuste la longitud de la cámara con la perilla de aumento de modo que el borde tenga una resolución de al menos 1 Å.
NOTA: La calibración de las longitudes de difracción debe ser realizada por un ingeniero de servicio utilizando una rejilla de gofre de oro o una muestra conocida antes de intentar experimentos MicroED. - Ajuste el enfoque de difracción de modo que el punto central sea lo más nítido y pequeño posible. Usando las perillas de desplazamiento de difracción, mueva el haz central al centro de la pantalla fluorescente
- Inserte el tope de la viga y asegúrese de que la viga esté detrás de ella. Levante la pantalla fluorescente. Tome una exposición corta (aproximadamente 1 s) en la cámara (Figura 4).
- Inspeccione el patrón de difracción correspondiente. Un buen candidato para recopilar un conjunto de datos completo tendrá puntos afilados que se organizan regularmente en columnas y filas, y la difracción se extenderá más allá de 2 Å, preferiblemente al menos a 1 Å (Figura 4). Guarde las coordenadas cristalinas en la interfaz de usuario de TEM o escribiéndolas.
- Repita el cribado de difracción para todos los cristales potenciales de interés en el cuadrado de la cuadrícula actual.
- Recogida de datos
- Centra un cristal apantallado en la pantalla con un aumento alto (> 1.000x). Ajuste la altura eucéntrica del cristal usando una rutina automática o a mano.
- Inserte la abertura de área seleccionada que mejor se ajuste al tamaño y la forma del cristal según lo determinado en 7.1.8 (Figura 3). Incline el escenario en las direcciones negativa y positiva hasta que la imagen esté ocluida por las barras de cuadrícula (Figura 3). Tenga en cuenta estos ángulos para fines de recopilación de datos.
- Determine el número de fotogramas que se necesitarán para abarcar la cuña angular total del conjunto de datos. Es típico usar cuñas de 0.5 - 1.0 ° para cada cuadro, con fotogramas que se leen cada 1 a 5 segundos dependiendo de la sensibilidad de la cámara. Por ejemplo, una cuña que abarca de -30° a +30°, girando a una velocidad constante de 1° s-1 con un fotograma leído cada 1s, requeriría 60 fotogramas en total.
- Teniendo en cuenta el rango de inclinación total máximo de -72° a +72°, comience a girar el escenario a una velocidad constante de 1° s-1 y luego comience a leer los datos cada 1s en una cámara moderna con un modo de lectura rolling shutter (Película 1). Este proceso se puede realizar manualmente o utilizando un software específico de TEM.
- Establezca la velocidad de rotación especificando el % de la velocidad de inclinación máxima y cuándo detenerse en la interfaz de usuario del microscopio o en el software dedicado. En esta investigación, se midió que era de 0,3 ° s-1 por cada % de velocidad máxima, pero deberá verificarse de forma independiente para cada microscopio.
NOTA: La inclinación y la recopilación de datos de la cámara se configuran de forma independiente aquí, pero los programas de software14 pueden coordinar esto para simplificar el proceso. - Descarte aproximadamente 1° a cada lado de la cuña especificada en la mayoría de los casos como tiempo muerto, donde la etapa está aumentando o disminuyendo la velocidad de rotación deseada.
- Establezca la velocidad de rotación especificando el % de la velocidad de inclinación máxima y cuándo detenerse en la interfaz de usuario del microscopio o en el software dedicado. En esta investigación, se midió que era de 0,3 ° s-1 por cada % de velocidad máxima, pero deberá verificarse de forma independiente para cada microscopio.
- Guarde datos en una variedad de formatos como fotogramas individuales o como una pila de imágenes (Película 1).
- Convierta estos marcos de difracción a un formato cristalográfico típico utilizando las herramientas MicroED, disponibles aquí (https://cryoem.ucla.edu). Las imágenes de difracción guardadas en formato SMV se procesan fácilmente utilizando software cristalográfico documentado17,18.
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Representative Results
MicroED es un método crioEM que aprovecha las fuertes interacciones entre electrones y materia, lo que permite la investigación de cristales muy pequeños12,13. Después de estos pasos, se espera tener una película de difracción en formato cristalográfico recolectada de microcristales (Película 1). Aquí, la técnica se demuestra utilizando carbamazepina12. Los resultados muestran un conjunto de datos MicroED de rotación continua a partir de un microcristal de carbamazepina identificado en una cuadrícula TEM (Película 1). Un buen conjunto de datos tiene puntos fuertes y claros que no están manchados ni divididos, y tiene una sola celosía en cada fotograma que se puede seguir fácilmente pasando por la película19. Estos datos se indexan, integran y escalan fácilmente utilizando el software estándar de cristalografía de rayos X4. Los puntos divididos se pueden ver desde un cristal que ha sido agrietado, y dos orientaciones del mismo cristal están estrechamente alineadas, pero no del todo coincidentes19. También pueden ocurrir múltiples celosías, particularmente para estos cristales de moléculas pequeñas, donde múltiples cristales individuales se han pegado en un grupo en la rejilla. Otro escenario común ocurre cuando los cristales han sido congelados incorrectamente o tratados con demasiada dureza durante la fragmentación, y no se observa difracción9.
Después de la recopilación de datos, la integración y la solución de estructura, se espera que se determine una estructura de alta resolución (Figura 5). La obtención de una solución de estructura clara dependerá en última instancia de la calidad y la integridad de los datos.
Figura 1: Preparación de una rejilla TEM pre-recortada para la investigación de moléculas pequeñas . (A) Un tubo con una pequeña porción de muestra para investigación. (B) Muestra triturada entre dos portaobjetos de microscopio. (C) El lado de carbono de la rejilla precortada, y (D) el lado de cobre de la rejilla precortada. (E) Una rejilla TEM precortada después de que el polvo triturado se haya dejado caer sobre ella. Barras de escala de 3 mm en (C), (D) y (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de cristales de moléculas pequeñas en el TEM . (A) Un atlas o montaje de toda la cuadrícula a baja magnificación. (B) Una sola imagen de bajo aumento utilizada para la proyección. (C) Imagen de mayor aumento utilizada para identificar granos más pequeños. (D) Micrografía de gran aumento de un cristal de molécula pequeña agrupado. Barra de escala 750 μm in (A), 50 μm in (B), 10 μm in (C), 1 μm in (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cribado y alineación de microcristales para la recopilación de datos de MicroED . (A) Micrografía de gran aumento de un microcristal. (B) Micrografía del cristal aislado dentro de la abertura del área seleccionada. (C) El mismo microcristal en la apertura con el escenario inclinado a -69 °. Escala barras de todo 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de datos MicroED . (A) datos MicroED de alta calidad con puntos claros y nítidos adecuados para la determinación de estructuras de alta resolución. (B) Datos MicroED débiles y manchados con una definición de red deficiente. En este ejemplo, la alineación también está desactivada, por lo que la difracción solo es aparente en un lado de la imagen (C) Datos microED deficientes que muestran múltiples celosías y puntos divididos y / o manchados. Recuadro de área azul mejorada en la parte inferior derecha que muestra manchas y puntos divididos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estructura MicroED de la carbamazepina. Modelo atómico mostrado como palos con átomos de carbono de color blanco, rojo oxígeno y azul nitrógeno. El mapa 2Fo-F c está contorneado en el nivel de 1,5 σ y de color azul. El mapa Fo-F c que muestra hidrógenos está contorneado en el nivel de 3.0 σ y de color verde. Esta cifra fue adaptada de los mapas depositados de EMDB-928410. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Conjunto de datos MicroED de carbamazepina. El conjunto de datos abarca casi 90°, de -68° a +20°. Cada patrón de difracción abarca una cuña de 0,5° en el espacio recíproco y corresponde a una exposición de 1s a una tasa de exposición de 0,01 e- Å-2 s-1. Haga clic aquí para descargar esta película.
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Discussion
La preparación de muestras suele ser un proceso iterativo, donde las optimizaciones se realizan después de sesiones de selección y recopilación de datos. Para muestras de moléculas pequeñas, a menudo es prudente intentar primero la preparación de la rejilla sin descargar las rejillas con resplandor, ya que muchos productos farmacéuticos tienden a ser hidrófobos10,11. Si las rejillas tienen muy pocos depósitos nanocristalinos, es una buena idea volver a intentarlo después de la primera descarga luminosa de las rejillas. Puede darse el caso de que los cristales de los polvos liofilizados sean demasiado grandes y gruesos para recopilar buenos datos. En estos casos, puede ser posible recopilar datos de un borde o parte más delgada de un cristal más grande. Si esto resulta difícil, puede ser necesario moler el polvo hasta obtener una consistencia más fina utilizando una superficie más áspera, como un mortero.
Los datos de MicroED se recopilan normalmente con el TEM operando en modo microsonda 4,20. Aquí, el tamaño del haz TEM que corresponde a una tasa de exposición de 0,01 e- Å-2 s-1 es típicamente de alrededor de 10 μm de diámetro, que es mucho más grande que los microcristales típicos 1,21. A continuación, la señal se aísla de los cristales de interés utilizando una apertura de área seleccionada (Figura 3)2,20. Varios tamaños de apertura permiten un ajuste rápido de la configuración a diferentes tamaños de cristales. Alternativamente, es posible recopilar datos con el TEM operando en modo nano sonda. Esto reduce el tamaño del haz en aproximadamente un factor de 5. Un haz más pequeño corresponde a una tasa de exposición proporcionalmente mayor en la huella del haz. Dado que muchos TEM son dos sistemas de lentes de condensador, la condición paralela dictará que el haz sea de un solo tamaño en modo microsonda o nanosonda. Alcanzar una tasa de exposición de 0.01 e- Å-2 s-1 en nanosonda sin ajustar la lente de la pistola es un desafío. La elección entre los dos depende del usuario. Una ventaja de la nanosonda es que hay menos necesidad de insertar y retraer la apertura del área seleccionada entre la detección en los modos de operación de imagen y difracción. Sin embargo, con los microscopios modernos, la inserción y retracción de la apertura SA es automática y precisa. Microprobe ofrece una mayor flexibilidad para aislar la difracción al tener acceso a múltiples tamaños de aberturas de área seleccionadas. El haz más grande en la microsonda también puede exponer cristales cercanos, mientras que la nanosonda puede apuntar con mayor precisión a cristales individuales.
El protocolo presentado es el enfoque estándar para la recolección de datos MicroED para moléculas pequeñas utilizadas en nuestro laboratorio10,11,12,13. Hay muchas adaptaciones y modificaciones que podrían implementarse. El mejor enfoque para hacer rejillas con alta densidad de cristales depende más de la familiaridad del usuario con un enfoque dado. Hay muchos casos en que las drogas están presentes como cristales grandes que son demasiado frágiles para fragmentarse físicamente sin perder poder de difracción19. En estos casos, el método recientemente adaptado de molienda de haz de iones enfocado para adelgazar los cristales para hacerlos más accesibles a MicroED 6,7,8,9,22.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El laboratorio Gonen cuenta con el apoyo de fondos del Instituto Médico Howard Hughes. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud P41GM136508.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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