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Neuroscience

प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों के लिए नवजात माउस से माइक्रोग्लियल कोशिकाओं का चुंबकीय अलगाव

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/62964
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university
* These authors contributed equally

Summary

प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग आमतौर पर नए विरोधी भड़काऊ अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज के रूप में, पर्यावरणीय तनाव और मस्तिष्क होमियोस्टेसिस की प्रतिक्रिया सहित कई कार्यों के लिए मौलिक हैं। माइक्रोग्लिया सक्रियण फेनोटाइप के एक बड़े स्पेक्ट्रम को अपना सकता है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया जो प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप का समर्थन करता है, न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों दोनों से जुड़ा हुआ है। विशिष्ट सेल प्रकारों में संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए अनुसंधान में इन विट्रो अध्ययनों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस संदर्भ में प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृतियों का उपयोग करके विट्रो में माइक्रोग्लियल सक्रियण और न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करना माइक्रोग्लियल सेल लाइनों या स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया की तुलना में अधिक प्रासंगिक है। हालांकि, कुछ प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग प्रजनन क्षमता की कमी से पीड़ित हो सकता है। यह प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का प्रस्ताव करता है। एमआरएनए अभिव्यक्ति परिमाणीकरण और एक Cy3-मोती फागोसाइटिक परख द्वारा 4 घंटे और 24 घंटे के बाद कई उत्तेजनाओं का उपयोग करके माइक्रोग्लियल सक्रियण यहां प्रदर्शित किया गया है। वर्तमान कार्य से किशोर विकास चरणों से शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करने की उम्मीद है।

Introduction

माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी मैक्रोफेज जैसी कोशिकाएं हैं जो जर्दी थैली के एरिथ्रोपोइटिक अग्रदूतों से प्राप्त होती हैं जो प्रारंभिकभ्रूण के विकास के दौरान न्यूरोएपिथेलियम में स्थानांतरित होती हैं। उनके प्रतिरक्षा कार्यों के अलावा, वे न्यूरोडेवलपमेंट के दौरान भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सिनैप्टोजेनेसिस, न्यूरोनल होमियोस्टेसिस और माइलिनेशन2 के लिए। वयस्कता में, माइक्रोग्लिया पर्यावरण को लगातार स्कैन करने के लिए लंबी सेलुलर प्रक्रियाओं को विकसित करता है। मस्तिष्क की चोट या मस्तिष्क रोग जैसे होमियोस्टैसिस टूटने के मामले में, माइक्रोग्लिया एक अमीबॉइड आकार को अपनाने के लिए अपनी रूपात्मक उपस्थिति को बदल सकता है, घायल क्षेत्र में पलायन कर सकता है, कई साइटोप्रोटेक्टिव या साइटोटोक्सिक कारकों को बढ़ा सकता है और छोड़ सकता है। माइक्रोग्लिया में उनके विकास चरण और चोट के प्रकार के आधार पर विषम सक्रियण अवस्थाएं होती हैं। इस अध्ययन में, इन सक्रियण राज्यों को मोटे तौर पर तीन अलग-अलग फेनोटाइप्स में वर्गीकृत किया जाता है: प्रो-इंफ्लेमेटरी / फागोसाइटिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनो-रेगुलेटरी, यह ध्यान में रखते हुए कि वास्तव में, स्थितिअधिक जटिल होने की संभावना है।

मस्तिष्क के विकास के शुरुआती चरणों में न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों के लिए विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण और स्क्रीनिंग में अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है (1) खरपतवार से पहले जानवरों की नाजुकता और (2) माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की कम संख्या। इसलिए माइक्रोग्लिया पर इन विट्रो अध्ययन व्यापक रूप से विषाक्तता 7,8,9, न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों 5,10,11,12,13,14, और सह-संस्कृतियों 15,16,17,18,19,20,21 के लिए उपयोग किए जाते हैं . इन विट्रो अध्ययन या तो माइक्रोग्लियल सेल लाइनों, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया, या प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति का उपयोग कर सकते हैं। इन सभी दृष्टिकोणों के फायदे और नुकसान हैं, और विकल्प प्रारंभिक जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है। प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग करने के लाभ समरूप आनुवंशिक पृष्ठभूमि, रोगज़नक़-मुक्त इतिहास और उस समय का नियंत्रण है जब माइक्रोग्लिया जानवरों की मृत्यु के बाद उत्तेजित होताहै।

वर्षों से, नवजात शिशुओं और वयस्क 23,24,25,26,27,28,29 दोनों से प्राथमिक माइक्रोग्लिया की खेती के लिए विभिन्न तरीकों (फ्लो साइटोमेट्री, शेकिंग, या चुंबकीय लेबलिंग) को विकसित किया गया था। वर्तमान काम में, माउस नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया अलगाव पहले वर्णित चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग तकनीक का उपयोग करके माइक्रोबीड-लेपित एंटी-माउस सीडी 11 बी 25,27,29 का उपयोग करके किया जाता है। सीडी 11 बी एक इंटीग्रिन-रिसेप्टर है जो माइक्रोग्लिया सहित माइलॉयड कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जाता है। जब मस्तिष्क के भीतर कोई भड़काऊ चुनौती नहीं होती है, तो लगभग सभी सीडी 11 बी + कोशिकाएं माइक्रोग्लिया30 होती हैं। अन्य पहले प्रकाशित विधियों 23,24,25,26,27,28,29 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल तत्काल पूर्व विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण विश्लेषण और आम इन विट्रो प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृति को संतुलित करता है। इस प्रकार, माइक्रोग्लिया (1) प्रसवोत्तर दिन (पी) 8 में माइलिन हटाने के बिना अलग होते हैं, (2) सीरम के बिना सुसंस्कृत होते हैं, और (3) मस्तिष्क अलगाव के केवल 48 घंटे बाद सीआरएनए, एमआईआरएनए, फार्माकोलॉजिकल यौगिक और / या भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में आते हैं। इन तीन पहलुओं में से प्रत्येक वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रासंगिक और तेज बनाता है। सबसे पहले, बाल चिकित्सा माइक्रोग्लिया का उपयोग एक अतिरिक्त डिमाइलिनेशन चरण की आवश्यकता के बिना संस्कृति में गतिशील और प्रतिक्रियाशील व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति देता है जो संभावित रूप से विट्रो में माइक्रोग्लियल प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइक्रोग्लिया के शारीरिक वातावरण के जितना संभव हो उतना करीब आना है। दरअसल, माइक्रोग्लिया कभी भी सीरम का सामना नहीं करता है, और इस प्रोटोकॉल को सीरम के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, संस्कृति के बाद 48 घंटे की शुरुआत में माइक्रोग्लिया को उजागर करने से उन्हें अपने शारीरिक संकायों को खोने से रोका जाता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी गई थी, और सभी जानवरों को इंस्टीट्यूट नेशनल डे ला सैंटे एट डे ला रेचरचे साइंटिफिक (इंसरम, फ्रांस) के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया था। पी 8 पर 24 ओएफ 1 माउस पिल्ले (नर और मादा दोनों) के दिमाग से माइक्रोग्लिया का चुंबकीय अलगाव, 6-वेल, 12-वेल, या 96-वेल प्लेटों में विभाजित किया गया है। प्रयोगात्मक कार्य बाँझ परिस्थितियों को बनाए रखने के लिए एक हुड के तहत किया गया था।

1. अलगाव और सेल संस्कृति के लिए बाँझ समाधान की तैयारी

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x समाधान से Ca2+ और Mg 2+ (HBSS-/-) के बिना 1x हैंक्सके संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 50 mL तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक पृथक्करण किट का उपयोग करके तालिका 1 में प्रदान की गई संरचना के अनुसार पृथक्करण मिश्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x समाधान से Ca2+ और Mg 2+ (HBSS+/+) के साथ 1x HBSS का 200 mL तैयार करें।
  4. 1x PBS + 0.5% बीएसए (सेल सॉर्टिंग बफर के रूप में संदर्भित) के 200 एमएल तैयार करें।
  5. तालिका 2 के अनुसार सीडी 11 बी-माइक्रोबीड्स तैयार करें।
  6. मैक्रोफेज सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम (एसएफएम) के 500 एमएल + पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) का 1% तैयार करें। 50 एमएल ट्यूबों के एलिकोट बनाएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसे पाठ में बाद में माइक्रोग्लिया माध्यम के रूप में संदर्भित किया जाता है।
    नोट: सभी अलगाव समाधानों को प्रयोग दिवस पर बाँझ परिस्थितियों में ताजा तैयार किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। माइक्रोग्लिया सेल कल्चर माध्यम तैयार किया जा सकता है, 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट किया जा सकता है, और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। निस्पंदन की आवश्यकता नहीं है।

2. मस्तिष्क विच्छेदन

  1. पिछले सामान्य संज्ञाहरण के बिना बड़ी कैंची का उपयोग करके पिल्ले के सिर को काट दें।
  2. छोटी कैंची (चित्रा 1 ए-सी) के साथ सीवन (15-20 मिमी) के बाद गर्दन से नाक तक त्वचा को काटें।
  3. खोपड़ी के समानांतर फोरमेन मैग्नम के भीतर एक छोटी कैंची की युक्तियां डालें। प्रत्येक तरफ से आंखों को ध्यान से काटें (चित्रा 1 डी, ई)।
  4. खोपड़ी और मस्तिष्क को सिर से अलग करने के लिए छोटी कैंची से आंखों के बीच काटें (चित्रा 1 एफ)।
  5. दो बलों के साथ, खोपड़ी को घ्राण बल्बों के करीब पकड़ें और खोपड़ी को सावधानी से फाड़ दें, इस बात का ध्यान रखें कि अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचे (चित्रा 1 जी-आई)।
  6. रेजर ब्लेड के साथ सेरिबैलम और ओल्फएक्टिव बल्ब को हटा दें और मस्तिष्क को दो टुकड़ों में काट लें (चित्रा 1 जे)।
  7. मस्तिष्क के टुकड़ों को पेट्री डिश में रखें जिसमें 30-40 एमएल एचबीएसएस -/ - (चित्रा 1 के) हो।

3. मस्तिष्क पृथक्करण और चुंबकीय माइक्रोग्लियल अलगाव

नोट: सभी सेल जोड़तोड़ और पुन: निलंबन को बहुत सावधानी के साथ 1,000 μL पिपेट के साथ किया जाना चाहिए। एक उच्च यांत्रिक कार्रवाई लागू करने से माइक्रोग्लिया कोशिकाएं सक्रिय या मार सकती हैं।

  1. तालिका 1 के अनुसार पृथक्करण मिश्रण युक्त पृथक्करण ट्यूब में 12 मस्तिष्क के टुकड़े (~ 1.2 ग्राम) स्थानांतरित करें। 24 पिल्लों के लिए, चार सी-ट्यूब की आवश्यकता थी (चित्रा 2 ए-बी)।
  2. सी-ट्यूब को डिसोसिएटर पर रखें (हीटिंग मोड के साथ)। निर्माता के निर्देश (चित्रा 2 डी) के अनुसार उपकरण में अनुकूलित एनटीडीके कार्यक्रम शुरू करें।
  3. सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 20 सेकंड (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज। 1,000 μL पिपेट (चित्रा 2E) के साथ तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके यांत्रिक पृथक्करण को पूरा करें।
  4. कोशिकाओं को चार 15 एमएल ट्यूब + छन्नी में स्थानांतरित करें। एचबीएसएस + / + के 10 एमएल के साथ छन्नी को कुल्ला करें (चित्रा 2 एफ)।
  5. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सावधानीपूर्वक 10 एमएल एचबीएसएस + / + (चित्रा 2 जी) के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 6 एमएल सॉर्टिंग बफर (चरण 1.4) (चित्रा 2 एच) के साथ गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  7. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। प्रति ट्यूब CD11b-माइक्रोबीड समाधान (चरण 1.5) के 200 μL जोड़ें और सावधानी से पुन: निलंबित करें (चित्रा 2I)।
  8. ट्यूबों को 15-20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 6 एमएल सॉर्टिंग बफर (चित्रा 2आई-जे) के साथ गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  9. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सावधानीपूर्वक 8 एमएल सॉर्टिंग बफर (चित्रा 2 के) के साथ गोली को पुन: निलंबित करें।
  10. आठ कॉलम तैयार करने के लिए विभाजक पर POSSEL प्रोग्राम का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। स्तंभ पर कोशिकाओं को 1 mL से 1 mL स्थानांतरित करें। एक और एमएल जोड़ने से पहले सभी कोशिकाओं के गुजरने की प्रतीक्षा करें। 1 एमएल सॉर्टिंग बफर के साथ बाँझ क्षालन प्लेट पर एल्यूट सीडी 11 बी + कोशिकाएं (चित्रा 2 एल)।
  11. एक नई 50 एमएल ट्यूब (चित्रा 2 एम) में पूल सीडी 11 बी + कोशिकाएं।
  12. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए 300 x g पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सावधानीपूर्वक 10 एमएल ठंडे माइक्रोग्लिया माध्यम (चरण 1.6) (चित्रा 2 एन) के साथ गोली को पुन: निलंबित करें।
  13. CD11b+ कक्षों की गणना करें। पी 8 पर, किसी को प्रति मस्तिष्क ~ 650,000 कोशिकाएं प्राप्त करनी चाहिए।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके गिना गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  14. ठंडे माइक्रोग्लिया माध्यम में कोशिकाओं को 650,000-700,000 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें और सेल कल्चर प्लेटों में वितरित करें।
    नोट: 6-वेल प्लेटें वेस्टर्न ब्लॉट (2 एमएल प्रति कुएं) के लिए हैं; 12-वेल प्लेटें आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण (1 एमएल प्रति कुआं) के लिए हैं, और 96-वेल प्लेटें फागोसाइटिक परख (250 μL प्रति कुएं) के लिए हैं; इस काम के लिए तीनों का इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस पांडुलिपि में, वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के परिणाम नहीं दिखाए गए हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदर्शन करना संभव है।
  15. प्लेटों को रात भर 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पूर्व-गर्म माइक्रोग्लिया माध्यम के साथ 1,000 μL पिपेट के साथ माध्यम को सावधानीपूर्वक बदलें।
  16. उत्तेजना से पहले प्लेटों को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: माइक्रोग्लिया को 36 से अधिक पिल्लों से अलग करने और पी 9 के बाद की सिफारिश नहीं की जाती है। यह माइक्रोग्लिया को सक्रिय करने के लिए सेल मलबे के संदूषण और संचय के जोखिम को बढ़ाएगा।

4. सेल उत्तेजना

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके तालिका 3 के अनुसार उत्तेजना अभिकर्मकों को तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रत्येक उत्तेजित अच्छी तरह से उचित मात्रा जोड़ें।
    नोट: उचित मात्रा उत्तेजना की एकाग्रता और कुएं के आकार पर निर्भर करती है।
  3. प्लेटों को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे, 24 घंटे या 48 घंटे पर उत्तेजना के अंत तक रखें।
  4. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और पिपेट के साथ प्रोटीन लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिका देखें) के 50 μL जोड़ें। युक्तियों का उपयोग करके, लिसेड कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट के निचले हिस्से को खरोंचें और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: कल्चर प्लेटों को -80 डिग्री सेल्सियस पर वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है यदि सतह पर तैरने वाला सही ढंग से एस्पिरेटेड है।
  5. आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण 6,31 के लिए, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एमआरएनए निष्कर्षण (चरण 5) तक सीधे -80 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर प्लेटों को स्टोर करें।
  6. फागोसाइटिक परख के लिए, कृपया चरण 6 देखें।

5. एमआरएनए निष्कर्षण और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए आरएनए निष्कर्षण, आरटी-पीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर करें (सामग्री की तालिका देखें)। प्राइमर अनुक्रम 5,6,31 के लिए तालिका 4 देखें।
  2. पहले प्रकाशित रिपोर्ट5 का पालन करके RT-qPCR विश्लेषण करें।

6. फागोसाइटिक परख

  1. उत्तेजना के अंतिम 3 घंटे के दौरान कोशिकाओं को उत्तेजित करें और फागोसाइटिक परख करें। उदाहरण के लिए, 6 घंटे की उत्तेजना के लिए, उत्तेजना के 3 घंटे के बाद फागोसाइटिक परख शुरू करें; और 12 घंटे की उत्तेजना के लिए, उत्तेजना की शुरुआत के 9 घंटे बाद फागोसाइटिक परख शुरू करें।
  2. अनुपात (1 सेल: 50 मोती) को ध्यान में रखते हुए तैयार करने के लिए आवश्यक मोतियों की संख्या की गणना करें। 96-वेल प्लेट के एक कुएं के लिए, 8.1 x 106 मोतियों की आवश्यकता होती है। तालिका 5 के अनुसार मोतियों का मिश्रण तैयार करें।
    ध्यान दें: पीबीएस / एफबीएस मिश्रण में जोड़ने से पहले मोतियों के स्टॉक शीशी को सावधानीपूर्वक भंवर करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। वोर्टेक्स हर 10 मिनट में।
  4. प्रत्येक कुएं में जोड़ने के लिए समाधान मात्रा की गणना करें। घोल जोड़ें और 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 1x PBS के साथ कुओं को तीन बार धोएं। 550 एनएम (Cy3 उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य) पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पढ़ें।

7. शुद्धता गुणवत्ता नियंत्रण

  1. फ्लो साइटोमेट्री (एफएसीएस) (सेल सॉर्टिंग से पहले और बाद में) द्वारा सीडी 11 बी चुंबकीय अलगाव की शुद्धता का मूल्यांकन करें, और फिर आरटी-क्यूपीसीआर करें।
    1. चरण 3.5 और चरण 3.14 के बाद 10 x 106 कोशिकाओं / एमएल के कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें और एफएसीएस बफर (ईडीटीए के पीबीएस + 2 एमएम + बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन का 0.5%) में पुन: निलंबित करें।
    2. पारंपरिक एफसी ब्लॉकिंग32,33 के 15 मिनट के बाद, कोशिकाओं को व्यवहार्यता जांच (एफवीएस 780) और माउस सीडी 45, सीडी 11 बी, सीएक्स 3 सीआर 1, एसीएसए -2, ओ 4 या उनके संबंधित नियंत्रण आइसोटाइप32,33 के खिलाफ व्यवहार्यता जांच (एफवीएस 780) और फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
    3. कोशिकाओं को FACS बफर के साथ धोएं, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परमेबिलाइजेशन किट के साथ ठीक करें, और परमेबिलाइज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. परमेबिलाइज्ड कोशिकाओं पर फिर से एफसी ब्लॉकिंग करें, और फिर 15 मिनट के लिए न्यून ( सामग्री की तालिका देखें) या इसके नियंत्रण आइसोटाइप के खिलाफ फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
    5. एफएसीएस बफर के साथ धोने के बाद एफएसीएस विश्लेषण करें।
    6. रूपात्मक मापदंडों और एफवीएस 780 धुंधलापन के आधार पर डबल्स और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के बाद, सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के विश्लेषण के लिए सीएक्स 3 सीआर 1 (माइक्रोग्लिया), एसीएसए -2 (एस्ट्रोसाइट्स), ओ 4 (ओलिगोडेंड्रोसाइट्स), और न्यून (न्यूरॉन्स) की इंट्रासेल्युलर उपस्थिति की सतह अभिव्यक्ति के लिए गेटिंग रणनीति का चयन करें।
  2. चरण 5 के बाद, एमआरएनए निकालें और इटगम (सीडी 11 बी), सीएक्स 3 सीआर 1, ओलिग 2, सिनैप्टोफिसिन और जीएफएपी एमआरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर करें। एक रिपोर्टर के रूप में आरपीएल 13 ए एमआरएनए का उपयोग करके सीक्यू को सामान्य करें, और इटगम एमआरएनए के लिए एक सापेक्ष अभिव्यक्ति करें।

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Representative Results

माइक्रोग्लिया सीएनएस निवासी मैक्रोफेज है जो पर्यावरणीय चुनौतियों (आघात, विषाक्त अणुओं, सूजन) 4,5,6,34 (चित्रा 3 ए) के संपर्क में आने पर सक्रिय हो जाता है। माइक्रोग्लिया पर इन विट्रो अध्ययन आमतौर पर उन पर्यावरणीय चुनौतियों से संबंधित सेल-स्वायत्त तंत्र का मूल्यांकन करने और औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर के बाद सक्रियण स्थिति को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। यहां, चुंबकीय युग्मित मोतियों का उपयोग करके किशोर चरण में प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है।

विट्रो में माइक्रोग्लियल सक्रियण के लिए एक आसान रीडआउट एक प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप (सीडी 86, नंबर 2, पीटीजीएस 2, टीएनएफ) या एक विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप (सीडी 206, आईजीएफ 1, एआरजी 1, एलजीएसएल 3) 5,6,31 से जुड़े कई माइक्रोग्लियल प्रतिक्रिया मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति को निर्धारित करना है। इन फेनोटाइप्स को प्रो-इंफ्लेमेटरी (आईएल -1, एलपीएस) या विरोधी भड़काऊ (आईएल -4 या आईएल -10) उत्तेजना के बाद एमआरएनए अभिव्यक्ति के आधार पर वर्णित किया गया था। कुछ मार्करों को इम्यूनो-नियामक मार्करों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है क्योंकि वे प्रो- और विरोधी भड़काऊ उत्तेजना (चित्रा 3 ए) के माध्यम से विनियमित होते हैं। इस वर्गीकरण को पहले हमारी टीम 5,6,31 द्वारा वर्णित किया गया था। 48 घंटे के बाद, पृथक माइक्रोग्लियल को 4 घंटे या 24 घंटे के लिए प्रो-और एंटी-भड़काऊ उत्तेजना के साथ उत्तेजित किया गया था। 4 घंटे और 24 घंटे पर, प्रो-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनो-रेगुलेटरी मार्कर आईएल -1, आईएल -1 + आईएफएन -γ और एलपीएस 5,6,31 द्वारा प्रेरित होते हैं। 4 घंटे में, आईएल -4 उत्तेजना इम्यूनो-नियामक मार्कर आईएल -1 आरएन6 को भी प्रेरित करती है। वे विरोधी भड़काऊ मार्करों के बारे में आईएल -4 उत्तेजना के बाद 4 घंटे में दृढ़ता से प्रेरित होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि सीडी 206 को आईएल -1 उत्तेजना6 (चित्रा 3 बी) के 24 घंटे बाद भी काफी विनियमित किया जाता है।

विट्रो में माइक्रोग्लिया की फागोसाइटिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, फ्लोरोसेंट Cy3 PVC मोतियों का उपयोग किया गया था। माइक्रोग्लिया द्वारा उनके फागोसाइटोसिस को सुविधाजनक बनाने के लिए उन्हें भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूर्व-उपचार किया गया था। माइक्रोग्लिया को 3 घंटे या 21 घंटे के लिए आईएल -1 + आईएफएन -γ या एलपीएस के साथ उत्तेजना द्वारा प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप की ओर ध्रुवीकृत किया गया था। उत्तेजना के अंत से तीन घंटे पहले, Cy3-मोतियों को माइक्रोग्लियल कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया था। 1x PBS के साथ कुल्ला करने के बाद, प्रत्येक कुएं में प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित की गई थी। बिना मोतियों वाले कुओं के सापेक्ष परिमाणीकरण व्यक्त किया गया था, और प्रतिनिधि छवियां ली गई थीं (चित्रा 4)। 6 घंटे की उत्तेजना के बाद, माइक्रोग्लिया केवल आईएल -1 + आईएफएन -γ के तहत फागोसाइट साइ 3-बीड्स शुरू करता है। 24 घंटे की उत्तेजना के बाद, दोनों प्रकार की उत्तेजना के लिए Cy3 प्रतिदीप्ति की वृद्धि होती है। Cy3 प्रतिदीप्ति की वृद्धि बढ़ी हुई फागोसाइटिक गतिविधि पर प्रकाश डालती है (चित्रा 4 सी)।

माइक्रोग्लियल संस्कृति की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री (एफएसीएस) और आरटी-क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया था। विभिन्न मस्तिष्क सेलुलर आबादी को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा अलग किया जा सकता है: माइक्रोग्लिया के लिए सीएक्स3सीआर 1 35, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स36 के लिए ओ 4, न्यूरॉन्स37 के लिए न्यून, और एस्ट्रोसाइट्स38 के लिए एसीएसए -2। पृथक्करण के बाद, सभी मस्तिष्क कोशिकाएं मौजूद होती हैं; हालांकि, सीडी 11 बी एंटीबॉडी का उपयोग करके सेल सॉर्टिंग के बाद, केवल माइक्रोग्लिया और ओ 4 कोशिकाओं की थोड़ी मात्रा मौजूद है (चित्रा 5 ए)। प्राथमिक सेल संस्कृति के 48 घंटे बाद, आरटी-क्यूपीसीआर (चित्रा 5 बी) द्वारा मूल्यांकन के रूप में केवल माइक्रोग्लिया मार्कर पाए जाते हैं।

Figure 1
चित्र 1: खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने को दर्शाने वाला चरण-दर-चरण प्रतिनिधित्व। (A-C) छोटी कैंची का उपयोग गर्दन से नाक तक त्वचा को काटने के लिए किया गया था। (डी-ई) खोपड़ी के समानांतर फोरामेन मैग्नम के भीतर छोटी कैंची की युक्तियां डाली गईं, और प्रत्येक तरफ से आंखों को सावधानीपूर्वक काटा गया। (च) छोटी कैंची से आंखों के बीच काटकर खोपड़ी और मस्तिष्क को सिर से अलग किया गया। (G-I) खोपड़ी को दो बलों के साथ ओल्फएक्टिव बल्बों के करीब पकड़ा गया था और अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए सावधानी से फाड़ दिया गया था। (जे) सेरिबैलम और ओल्फएक्टिव बल्ब को रेजर ब्लेड के साथ हटा दिया गया था, और मस्तिष्क को दो टुकड़ों में काट दिया गया था। (के) मस्तिष्क के टुकड़ों को पेट्री डिश में रखा गया था जिसमें 30-40 एमएल एचबीएसएस -/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(A-C) P8 माउस मस्तिष्क विच्छेदन और ओल्फएक्टिव बल्ब और सेरिबैलम को हटाने के बाद, दिमाग को पहले HBSS +/+ के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित किया गया था, और फिर पृथक्करण मिश्रण युक्त पृथक्करण ट्यूबों में स्थानांतरित किया गया था। सी-ट्यूबों को डिसोसिएटर (हीटिंग मोड के साथ) पर रखा गया था, और एनटीडीके प्रोग्राम शुरू किया गया था (डी)। (ई) कार्यक्रम के अंत में, ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था; इसके बाद 1,000 μL पिपेट के साथ तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पृथक्करण पूरा किया गया। (एफ) कोशिकाओं को तब 15 एमएल ट्यूबों + 70 μm के छन्नी में स्थानांतरित किया गया और 10 एमएल HBSS +/+ के साथ धोया गया। (जी) नमूने तब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज किए गए थे, सुपरनैटेंट को हटा दिया गया था, और गोली को 10 एमएल एचबीएसएस + / + के साथ फिर से निलंबित किया गया था। (एच) ट्यूबों को फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था; सुपरनैटेंट को हटा दिया गया था, और फिर गोली को 6 एमएल सॉर्टिंग बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था। (I) ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, सुपरनैटेंट को हटा दिया गया था, और CD11b-माइक्रोबीड (200 μL) घोल जोड़ा गया था। ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, और फिर 6 एमएल सॉर्टिंग बफर (जे) में फिर से निलंबित किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। (एल) फिर, कॉलम तैयार करने के लिए विभाजक पर पोसेल कार्यक्रम लॉन्च करें। कोशिकाओं को कॉलम पर 1 एमएल से 1 एमएल स्थानांतरित किया गया था, और सीडी 11 बी कोशिकाओं को 1 एमएल सॉर्टिंग बफर के साथ बाँझ क्षालन प्लेट पर स्थानांतरित किया गया था। (एम) सीडी 11 बी कोशिकाओं को एक नई 50 एमएल ट्यूब में पूल किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सुपरनैटेंट को हटा दिया गया था। (एन) अंतिम चरण में गोली को 10 एमएल ठंडे माइक्रोग्लिया माध्यम में सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित किया गया था। कोशिकाओं को माइक्रोग्लियल माध्यम में 650,000-700,000 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक गिना और पतला किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पर्यावरणीय चुनौतियों के प्रदर्शन के बाद माइक्रोग्लियल सक्रियण। (ए) माइक्रोग्लियल सक्रियण स्पेक्ट्रम का सरलीकृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) 4 घंटे या 24 घंटे उत्तेजना के बाद माइक्रोग्लियल सक्रियण मार्करों का सापेक्ष परिमाणीकरण। दो-तरफ़ा एनोवा के बाद डंनेट की कई तुलना परीक्षण39 (एन = 5-15); त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: विट्रो में माइक्रोग्लिया की फागोसाइटिक गतिविधि का मूल्यांकन। (ए) 6 घंटे या 24 घंटे की उत्तेजना के बाद माइक्रोग्लिया साइ 3-बीड्स (लाल) फागोसाइटोसिस की प्रतिनिधि छवियां। छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के 20x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 100 μm। (बी) प्रति कुएं प्रति कुएं का सापेक्ष परिमाणीकरण। सांख्यिकी दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की गई थी, जिसके बाद डंनेट के कई तुलना परीक्षण (एन = 4-7); त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। (सी) माइक्रोग्लिया (आईबीए -1 + हरे रंग में कोशिकाएं) साइ 3-मोती (लाल में) फागोसाइटोसिस की प्रतिनिधि तस्वीर 6 घंटे की उत्तेजना के बाद। छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के 40x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। स्केल बार = 300 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: सेल सॉर्टिंग से पहले और बाद में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 11 बी चुंबकीय अलगाव शुद्धता का मूल्यांकन। (ए) सेल सॉर्टिंग से पहले और बाद में सेल काउंटर से उदाहरणों की रिपोर्ट, सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता पर प्रकाश डाला गया है। (बी) एक्स-अक्ष सीडी 11 बी सेल सॉर्टिंग के बाद सेल एकाग्रता (सेल / एमएल) और व्यवहार्यता (%) का प्रतिनिधित्व करता है। कॉलम बार ग्राफ; त्रुटि पट्टियाँ SEM (n = 16) का प्रतिनिधित्व करती हैं। सीडी 11 बी + सेल सॉर्टिंग से पहले और बाद में सेल जनसंख्या मार्करों के फेनोटाइपिक और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। पृथक्करण के बाद, पी 8 चूहों के दिमाग से सीडी 11 बी + कोशिकाओं को चुंबकीय रूप से क्रमबद्ध किया गया था। माइक्रोग्लिया (सीएक्स 3 सीआर 1), ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओ 4 या ओलिग 2 एमआरएनए), न्यूरॉन्स (न्यून या सिनैप्टोफिसिन एमआरएनए)), और एस्ट्रोसाइट्स (एसीएसए -2 या जीएफएपी एमआरएनए) मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण सॉर्टिंग से पहले और बाद में किया गया था। (सी) सीएक्स 3 सीआर 1, ओ 4, न्यून और एसीएसए -2 अभिव्यक्ति का एफएसीएस विश्लेषण। एक्स-अक्ष जीवित कोशिकाओं और सेल संख्याओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) सीडी 11 बी + कोशिकाओं की सापेक्ष मात्रा सीएक्स 3 सीआर 1, ओलिग 2, सिनैप्टोफिसिन, और जीएफएपी एमआरएनए (एक्स-अक्ष इटगम एमआरएनए के सापेक्ष लक्ष्य एमआरएनए अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है)। कॉलम बार ग्राफ; त्रुटि पट्टियाँ SEM (n = 7) का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घोल एक सी-ट्यूब के लिए (μL) चार सी-ट्यूबों के लिए (μL)
Buffer X 2850 11400
एंजाइम पी (पपेन) 75 300
एंजाइम ए (DNAse) 15 60
Buffer Y 30 120
कुल 2970 11880

तालिका 1: पृथक्करण मिश्रण की तैयारी।

घोल एक ट्यूब के लिए (μL) चार ट्यूबों के लिए (μL)
CD11b Microbeads 20 80
सॉर्टिंग बफर 180 720
कुल 200 800

तालिका 2: सीडी 11 बी माइक्रोबीड समाधान की तैयारी।

उत्तेजन एकाग्रता (ng/mL)
आईएल -1β 50
IFN-γ 20
LPS 10
आईएल -4 30
आईएल-10 20

तालिका 3: उत्तेजना अभिकर्मक।

जीन प्रोटीन आगे उल्टा
Arg1 Arginase 1 जीटीजी एएजी एएसी सीसीए सीजीजी टीसीटी जीटी जीसीसी एजीए जीएटी जीसीटी टीसीसी एएसी टीजी
Cd206 विभेदन का समूह 206 सीटीटी सीजीजी जीसीसी टीटीजी जीजीए एटीए एटी टैग एएजी एजीसी सीसीटी टीजीजी जीटीटी जीए
Cd32 विभेदन का समूह 32 सीटीजी जीएए जीसीए जीसीसी एएए एसी सीसीए एटीजी सीसीए एजीजी जीएजी एक्ट एए
Cd86 विभेदन का समूह 86 जीएजी सीजीजी जीएटी एजीटी एएसी जीसीटी जीए जीजीसी टीसीटी सीएसी टीजीसी सीटीटी सीएसी टीसी
Gfap ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन AAGCCAAGCACGAAGCTAAC CTCCTGGTAACTGGCCGACT
IGF-1 इंसुलिन की तरह विकास कारक 1 टीजीजी एटीजी सीटीसी टीटीसी एजीटी टीसीजी टीजी जीसीए एसीए सीटीसी एटीसी सीएसी एएटी जीसी
Il1-rn इंटरल्यूकिन 1 रिसेप्टर विरोधी टीटीजी टीजीसी सीएए जीटीसी टीजीजी एजीए टीजी टीटीसी टीसीए जीएजी सीजीजी एटीजी एएजी जीटी
Il4-ra इंटरल्यूकिन 4 रिसेप्टर विरोधी जीजीए टीएए जीसीए जीएसी सीसीजी एएजी सी सीटीजी जीएजी एजीए सीटीटी जीजीटी टीजीजी
इतगम इंटीग्रिन अल्फा एम CTGGTGCTCTCTCTCTCT GGCAGCTTCATTCATCATGT
Lgals3 लेक्टिन ग्लैक्टोसाइड-बाइंडिंग घुलनशील 3 जीएटी सीएसी एएटी कैट जीजीजी सीएसी एजी एटीटी जीएए जीसीजी जीजीजी जीटीटी एएए जीटी
नंबर 2 नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ 2 सीसीसी टीटीसी एएटी जीजीटी टीजीजी टीएसी एटीजी जी एसीए टीटीजी एटीसी टीसीसी जीटीजी एसीए जीसीसी
Olig2 ओलिगोडेंड्रोसाइट प्रतिलेखन कारक 2 CAGCGAGCACCCTCAAATCTA GATGGGCACTAGACACAAG
Ptgs2 प्रोस्टाग्लैंडीन एंडोपेरोक्साइड सिंथेज़ 2 टीसीए टीटीसी एसीसी एजीए कैग एटीटी जीसीटी एएजी सीजीटी टीटीजी सीजीजी टीएसी टीसीए टीटी
Rpl13 राइबोसोमल प्रोटीन एल 13 ए एसीए जीसीसी अधिनियम सीटीजी जीएजी जीएजी एए जीएजी टीसीसी जीटीटी जीजीटी सीटीटी जीएजी जीएजी जीए
Socs3 साइटोकिन 3 का शमन सीजीटी टीजीए कैग टीसीटी टीसीसी जीएसी एए टीएटी टीसीटी जीजीजीजीजीजी जीएजी एएजी एटी
Sphk1 स्फिंगोसिन किनेज 1 टीसीसी एजीए एएसी सीसीसी टीजीटी जीटीए जीसी कैग कैग टीजीटी जीसीए जीटीटी जीएटी जीए
Syp सिनैप्टोफिसिन ATCTCAGTGTCCCGATCCCA GCTGTCTTCCTGGTGTAC
Tnf-α ट्यूमर नेक्रोसिस कारक α जीसीसी टीसीटी टीसीटी सीएटी टीसीसी टीजीसी टीटी एजीजी जीटीसी टीजीजी जीसीसी एटीए जीएए सीटी

तालिका 4: आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर अनुक्रम।

उत्तेजन 1-वेल के लिए एन-कुओं के लिए
Cy3 मोती (1 सेल: 50 मोती) 8, 100, 000 X = (8, 100, 000) x n
1x PBS Y =(100+X)/n 50
FBS 50

तालिका 5: फागोसाइटिक परख के लिए मोतियों के मिश्रण की तैयारी।

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Discussion

वर्तमान कार्य चुंबकीय रूप से क्रमबद्ध सीडी 11 बी + कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्राथमिक माइक्रोग्लियल सेल संस्कृति प्रस्तुत करता है। माइक्रोग्लियल कार्यात्मक मूल्यांकन (आरटी-क्यूपीसीआर और फागोसाइटिक परख) के अलावा, माइक्रोग्लियल संस्कृति शुद्धता भी निर्धारित की गई थी।

शास्त्रीय माइक्रोग्लिया सेल संस्कृतियां आमतौर पर पी 1 या पी 2 कृंतक नवजात मस्तिष्क और कम से कम 10 दिनों के लिए एस्ट्रोसाइट्स के साथ सह-संस्कृति से उत्पन्न होती हैं। माइक्रोग्लिया को तब एक कक्षीय शेकर का उपयोग करके यांत्रिक रूप से अलग किया जाता है। माइक्रोग्लिया को विट्रो में अलग करने और कल्चर करने की विधि को पहली बार 1990 के दशक के अंत में नवजात चूहों40,41 के दिमाग से वर्णित किया गया था। तब से, इसका व्यापक रूप से माइक्रोग्लियल फेनोटाइप्स जैसे सक्रिय / आराम करने वाले माइक्रोग्लिया या प्रो-इंफ्लेमेटरी / एंटी-इंफ्लेमेटरी माइक्रोग्लिया का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, यह प्रयोग माइक्रोग्लिया को न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत न्यूरोटॉक्सिक कोशिकाओं के रूप में परिभाषित करने के लिए मौलिक रहा है। हालांकि, 2014 में, बिबर और सहयोगियों ने शास्त्रीय तरीकों का उपयोग करके विट्रो में माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के तीन महत्वपूर्णनुकसानों का वर्णन किया। (1) प्रयोग चूहे / माउस नवजात दिमाग (पी 1 / पी 2) का उपयोग करता है, और ये कोशिकाएं विवो में होने वाली सभी परिपक्वता प्रक्रियाओं से नहीं गुजरती हैं। (2) सह-संस्कृति माध्यम में, 10% एफबीएस का उपयोग किया जाता है; हालांकि, विवो में, माइक्रोग्लिया कभी भी "सामान्य" वातावरण में ऐसे घटकों का सामना नहीं करता है। (3) हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि विवो माइक्रोग्लिया में कई निरोधात्मक घटकों द्वारा नियंत्रित किया जाता हैजो संस्कृति 43,44 में मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, कई अध्ययनों (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल45 और ट्रांसक्रिप्टोमिक 46,47) ने गैर-उत्तेजित प्राथमिक माइक्रोग्लिया को "सक्रिय" के रूप में वर्णित किया।

वर्तमान विधि चुंबकीय रूप से सेल क्रमबद्ध तकनीक का उपयोग करके माइक्रोग्लिया संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक वैकल्पिक तकनीक का प्रस्ताव करती है। इस प्रोटोकॉल के साथ, माइक्रोग्लिया को बिना किसी सह-संस्कृति कदम के जानवर की मृत्यु के कुछ घंटों बाद ही काटा जाता है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया को 10-14 डीआईवी की तुलना में उत्तेजना से पहले केवल 2 दिन इन विट्रो (डीआईवी) सुसंस्कृत किया जाता है, जिसमें अन्य प्रोटोकॉल में सह-संस्कृति शामिल है। यह माइक्रोग्लियल शारीरिक स्थितियों के करीब जाने की अनुमति देता है। इन विट्रो में माइक्रोग्लिया की खेती की यह प्रक्रिया पहले 25,26,27,28,29 प्रकाशित हुई थी। वर्तमान काम ने नवजात चूहों के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया, जो उपयोग किए गए जानवरों की संख्या को कम करने और माइलिन हटाने के कदम के बिना मानकीकृत है।

प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या को कम करने के लिए, हमने ओएफ 1 तनाव में पी 8 पर काम करने का फैसला किया। ओएफ 1 तनाव में मस्तिष्क के विकास के इस चरण में, प्रति मस्तिष्क 750,000 माइक्रोग्लियल कोशिकाएं प्राप्त की गईं, जबकि उसी उम्र में प्रति सी 57बीएल 6 / जे स्ट्रेन माउस मस्तिष्क में 500,000 माइक्रोग्लियल कोशिकाएं थीं। सी 57बीएल 6 / जे स्ट्रेन को माइक्रोग्लिया कल्चर27,28 के लिए एक अलग विकास चरण में प्रकाशित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग एफएमआर 1केओ चूहों के साथ इस उत्परिवर्तन से जुड़े माइक्रोग्लिया के फागोसाइटिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा माइक्रोग्लियल सक्रियण फेनोटाइप का आकलन करने के लिए लिसमक्रे: डाइसरएफएल / + चूहों। इस प्रकार, C57BL/6 J माउस स्ट्रेन के साथ काम करना OF1 तनाव पर काम करने की तुलना में थोड़ा अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि (1) एक ही विकास चरण में प्रति मस्तिष्क कम माइक्रोग्लियल कोशिकाएं और (2) माइक्रोग्लिया की नाजुकता जो यांत्रिक सक्रियण के कारण मरने के लिए अधिक प्रवण हैं (समस्या निवारण अनुभाग देखें)।

प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति के लिए चुने गए विकास चरण के आधार पर, माइलिनेशन पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि यह पी 5 के आसपास शुरू होता है। एक शास्त्रीय माइक्रोग्लियल संस्कृति (पी 0-2 पर) में, माइलिनेशन एक मुद्दा नहीं है; हालांकि, माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए अन्य प्रकाशित तरीकों में, माइलिन को परकोल ढाल या एंटी-माइलिन एंटीबॉडी 25,26,28,29 का उपयोग करके हटा दिया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, जानवरों को पी 8 पर इच्छामृत्यु दी जाती है जब माइलिनेशन पहले ही शुरू हो चुका होता है; छर्रों को कुल्ला करने के लिए बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है, और नवगठित माइलिन को बिना किसी अतिरिक्त प्रक्रिया के हटाया जा सकता है। यह एक समस्या निवारण विधि हो सकती है (मलबा अनुभाग देखें)।

निर्माता और पहले प्रकाशित माइक्रोग्लियल चुंबकीय अलगाव ने डीएमईएम एफ -12 मीडिया का उपयोग 10% एफबीएस - 1% पी / एस 25,26,27,28,29 के साथ पूरक किया। बिबर एट अल .42 ने वर्णन किया कि माइक्रोग्लिया शायद ही कभी विवो में सीरम से संपर्क करता है। दरअसल, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बाह्य तरल पदार्थ में शायद ही कभी प्रोटीन और बायोएक्टिव कारक होतेहैं। यही कारण है कि वर्तमान प्रोटोकॉल में सीरम-मुक्त मैक्रोफेज (एसएफएम) माध्यम + 1% पी / एस का उपयोग किया जाता है।

चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) प्रोटोकॉल कुछ संशोधनोंके साथ प्रसवोत्तर चूहे माइक्रोग्लिया को अलग और कल्चर भी कर सकता है। चूहा माइक्रोग्लिया वास्तव में माइक्रोबीड-लेपित एंटी-रैट सीडी 11 बी / सी का उपयोग करके अलग किया जाता है। हालांकि, मस्तिष्क का आकार पी 8 चूहों से बड़ा होने के कारण, प्रति कॉलम प्रति पृथक्करण ट्यूब में केवल एक मस्तिष्क का उपयोग किया जाना चाहिए। माइक्रोग्लिया को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में पी 10-14 चूहे के दिमाग से अलग किया गया था, जिसमें माइलिनेशन हटाने चरण29 भी शामिल था। संस्कृति माध्यम पर पिछली टिप्पणियों के बावजूद, चूहे के माइक्रोग्लियल संस्कृति के लिए, एफ -12 मीडिया + 10% एफबीएस और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए प्रति 12-वेल प्लेट 550,000-600,000 कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है।

समस्या निवारण
पृथक्करण: तालिका 1 में वर्णित पृथक्करण मिश्रण की गणना मस्तिष्क की अधिकतम मात्रा के लिए की जाती है जिसे अलग किया जा सकता है और ओएफ 1 चूहों में पी 8 पर आगे बढ़ सकता है। यदि अधिक मस्तिष्क जोड़ा जाता है, तो चरण 3.2 के अंत में पृथक्करण पूरा नहीं किया जा सकता है, और गैर-विघटित मस्तिष्क ऊतक पाया जाएगा। इस मामले में, गैर-अलग ऊतक के साथ ट्यूब पर एनटीडीके प्रोग्राम चलाने और अन्य ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने की सिफारिश की जाती है।

या कॉलम: जैसा कि पहले वर्णित है, पृथक्करण मिश्रण की गणना मस्तिष्क के ऊतकों की अधिकतम मात्रा के लिए की जाती है जो चरण 3.5 के दौरान छन्नी से गुजर सकते हैं। यदि अधिक मस्तिष्क जोड़ा जाता है, तो निस्पंदन में अधिक समय लग सकता है, लेकिन अंततः, यह गुजर जाएगा। जब तक सभी सेल निलंबन फ़िल्टर नहीं हो जाते, तब तक छन्नी के शीर्ष पर सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करने की सिफारिश की जाती है।

चरण 3.12 के दौरान, प्रयोगकर्ता को चुंबकीय क्षेत्र के अंदर एक कॉलम के माध्यम से लेबल सेल निलंबन पारित करना होगा। प्रक्रिया के इस चरण में कॉलम को बंद किया जा सकता है (1) यदि प्रति ट्यूब बहुत अधिक मस्तिष्क ऊतक अलग हो जाता है, (2) यदि पुन: निलंबन मात्रा सही नहीं है, या (3) यदि कुछ यांत्रिक रूप से प्रेरित कोशिका मृत्यु है (कुछ डीएनए मौजूद हो सकते हैं); उस स्थिति में, 200 μL टिप के साथ दृश्यमान डीएनए को सावधानीपूर्वक हटाने की सिफारिश की जाती है।

यांत्रिक रूप से प्रेरित कोशिका मृत्यु और / या सक्रियण: यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक मुख्य चुनौती प्रस्तुत करता है: यांत्रिक सक्रियण से बचना। ऐसा करने के लिए, धीरे से पिपेट करना और सेंट्रीफ्यूजेशन गति को कम रखना महत्वपूर्ण है। यदि नहीं, तो अपरिपक्व माइक्रोग्लिया यांत्रिक तनाव के कारण मर सकता है या सक्रिय हो सकता है, जिससे आरटी-क्यूपीसीआर परिणामों में उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है।

मलबा: इस प्रक्रिया में, जानवरों को पी 8 पर इच्छामृत्यु दी जाती है जब माइलिनेशन अभी शुरू हो रहा होता है, और इसलिए माइलिन को ठीक से हटाने की कोई प्रक्रिया नहीं होती है। विकास के इस चरण में, माइलिन को आसानी से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटाया जा सकता है। इस प्रक्रिया में वर्णित रीसस्पेंशन वॉल्यूम की गणना अधिकतम माइलिन को हटाने के लिए की जाती है। यदि सम्मान नहीं किया जाता है, तो माइलिन संस्कृति कुओं में सेल मलबे के रूप में दिखाई दे सकता है। प्रयोगकर्ता इसे पूरी तरह से हटा नहीं सकता है जब संस्कृति कुओं में दूसरे दिन माध्यम बदलकर देखा जाता है। माइक्रोग्लियल कोशिकाएं इस मलबे को फागोसाइट करती हैं, जो उत्तेजना से पहले माइक्रोग्लियल सक्रियण स्थिति को प्रभावित कर सकती हैं और इस प्रकार प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकती हैं।

पहले वर्णित सभी समस्या निवारण (पृथक्करण, भरा हुआ छन्नी और / या कॉलम, यांत्रिक रूप से प्रेरित कोशिका मृत्यु और / या सक्रियण, और मलबे) सेल गिनती के दौरान प्राप्त सीडी 11 बी + कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तनशीलता पैदा कर सकते हैं (चित्रा 5 बी)। हम अंतिम सेल उपज को अनुकूलित करने के लिए इस पर बहुत ध्यान देने की सलाह देते हैं।

संदूषण: इस प्रोटोकॉल में, माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को एसएफएम माध्यम + 1% पी / एस में सुसंस्कृत किया जाता है। इसलिए, मध्यम संदूषण से बचने के लिए पी / एस जोड़ने के बाद माध्यम को 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, बाँझ परिस्थितियों में सभी प्रयोगों को यथासंभव किया जाना चाहिए।

एमआरएनए मात्रा / गुणवत्ता: हमारी टीम एमआईआरएनए या सीआरएनए अभिकर्मक पर काम करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल के मामूली संशोधन के साथ चुंबकीय अभिकर्मक का उपयोग करके ऐसे अनुप्रयोगों के साथ अत्यधिक संगत है; प्रयोगकर्ता को आरटी-क्यूपीसीआर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले एमआरएनए प्राप्त करने के लिए प्रति 12-वेल प्लेट में 700,000 कोशिकाओं को काटने की आवश्यकता होती है। यद्यपि वर्तमान अध्ययन में आरएनएसेक का प्रदर्शन नहीं किया गया है, पहले, हमारी टीम ने प्रति 12-वेल प्लेट48 में 500,000 कोशिकाओं का उपयोग करके आरएनएसेक के लिए एमआरएनए निष्कर्षण किया।

अंत में, इस प्रोटोकॉल को पुन: प्रस्तुत किया जा सकता है, और यह एक किशोर विकास चरण में माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक नया मानक होने की उम्मीद है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

आंकड़े बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे। अनुसंधान को इंसरम, यूनिवर्सिटी डी पेरिस, होराइजन 2020 (प्रेमस्टेम -874721), फोंडेशन डी फ्रांस, फोंडेशन एआरएसईपी, फोंडेशन पोर ला रेचेरचे सुर ले सेरव्यू, फोंडेशन ग्रेस डी मोनाको द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और निवेश डी'एवेनिर-एएनआर-11-आईएनबीएस-0011-न्यूराट्रिस और इनवेस्टिसमेंट डी'एवेनिर-एएनआर-17-ईयूईआर-001-EUR से अतिरिक्त अनुदान दिया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388

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Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni,… More

Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).

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