Summary
En protokol præsenteres for at evaluere, om små EV'er (sEV'er) isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold (modellering af et aspekt af præeklampsi) forstyrrer blod-hjernebarrieren hos ikke-gravide voksne hunmus.
Abstract
Cerebrovaskulære komplikationer, herunder cerebralt ødem og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde, udgør den førende årsag til moderdødelighed forbundet med præeklampsi. De underliggende mekanismer bag disse cerebrovaskulære komplikationer forbliver uklare. Men, de er forbundet med placenta dysfunktion og blod - hjerne barriere (BBB) forstyrrelse. Ikke desto mindre er forbindelsen mellem disse to fjerne organer stadig ved at blive bestemt. Stigende beviser tyder på, at moderkagen frigiver signalmolekyler, herunder ekstracellulære vesikler, i moderens cirkulation. Ekstracellulære vesikler er kategoriseret efter deres størrelse, med små ekstracellulære vesikler (sEV'er mindre end 200 nm i diameter) betragtes som kritiske signalpartikler under både fysiologiske og patologiske tilstande. I præeklampsi er der et øget antal cirkulerende sEV'er i moderens cirkulation, hvis signalfunktion ikke forstås godt. Placenta-sEV'er frigivet i præeklampsi eller fra normale graviditetsplacentas udsat for hypoxi inducerer hjerneendoteldysfunktion og forstyrrelse af BBB. I denne protokol vurderer vi, om sEV'er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold (modellering af et aspekt af præeklampsi) forstyrrer BBB in vivo.
Introduction
Ca. 70% af moderens dødsfald på grund af præeklampsi, et hypertensive graviditetssyndrom præget af nedsatte placentationsprocesser, maternel systemisk endoteldysfunktion og i alvorlige tilfælde multiorgansvigt 1,2 er forbundet med akutte cerebrovaskulære komplikationer 3,4. De fleste mødredødsfald forekommer i lav- og mellemindkomstlande5. Imidlertid er de underliggende mekanismer stadig uklare på trods af den kliniske og epidemiologiske relevans af cerebrovaskulære komplikationer forbundet med præeklampsi.
På den anden side er ekstracellulære vesikler (EV'er) (diameter ~ 30-400 nm) essentielle mediatorer af intercellulær kommunikation mellem væv og organer, herunder maternal-placenta interaktion6. Ud over proteiner og lipider på den ydre overflade transporterer EV'er last indeni (proteiner, RNA og lipider). EV'er kan kategoriseres i (1) exosomer (diameter ~ 50-150 nm, også kaldet små EV'er (sEV'er)), (2) mellemstore / store EV'er og (3) apoptotiske legemer, som adskiller sig efter størrelse, biogenese, indhold og potentiel signalfunktion. EV'ernes sammensætning bestemmes af de celler, de stammer fra, og sygdomstype7. Syncytiotrophoblastafledte EV'er udtrykker placenta alkalisk fosfatase (PLAP)8,9, som detekterer placentae-afledte cirkulerende små EV'er (PDsEV'er) under graviditet. PLAP hjælper også med at skelne ændringer i PDsEVs last og deres virkninger i præeklampsi versus normotensive graviditeter 10,11,12,13,14,15.
Placenta er blevet anerkendt som den nødvendige komponent i patofysiologien af præeklampsi16 eller cerebrale komplikationer forbundet med denne sygdom 17,18,19. Men hvordan dette fjerne organ kan fremkalde ændringer i hjernens cirkulation er ukendt. Da sEV'er spiller afgørende roller i celle-til-celle-kommunikation på grund af deres evne til at overføre bioaktive komponenter fra donor- til modtagerceller 6,20,21, har et stigende antal undersøgelser forbundet placenta sEV'er med generering af maternal endoteldysfunktion21,22,23,24, herunder hjerneendotelceller25,26hos kvinder med præeklampsi. Således kan kompromiset med hjernens endotelfunktion føre til forstyrrelse af blod-hjerne-barrieren (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulære komplikationer forbundet med præeklampsi 3,27.
Ikke desto mindre rapporterede prækliniske fund ved hjælp af rottecerebrale kar udsat for serum hos kvinder med præeklampsi28 eller humane hjerneendotelceller udsat for plasma hos kvinder med præeklampsi29, at cirkulerende faktor (er) inducerer forstyrrelse af BBB. På trods af flere kandidater med potentiale til at skade BBB til stede i moderens cirkulation under præeklampsi, såsom forhøjede niveauer af proinflammatoriske cytokiner (dvs. tumornekrosefaktor)18,28 eller vaskulære regulatorer (dvs. vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF))29,30,31 eller oxidative molekyler såsom oxiderede lipoproteiner (oxo-LDL)32,33, blandt andre34, ingen af dem etablerer en direkte forbindelse mellem moderkagen og BBB. For nylig har sEV'er isoleret fra hypoxiske placentas vist evnen til at forstyrre BBB hos ikke-gravide hunmus25. Da placenta sEV'er kan bære de fleste af de anførte cirkulerende faktorer med kapacitet til at forstyrre BBB, betragtes sEV'er som egnede kandidater til at forbinde den skadede placenta, være bærer af skadelige cirkulerende faktorer og forstyrre BBB i præeklampsi.
Denne protokol giver os mulighed for at undersøge, om sEV'er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold kan forstyrre BBB hos ikke-gravide hunmus som en proxy for forståelse af patofysiologien af cerebrale komplikationer under præeklampsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen blev udført efter principperne i Helsingfors-erklæringen og under bemyndigelse fra de respektive etiske undersøgelsesudvalg. Alle menneskelige deltagere gav deres informerede samtykke før prøveindsamling, som rapporteret tidligere25. Derudover godkendte Udvalget for Bioetik og Biosikkerhed ved Bío-Bío Universitet dette projekt (Fondecyt grant 1200250). Dyrearbejdet blev udført i overensstemmelse med kardinalprincipperne for de tre R'er i brugen af dyr i forsøg35 og i overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr udgivet af US National Institute of Health. Dyrene blev holdt i passende omgivelser på Vivarium ved universitetet i Bío-Bío. Friske placentas (n = 4) blev opnået inden for 1 time efter elektiv kejsersnit fra mødre (i alderen 28-31 år) med normale graviditeter til termin (38 til 41 ugers svangerskab). Kejsersnit blev udført på Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile, som tidligere rapporteret25. For at anvende in vivo-modellen blev 4-6 måneder gamle ikke-gravide hunmus (stamme C57BLACK/6) anvendt. De blev opdelt i tre eksperimentelle grupper: (1) kontrol (uden behandling), (2) behandlet med sEV'er fra normoxia (sEVs-Nor) og (3) behandlet med sEV'er fra hypoxiske dyrkede placentas (sEVs-Hyp), som blev brugt til at evaluere forstyrrelsen af BBB in vivo25. Alle de injicerede opløsninger var sterile. Fremstillingen af elektriske køretøjer blev også udført under aseptiske forhold og under en klasse II biosikkerhedshætte for at undgå kontaminering.
1. Placentakultur eksplanter
- For at udtrække explants af normal graviditet placentas, tjek metoden offentliggjort af Miller et al. 200536.
- Fjern forsigtigt blodpropperne fra basalpladen af den menneskelige placenta ved hjælp af steriliserede tang. Uddrag små eksplanter for at opnå en endelig vævsekstraktion på 10 g.
- Sørg for, at placentaeksplanter fjernes fra de fire kvadranter i moderens del af moderkagen. Sørg for, at devitaliseret væv og forkalkede områder udelukkes.
- For at manipulere placentavæv skal du gøre det på is, under sterile forhold og i et biosikkerhedsskab.
- Vask eksplantagerne (mindst tre gange) med rigelige mængder (fem volumener af eksplanterne) kold (4 ° C) fosfatbufferopløsning (PBS 1x, pH 7,4) for at fjerne så meget blod som muligt. Centrifuger (252 x g i 10 min) ved stuetemperatur mellem vask.
- Resuspender 10 g vasket eksplantat i 20 ml dyrkningsmedium suppleret med 2% føtalt bovint serum, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (se materialetabel).
- Sæt suspensionen i en 100 mm kulturskål. Lad eksanlæggene stå i 2 timer i en inkubator ved 37 °C med 21% oxygen og 5% CO2.
- Derefter vaskes eksplantene igen med 1x PBS ved 37 °C (tre gange). Centrifuger (252 x g i 10 min) ved stuetemperatur mellem vask.
- Endvidere resuspenderes vævet i 20 ml kulturmedium, der tidligere er udtømt for nanopartikler.
BEMÆRK: Ved nanopartikeludtømning udføres ultracentrifugering (120.000 x g i 18 timer ved stuetemperatur) og mikrofiltrering (0,22 μm filter). - Opdel de resuspenderede eksplanter i to kulturskåle (100 mm). Hver kulturskål skal indeholde 10 ml resuspenderede eksplanter.
- Derefter anbringes en af skålene indeholdende placentaeksplanter under standardkulturbetingelser (37 °C med 8% oxygen og 5% CO2), mens den anden anbringes i et hypoxisk kammer med 1%O2.
BEMÆRK: (VALGFRIT) Analyse af vævslevedygtighed kan udføres ved hjælp af de samme vævsekstraktioner og 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromidanalyse (MTT-assay) som beskrevet andetsteds37,38. Brug total proteinkoncentration målt i eksplantathomogenaterne til at normalisere MTT-værdier. - Efter 18 timer i kultur høstes eksplanternes konditionerede medier i et nyt 15 ml rør.
BEMÆRK: På dette trin kan konditionerede medier fryses (-80 °C) i en længere periode (uger).
2. Isolering af sEV'er afledt af placenta
- Sesoler EV'er fra det konditionerede substrat ved hjælp af differentialcentrifugerings- og mikrofiltreringsprotokollen efter tidligere offentliggjorte rapporter25,39.
- Udfør sekventiel centrifugering for det høstede konditionerede medium. Centrifugeringernes sekventielle trin er (1) 300 x g i 10 minutter, (2) 2000 x g i 10 minutter, (3) 10.000 x g i 30 minutter og (4) 120.000 x g i 2 timer. Udfør centrifugeringerne stuetemperatur.
- Ved alle disse centrifugeringer opsamles supernatanten forsigtigt ved hjælp af en 20-100 μL pipette og pillen kasseres.
- Når det er gjort, ledes den sidst opsamlede supernatant gennem et 0,22 μm filter (se materialetabel). Derefter udføres en yderligere centrifugering ved 120.000 x g i 18 timer ved stuetemperatur.
- Derefter kasseres supernatanten, mens pelletten (som indeholder placenta-sEV'er) resuspenderes i 500 μL PBS (pH 7,4) og ledes igen gennem et 0,22 μm filter. Udfør til sidst en sidste centrifugering ved 120.000 x g i 3 timer ved stuetemperatur.
- Derefter resuspenderes pellet (som indeholder placenta-sEV'er) i 500 μL PBS (pH 7,4, tidligere udtømt for sEV'er) og passerer gennem et 0,22 μm filter.
- Mærk prøverne som lager af sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) eller sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
BEMÆRK: Forbered 50-100 μL alikvoter af de isolerede sEV'er til yderligere forsøg. Små elbiler kan opbevares ved -80 °C i en længere periode (måneder). - Karakteriser placenta sEV'erne efter størrelse, antal og sEVs proteinmarkør, som tidligere rapporteret25. Den ideelle gennemsnitlige partikeldiameter af sEV'er er 50-150 nm.
BEMÆRK: sEVs karakterisering inkluderer positiv påvisning af CD63, Tsg101, Alix og HSP70 (dvs. at karakterisere sEVs population beriget med exosomer). Brug også VAP som markør for placenta oprindelse25. - Mål den samlede mængde protein i sEVs-opløsningen ved hjælp af BCA-proteinanalysesættet ved at følge producentens anvisninger (se materialetabellen).
BEMÆRK: Figur 1 viser en oversigt over placenta eksplantatkultur og ekstracellulær vesikelisolering.
3. Injektion af mus
- Bedøv dyret i et bedøvelsesinduktionskammer med 5% isofluranfordeling (se materialetabel). Kontroller anæstesiniveauet via en tåklemme.
- Efter ~ 40 s skal du sætte musen i anæstesisystemet ved hjælp af en ansigtsmaske og opretholde et anæstesiniveau på 2% isofluran.
- Derefter anbringes dyret på en varmeplatform (se materialetabellen) ved en stuetemperatur på 28 °C. Hold øjnene smurt med kunstige tårer.
- Før injektion fortyndes placenta-sEV'er (200 μg total protein) med fosfatbuffer (pH, 7,4), indtil der opnås et slutvolumen på 70 μL.
- Desinficer injektionsområdet med 70% ethanol og vatpinde. Sørg for at bruge en insulinsprøjte med en 30 G kanyle til at injicere sEVs opløsningen.
BEMÆRK: Sprøjten kan placeres på varmeplatformen i 5 minutter for at opnå en fysiologisk temperatur. - Injicer derefter opløsningen i den ydre jugular vene. Dette trin kræver særlig træning.
BEMÆRK: Proceduren skal udføres forsigtigt, langsomt trække nålen tilbage og forsigtigt aspirere til tegn på blodrefluks. - Efter injektion påføres let tryk på det injicerede område i ~15 s med en tør vatpind. Derefter returneres dyrene til deres respektive bur.
- Sørg for at evaluere bevidsthed og adfærd i 15 min. En indikator for bevidsthedsopnåelse er dyrets genopretning af total motoraktivitet.
BEMÆRK: Sørg for at holde en varm temperatur i dyrets bure.
4. Hurtig murin koma og adfærdsskala (RMCBS)
- Brug RMCBS til at evaluere dyrenes neurologiske og trivselsparametre40.
BEMÆRK: RMCBS giver mulighed for en hurtig evaluering (~ 3 min) med minimal dyrestress på grund af operatørintervention. RMCBS har ti parametre (hver score er 0-2). - Evaluer musens velbefindende med RMCBS-skalaen ved 0 timer (før injektion af sEV'er) og 3 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer efter injektion.
BEMÆRK: Udfør analyse af claudin-5 (6 timer efter injektion af sEV'er) og Evans blå ekstravasation (24 timer efter injektion af sEV'er) for at evaluere forstyrrelsen af BBB (figur 2).
5. Analyse af Evans blå ekstravasation
- Efter injektion af placenta-sEV'er (24 timer) bedøves musene som beskrevet i trin 3.1.
- Forbered Evans blå opløsning (2%, fortyndet i fosfatbufferopløsning, 1x) (se materialetabel).
- Brug retro-orbital adgang25 til at injicere Evans blå opløsning ved 2 ml / kg.
- Lad Evans blå opløsning cirkulere i 20 minutter under vedligeholdelse af anæstesi.
- Udfør derefter intrakardial perfusion efter tidligere beskrevet protokol41 med saltopløsning (~ 3 ml, 0,9%, w / v) for at fjerne Evans blå farvestof fra kredsløbet. Dette trin er obligatorisk.
BEMÆRK: For denne procedure skal du øge anæstesien til 5% og verificere et dybt anæstesiplan (dvs. drastisk reduktion i respirationsfrekvensen). - Udsæt hjertet via medial thoracotomi41 (figur 3).
- Derefter fastgøres hele dyret med en intrakardial infusion af paraformaldehydopløsning (4% i PBS, v / v).
BEMÆRK: Kontroller halens stivhed for at overvåge den passende fiksering. - Når fikseringen er afsluttet, skal du forsigtigt udtrække hjernen, veje den og fotografere den41. Tag billeder med hele hjernen tæt på en lineal42.
- Sæt derefter hjernen i en hjernemusskiver (se materialetabel).
- Disseker hjernen i ni sektioner, kran-kaudal, herunder cerebellum (100 μm hver sektion).
- Efter dissektion visualiseres og tages billeder af hjerneskiverne i et stereozoommikroskop (se materialetabel).
- Brug de optagne billeder til at kvantificere Evans blå ekstravasation ved hjælp af ImageJ-software (se materialetabel).
BEMÆRK: For at analysere tilstedeværelsen af Evans blå farvestof skal du indstille Evans blå værdier ved hjælp af en positiv kontrol af hjernesektionen (fra et dyrekontroldyr injiceret med farvestof, men uden intrakardial perfusion). Evans blå værdier opnået fra positiv kontrol er generelt mellem 75 og 110 i intensitetshistogrammet for den blå kanal (figur 4). - Sørg for, at hjernebilleder analyseres blindt af den respektive eksperimentelle gruppe for at undgå observatørbias. Alternativt kan du kvantificere Evans blå ekstravasation ved hjernehomogenisering efterfulgt af spektroskopi43.
BEMÆRK: I separate eksperimenter ved hjælp af frisk isolerede hjerner fra sEV'er injicerede mus (6 timer) analyseres proteinniveauerne af claudin 5 (CLND-5) (se materialetabel), et kritisk tæt kryds involveret i tætheden af BBB44 (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol evaluerer kapaciteten af sEV'er afledt af placentas dyrket i hypoxi for at forstyrre BBB hos ikke-gravide mus. Denne metode gør det muligt for en bedre at forstå den potentielle forbindelse mellem moderkagen og hjernen under normale og patologiske forhold. Især kan denne metode udgøre en proxy til analyse af placenta sEVs deltagelse i begyndelsen af cerebrale komplikationer i præeklampsi.
I modsætning til mus injiceret med sEVs-Nor, viser mus injiceret med sEVs-Hyp et progressivt fald i den neurologiske score indtil 24 timer (tabel 1), hvilket tyder på sEVs-Hyp-kapaciteten til at forringe hjernefunktionen.
Mushjerner fra den injicerede gruppe sEVs-Hyp har også højere frisk vægt end dem, der er isoleret fra mus injiceret med sEVs-Nor eller kontrolmus (henholdsvis 0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g), hvilket kan udgøre en grov indikator for hjerneødem45.
Kompatibel med dette fund giver denne protokol mulighed for at identificere Evans blå ekstravasation som en indikator for forstyrrelse af BBB. I den henseende har hjerner fra mus injiceret med sEVs-Hyp højere Evans blå ekstravasation end hjerner fra sEVs-Nor-gruppen (figur 5A).
Selvom den underliggende mekanisme for forstyrrelse af BBB induceret af sEVs-Hyp ikke blev analyseret med denne protokol, indikerer resultaterne også, at sEVs-Hyp-injicerede mus viste reducerede proteinmængder af CLND-5 i de områder, hvor BBB var mest påvirket (dvs. bageste områder) (figur 5B). Derfor er det muligt, at sEVs-hyp forringer ekspressionen af funktionen af dette kritiske endoteltætte forbindelsesprotein.
Figur 1: Placenta-eksplantatkultur og ekstracellulær vesikelisolationsprotokol. (A) Normale placenta explant kulturer. (B) Explants fordeles i to betingelser for biogenese af placenta små ekstracellulære vesikler (sEV'er). Normoxia (sEVs-Nor, 8%O2) eller hypoxi (sEVs-Hyp, 1%O2) i 18 timer. (C) Konditionerede medier høstes, filtreres og centrifugeres for at eliminere celleaffald. D) EV'er isoleres ved ultracentrifugeringer. (E) sEV'er karakteriseres ved hjælp af nanosporingsanalyse og western blot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: In vivo evaluering af blod-hjerne barriere forstyrrelse protokol. Der anvendes ikke-drægtige C57BL6/J-mus, 4-6 måneder gamle. (A) Via ekstern halsvene fik dyrene sEV'er (200 μg total protein) isoleret fra normoxiske (sEVs-Nor, 8%O2) eller hypoxiske (sEVs-Hyp, 1%O2) placentakulturer. RMCBS overvåges 0-24 timer efter injektion. (B) 6 timer efter injektion af sEV'er ekstraheres hjerner og opdeles i ni segmenter til proteinekstraktion. Claudin 5 (CLDN5) analyseres i homogenater af disse ni sektioner. (C) Evans blå ekstravasationsanalyse (24 timer efter injektion af sEV'er) blev analyseret efter retroorbital punkteringsinjektion i hvert af de ni segmenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fotodokumentarer af Evans blå farvestof og intrakardial perfusionsprotokol. (A) Mus modtog Evans blå via retro-orbital injektion. (Venstre) Dyr før og (højre) efter injektion (15 s) af Evans blå. (B) Thoracotomi til udførelse af intrakardial perfusion af fosfatbufferopløsning (1x PBS) og paraformaldehyd (4% PFA). Den venstre ventrikel er spids med nålens spids. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af Evans blå ekstravasation efter injektion af sEV'er. (A) Repræsentativt billede af hele hjernen, der viser Evans blå ekstravasation. Den stiplede linje repræsenterer ni sektioner opnået fra hele hjernen. (B) Hjerne dissekeret ved hjælp af en hjernemus skiver. (C) Repræsentative billeder af hjerneskiver 24 timer efter injektion af sEV. Kontrol (CTL), placenta i normoxiske (sEVs-Nor) eller hypoxiske tilstande (sEVs-Hyp). Skalabjælke = 0,4 cm. (D) Digital disposition af hjerneskive ved hjælp af ImageJ. E) Histogram i den blå kanal. Værdier mellem 75-110 er forbundet med Evans blå ekstravasation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Evans blå ekstravasation og claudin-5 niveauer hos mus injiceret med sEV'er isoleret fra placentaeksplanter. (A) Procentdel af Evans blå (EB) ekstravasation under hensyntagen til hele hjernesektionerne. Kontrol (CTL, blå), placenta i normoxiske (sEVs-Nor, rød) eller hypoxiske tilstande (sEVs-Hyp, grøn). (B) Relative niveauer af claudin 5 (CLDN5) i de ni hjernesektioner blev opnået fra de tre eksperimentelle grupper. β-actin bruges som belastningskontrol. Værdier er middelværdi ± interkvartilt område. Hver prik repræsenterer et individuelt eksperimentelt emne. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; ANOVA test efterfulgt af Bonferroni post-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Tidspunkt (h) | Kontrol | sEVs-Normoxia | sEVs-hypoxi | ANOVA |
| 0 | 18.75 ± 0.250 | 18,5 ± 0,288 | 18.75 ± 0.250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19.25 ± 0.750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | 16.75 ± 1.109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17.75 ± 0.250 | 10.25 ± 0.853*α | <0.0001 |
| *p < 0,01 versus kontrol. αp < 0,01 versus sEVs-Normoxia | ||||
Tabel 1: Hurtig murine koma og adfærdsskala (RMCBS) efter 24 timer efter injektion af sEV'er. Scoren udtrykkes som gennemsnitlig ± SEM. Dyrs score tættest på 20 er standard, mens jo lavere score, jo højere dysfunktion af CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse afslører frisk indsigt i potentiel skade som følge af sEV'er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold om forstyrrelsen af gnaverblod-hjernebarrieren. Den patologiske mekanisme indebærer en reduktion i CLND-5 i den bageste hjerneregion25.
Tidligere undersøgelser har vist, at plasma-sEV'er fra personer med præeklampsi inducerer endoteldysfunktion i forskellige organer ved hjælp af in vitro-modeller 46,47. Denne undersøgelse undersøgte især blod-hjerne-barrieren og gav et nyt perspektiv på sEV'er isoleret fra hypoxi-dyrket placenta, hvilket forstyrrer denne vitale barriere. Disse opdagelser introducerer et nyt forskningsområde, hvor sEV'er kan tjene som en kommunikationskanal mellem moderkagen og hjernen i både normale og patologiske scenarier, som præeklampsi.
Den præsenterede protokol er ligetil, men flere kritiske trin fortjener omtale. Denne protokol kræver friske moderkager inden for 1 time efter levering. Vi fraråder også at forlænge dyrkningsperioden ud over 24 timer for at forhindre vævsnedbrydning. Denne protokol mindsker potentiel kontaminering fra elbiler produceret af moderkager hos mus. Digital analyse af Evans blå ekstravasation er tidskrævende. Desuden er Evans blå farvning mindre iøjnefaldende efter hjernesektion. Derfor anbefales en indledende opsætning til identifikation af det blå område ved hjælp af en positiv kontrol. En negativ kontrol, såsom en hjerne fra en mus, der ikke udsættes for Evans blå injektion, kan også anvendes. Blind analyse af eksperimentelle grupper er afgørende for at afværge potentiel observatørbias.
Der kan opstå flere udfordringer under denne protokol. En væsentlig begrænsning ligger i biologisk variabilitet, der stammer fra både humane placentas og injicerede mus. For at sikre reproducerbarheden af Evans blå ekstravasationseksperimenter foreslås etablering af sEV-doser isoleret fra humane placentas. Vi valgte en dosis på 200 μg total protein; Denne mængde kan dog svinge baseret på vesikelrenhed, effektiviteten af jugularinjektion, Evans blå administration, dens clearance fra kredsløbssystemet og ikke mindst den biologiske virkning af sEV'er i betragtning af deres indhold.
De cellulære mekanismer, hvormed sEV'er fra den menneskelige placenta kan forstyrre blod-hjerne-barrieren, kræver yderligere eksperimenter. Ikke desto mindre har denne metode relevans og antyder potentiel kommunikation mellem moderkagen og hjernen, hvilket berettiger yderligere udforskning. Derfor tilskyndes fremtidige undersøgelser, der koncentrerer sig om sEV'er og deres interaktioner med blod-hjerne-barrieren samt virkningen af deres last på neuronalt væv. Hvorvidt svækkelse af blod-hjerne-barrieren fører til varige konsekvenser for moderens hjerne, berettiger yderligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke forskerne i GRIVAS Health for deres værdifulde input. Også jordemødre og klinisk personale fra obstetrik og gynækologi service tilhører Hospital de Chillan, Chile. Grundlagt af Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M.
- Hammer, E. S., Cipolla, M. J.
- Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
- Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
- Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
- Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
- Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
- Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
- Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
- Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
- Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
- Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
- Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
- Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
- Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
- Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
- Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
- Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
- Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
- Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
- Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
- Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
- Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
- Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
- Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
- Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
- Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
- Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
- Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
- Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
- Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
- Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
- Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
- Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).
