Summary
Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.
Abstract
Le complicanze cerebrovascolari, tra cui l'edema cerebrale e l'ictus ischemico ed emorragico, costituiscono la principale causa di mortalità materna associata alla preeclampsia. I meccanismi alla base di queste complicanze cerebrovascolari rimangono poco chiari. Tuttavia, sono collegati alla disfunzione placentare e all'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB). Tuttavia, la connessione tra questi due organi distanti è ancora in fase di determinazione. Prove crescenti suggeriscono che la placenta rilascia molecole di segnalazione, comprese le vescicole extracellulari, nella circolazione materna. Le vescicole extracellulari sono classificate in base alle loro dimensioni, con piccole vescicole extracellulari (sEV di diametro inferiore a 200 nm) considerate particelle di segnalazione critiche sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Nella preeclampsia, c'è un aumento del numero di sEV circolanti nella circolazione materna, la cui funzione di segnalazione non è ben compresa. Le sEV placentari rilasciate nella preeclampsia o dalle placente della gravidanza normale esposte all'ipossia inducono disfunzione endoteliale cerebrale e interruzione della BBB. In questo protocollo, valutiamo se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la BBB in vivo.
Introduction
Circa il 70% dei decessi materni dovuti a preeclampsia, una sindrome gravidica ipertensiva caratterizzata da alterazione dei processi di placentazione, disfunzione endoteliale sistemica maternae, nei casi più gravi, insufficienza multiorgano 1,2, sono associati a complicanze cerebrovascolari acute 3,4. La maggior parte dei decessi materni si verifica nei paesi a basso e medio reddito5. Tuttavia, i meccanismi sottostanti non sono ancora chiari nonostante la rilevanza clinica ed epidemiologica delle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia.
D'altra parte, le vescicole extracellulari (EV) (diametro ~30-400 nm) sono mediatori essenziali della comunicazione intercellulare tra tessuti e organi, compresa l'interazione materno-placentare6. Oltre alle proteine e ai lipidi sulla superficie esterna, le vescicole extracellulari trasportano il carico all'interno (proteine, RNA e lipidi). Le vescicole extracellulari possono essere classificate in (1) esosomi (diametro ~50-150 nm, chiamati anche piccole vescicole extracellulari (sEV)), (2) vescicole extracellulari medie/grandi e (3) corpi apoptotici, che differiscono per dimensioni, biogenesi, contenuto e potenziale funzione di segnalazione. La composizione delle vescicole extracellulari è determinata dalle cellule da cui hanno origine e dal tipo di malattia7. Le vescicole extracellulari derivate dal sinciziotrofoblasto esprimono la fosfatasi alcalina placentare (PLAP)8,9, che rileva le piccole vescicole extracellulari circolanti derivate dalla placenta (PDsEV) in gravidanza. Inoltre, il PLAP aiuta a discernere i cambiamenti nel carico di PDsEVs e i loro effetti nella preeclampsia rispetto alle gravidanze normotese 10,11,12,13,14,15.
La placenta è stata riconosciuta come il componente necessario nella fisiopatologia della preeclampsia16 o delle complicanze cerebrali associate a questa malattia 17,18,19. Tuttavia, non si sa come questo organo distante possa indurre alterazioni nella circolazione cerebrale. Poiché le sEV svolgono un ruolo fondamentale nella comunicazione cellula-cellula grazie alla loro capacità di trasferire componenti bioattivi dalle cellule donatrici a quelle riceventi 6,20,21, un numero crescente di studi ha associato le sEV placentari alla generazione di disfunzione endoteliale materna 21,22,23,24, comprese le cellule endoteliali cerebrali 25,26nelle donne con preeclampsia. Pertanto, la compromissione della funzione endoteliale cerebrale può portare all'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB), una componente critica nelle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia 3,27.
Tuttavia, i risultati preclinici che hanno utilizzato vasi cerebrali di ratto esposti al siero di donne con preeclampsia28 o cellule endoteliali cerebrali umane esposte al plasma di donne con preeclampsia29 hanno riportato che i fattori circolanti inducono l'interruzione della BBB. Nonostante diversi candidati con il potenziale di danneggiare la BBB presente nella circolazione materna durante la preeclampsia, come livelli elevati di citochine proinfiammatorie (cioè il fattore di necrosi tumorale)18,28 o regolatori vascolari (cioè il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF))29,30,31, o molecole ossidative come le lipoproteine ossidate (oxo-LDL)32,33, tra gli altri34, nessuno di essi stabilisce una connessione diretta tra la placenta e la BBB. Recentemente, le sEV isolate da placente ipossiche hanno mostrato la capacità di interrompere la BBB in topi femmina non gravidi25. Poiché le sEV placentari possono trasportare la maggior parte dei fattori circolanti elencati con la capacità di interrompere la BBB, le sEV sono considerate candidati adatti per collegare la placenta lesa, essere il vettore di fattori circolanti dannosi e interrompere la BBB nella preeclampsia.
Questo protocollo ci permette di indagare se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche possono interrompere la BBB in topi femmine non gravidi come proxy per comprendere la fisiopatologia delle complicanze cerebrali durante la preeclampsia.
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Protocol
La ricerca è stata condotta seguendo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki e sotto l'autorizzazione dei rispettivi Comitati di Revisione Etica. Tutti i partecipanti umani hanno dato il loro consenso informato prima della raccolta del campione, come riportato in precedenza25. Inoltre, il Comitato per la Bioetica e la Biosicurezza dell'Università Bío-Bío ha approvato questo progetto (borsa di studio Fondecyt 1200250). Il lavoro sugli animali è stato condotto in conformità con i principi cardine delle tre R nell'uso degli animali nella sperimentazione35 e secondo le raccomandazioni delle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicate dal National Institute of Health degli Stati Uniti. Gli animali venivano tenuti in ambienti appropriati presso il Vivarium dell'Università di Bío-Bío. Le placente fresche (n = 4) sono state ottenute entro 1 ora dopo il taglio cesareo elettivo da madri (di età compresa tra 28 e 31 anni) con gravidanze normali a termine (da 38 a 41 settimane di gestazione). I tagli cesarei sono stati eseguiti presso l'Ospedale Clinico Herminda Martin, Chillan, Cile, come precedentemente riportato25. Per applicare il modello in vivo , sono stati utilizzati topi femmine non gravide di 4-6 mesi (ceppo C57BLACK/6). Sono stati divisi in tre gruppi sperimentali: (1) di controllo (senza trattamento), (2) trattati con sEV da normossia (sEVs-Nor) e (3) trattati con sEV da placenta in coltura ipossica (sEVs-Hyp), che sono stati utilizzati per valutare l'interruzione della BBB in vivo25. Tutte le soluzioni iniettate erano sterili. Inoltre, la preparazione delle sEV è stata eseguita in condizioni asettiche e sotto una cappa di biosicurezza di classe II per evitare contaminazioni.
1. Espianti di coltura placentare
- Per estrarre gli espianti di placente normali della gravidanza, controllare il metodo pubblicato da Miller et al. 200536.
- Rimuovere con cautela i coaguli dalla placca basale della placenta umana utilizzando una pinza sterilizzata. Estrarre piccoli espianti per ottenere un'estrazione tissutale finale di 10 g.
- Assicurarsi che gli espianti placentari vengano rimossi dai quattro quadranti della porzione materna della placenta. Assicurarsi che i tessuti devitalizzati e le aree calcificate siano esclusi.
- Per manipolare il tessuto placentare, farlo su ghiaccio, in condizioni sterili e all'interno di un armadio di biosicurezza.
- Lavare gli espianti (almeno tre volte) con abbondanti quantità (cinque volumi di espianti) di soluzione tampone fosfato fredda (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) per rimuovere quanto più sangue possibile. Centrifugare (252 x g per 10 min) a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro.
- Risospendere 10 g di espianti lavati in 20 mL di terreno di coltura integrato con il 2% di siero fetale bovino, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (vedere Tabella dei materiali).
- Mettere la sospensione in un piatto di coltura da 100 mm. Lasciare gli espianti per 2 ore in incubatrice a 37 °C con il 21% di ossigeno e il 5% di CO2 .
- Successivamente, rilavare gli espianti con 1x PBS a 37 °C (tre volte). Centrifugare (252 x g per 10 min) a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro.
- Inoltre, risospendere il tessuto in 20 mL di terreno di coltura precedentemente impoverito di nanoparticelle.
NOTA: Per l'esaurimento delle nanoparticelle, eseguire l'ultracentrifugazione (120.000 x g per 18 ore a temperatura ambiente) e la microfiltrazione (filtro da 0,22 μm). - Dividere gli espianti risospesi in due piastre di coltura (100 mm). Ogni capsula di coltura deve contenere 10 ml di espianti risospesi.
- Successivamente, posizionare una delle piastre contenenti espianti placentari in condizioni di coltura standard (37 °C con l'8% di ossigeno e il 5% di CO2 ), mentre l'altra viene posta in una camera ipossica con l'1% di O2 .
NOTA: (FACOLTATIVO) L'analisi della vitalità tissutale può essere eseguita utilizzando le stesse estrazioni tissutali e il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (saggio MTT) come descritto altrove37,38. Utilizzare la concentrazione proteica totale misurata negli omogenati degli espianti per normalizzare i valori di MTT. - Dopo 18 ore di coltura, raccogliere i terreni condizionati degli espianti in una nuova provetta da 15 ml.
NOTA: A questo punto, i terreni condizionati possono essere congelati (-80 °C) per un periodo prolungato (settimane).
2. Isolamento delle sEV di derivazione placentare
- Isolare le sEV dal mezzo condizionato utilizzando il protocollo di centrifugazione differenziale e microfiltrazione seguendo i rapporti precedentemente pubblicati 25,39.
- Eseguire la centrifugazione sequenziale per il terreno condizionato raccolto. Le fasi sequenziali delle centrifugazioni sono (1) 300 x g per 10 min, (2) 2000 x g per 10 min, (3) 10.000 x g per 30 min e (4) 120.000 x g per 2 h. Eseguire le centrifugazioni a temperatura ambiente.
- In tutte queste centrifugazioni, utilizzando una pipetta da 20-100 μL, raccogliere con cura il surnatante e scartare il pellet.
- Una volta fatto, far passare l'ultimo surnatante raccolto attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali). Successivamente, eseguire un'ulteriore centrifugazione a 120.000 x g per 18 ore a temperatura ambiente.
- Successivamente, scartare il surnatante risospendendo il pellet (che contiene sEV placentari) in 500 μL di PBS (pH 7,4) e passare nuovamente attraverso un filtro da 0,22 μm. Infine, eseguire un'ultima centrifugazione a 120.000 x g per 3 h a temperatura ambiente.
- Successivamente, risospendere il pellet (che contiene sEV placentari) in 500 μL di PBS (pH 7,4, precedentemente impoverito di sEV) e passare attraverso un filtro da 0,22 μm.
- Etichettare i campioni come stock di sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) o sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
NOTA: Preparare aliquote da 50-100 μL delle sEV isolate per ulteriori esperimenti. I piccoli veicoli elettrici possono essere conservati a -80 °C per un periodo prolungato (mesi). - Caratterizzare le sEV placentari in base alle dimensioni, al conteggio e al marcatore proteico delle sEV, come riportato in precedenza25. Il diametro medio ideale delle particelle delle sEV è di 50-150 nm.
NOTA: la caratterizzazione delle sEVs include la rilevazione positiva di CD63, Tsg101, Alix e HSP70 (ad esempio, per caratterizzare la popolazione di sEVs arricchita negli esosomi). Inoltre, utilizzare PLAP come marcatore dell'origine placentare25. - Misurare la quantità totale di proteine nella soluzione di sEVs utilizzando il kit per il test delle proteine BCA seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: La Figura 1 mostra una panoramica della coltura dell'espianto placentare e dell'isolamento delle vescicole extracellulari.
3. Iniezione di topi
- Anestetizzare l'animale in una camera di induzione anestetica con distribuzione di isoflurano al 5% (vedi Tabella dei materiali). Verificare il livello di anestesia pizzicando le dita dei piedi.
- Dopo ~40 s, inserire il topo nel sistema di anestesia utilizzando una maschera facciale e mantenere un livello di anestesia del 2% di isoflurano.
- Successivamente, posizionare l'animale su una piattaforma riscaldante (vedi Tabella dei materiali) a una temperatura ambiente di 28 °C. Mantieni gli occhi lubrificati con lacrime artificiali.
- Prima dell'iniezione, diluire le sEV placentari (200 μg di proteina totale) con tampone fosfato (pH, 7,4) fino a raggiungere un volume finale di 70 μL.
- Disinfettare l'area di iniezione utilizzando etanolo al 70% e tamponi di cotone. Assicurarsi di utilizzare una siringa da insulina con un ago da 30 G per iniettare la soluzione di sEVs.
NOTA: La siringa può essere posizionata sulla piattaforma riscaldante per 5 min per acquisire una temperatura fisiologica. - Quindi, iniettare la soluzione nella vena giugulare esterna. Questo passaggio richiede una formazione speciale.
NOTA: La procedura deve essere eseguita con cautela, ritraendo lentamente l'ago e aspirando delicatamente per evidenziare il reflusso sanguigno. - Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione sull'area iniettata per ~15 s con un batuffolo di cotone asciutto. Dopodiché, riporta gli animali nelle rispettive gabbie.
- Assicurati di valutare la coscienza e il comportamento per 15 minuti. Un indicatore del raggiungimento della coscienza è il recupero dell'attività motoria totale da parte dell'animale.
NOTA: Assicurarsi di mantenere una temperatura calda nelle gabbie degli animali.
4. Coma murino rapido e scala comportamentale (RMCBS)
- Utilizzare l'RMCBS per valutare i parametri neurologici e di benessere degli animali40.
NOTA: RMCBS consente una valutazione rapida (~ 3 min) con il minimo stress dell'animale dovuto all'intervento dell'operatore. RMCBS ha dieci parametri (ogni punteggio è 0-2). - Valutare il benessere del topo con la scala RMCBS a 0 ore (prima dell'iniezione di sEV) e 3 ore, 6 ore, 12 ore e 24 ore dopo l'iniezione.
NOTA: Eseguire l'analisi della claudina-5 (a 6 ore dopo l'iniezione di sEVs) e dello stravaso blu di Evan (a 24 ore dopo l'iniezione di sEVs) per valutare l'interruzione della BBB (Figura 2).
5. Analisi dello stravaso blu di Evan
- Dopo l'iniezione placentare di sEVs (24 ore), anestetizzare i topi come descritto al punto 3.1.
- Preparare la soluzione Evan's Blue (2%, diluita in soluzione tampone fosfato, 1x) (vedi Tabella dei materiali).
- Utilizzando l'accesso retroorbitale25, iniettare la soluzione Blue di Evan a 2 mL/kg.
- Lasciare circolare la soluzione blu di Evan per 20 minuti sotto anestesia.
- Successivamente, eseguire la perfusione intracardiaca seguendo il protocollo41 precedentemente descritto con soluzione salina (~3 ml, 0,9%, p/v) per rimuovere il colorante blu di Evan dalla circolazione. Questo passaggio è obbligatorio.
NOTA: Per questa procedura, aumentare l'anestesia al 5% e verificare un piano profondo di anestesia (cioè una drastica riduzione della frequenza respiratoria). - Esporre il cuore tramite toracotomia mediale41 (Figura 3).
- Successivamente, fissare l'intero animale con un'infusione intracardica di soluzione di paraformaldeide (4% in PBS, v/v).
NOTA: Controllare la rigidità della coda per monitorare il fissaggio appropriato. - Inoltre, una volta completata la fissazione, estrarre con cura il cervello, pesarlo e fotografarlo41. Scatta foto con tutto il cervello vicino a un righello42.
- Quindi, metti il cervello in un'affettatrice per mouse cerebrale (vedi Tabella dei materiali).
- Sezionare il cervello in nove sezioni, gru-caudale, compreso il cervelletto (100 μm ciascuna).
- Dopo la dissezione, visualizzare e acquisire immagini delle fette di cervello in un microscopio stereo-zoom (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzare le immagini acquisite per quantificare lo stravaso blu di Evan utilizzando il software ImageJ (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Per analizzare la presenza del colorante blu di Evan, impostare i valori del blu di Evan utilizzando un controllo positivo della sezione cerebrale (da un animale di controllo a cui è stato iniettato il colorante ma senza perfusione intracardica). I valori di blu di Evan raggiunti dal controllo positivo sono generalmente compresi tra 75 e 110 nell'istogramma di intensità del canale blu (Figura 4). - Assicurarsi che le immagini cerebrali siano analizzate alla cieca dal rispettivo gruppo sperimentale per evitare pregiudizi dell'osservatore. In alternativa, quantificare lo stravaso blu di Evan mediante omogeneizzazione cerebrale seguita da spettroscopia43.
NOTA: In esperimenti separati, utilizzando cervelli appena isolati da topi iniettati con sEV (6 ore), analizzare i livelli proteici di claudina 5 (CLND-5) (vedi Tabella dei materiali), una giunzione stretta critica coinvolta nella tenuta della BBB44 (Figura 5).
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Representative Results
Questo protocollo valuta la capacità delle sEV derivate da placente coltivate in ipossia di interrompere la BBB in topi non gravidi. Questo metodo permette di comprendere meglio la potenziale connessione tra la placenta e il cervello in condizioni normali e patologiche. In particolare, questo metodo può costituire un proxy per analizzare la partecipazione delle sEV placentari all'insorgenza di complicanze cerebrali nella preeclampsia.
Contrariamente ai topi iniettati con sEVs-Nor, i topi iniettati con sEVs-Hyp mostrano un progressivo declino del punteggio neurologico fino a 24 ore (Tabella 1), il che suggerisce la capacità di sEVs-Hyp di compromettere la funzione cerebrale.
Inoltre, i cervelli dei topi del gruppo iniettato sEVs-Hyp hanno un peso fresco più elevato rispetto a quelli isolati da topi iniettati con sEVs-Nor o topi di controllo (0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g, rispettivamente), che possono costituire un indicatore macroscopico di edema cerebrale45.
Compatibile con questa scoperta, questo protocollo consente di identificare lo stravaso blu di Evan come un indicatore di interruzione della BBB. A questo proposito, i cervelli di topi iniettati con sEVs-Hyp hanno uno stravaso blu di Evan più elevato rispetto ai cervelli del gruppo sEVs-Nor (Figura 5A).
Sebbene il meccanismo sottostante di interruzione della BBB indotto da sEVs-Hyp non sia stato analizzato con questo protocollo, i risultati indicano anche che i topi iniettati con sEVs-Hyp hanno mostrato quantità ridotte di proteine di CLND-5 nelle aree in cui la BBB era più colpita (cioè le aree posteriori) (Figura 5B). Pertanto, è possibile che sEVs-hyp comprometta l'espressione della funzione di questa proteina critica della giunzione stretta endoteliale.
Figura 1: Coltura dell'espianto placentare e protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari. (A) Colture normali di espianto di placenta. (B) Gli espianti sono distribuiti in due condizioni per la biogenesi delle piccole vescicole extracellulari placentari (sEVs). Normossia (sEVs-Nor, 8% O2 ) o ipossia (sEVs-Hyp, 1% O2 ) per 18 ore. (C) I terreni condizionati vengono raccolti, filtrati e centrifugati per eliminare i detriti cellulari. (D) le sEV sono isolate mediante ultracentrifugazione. (E) Le sEV sono caratterizzate utilizzando l'analisi di nano-tracking e il western blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione in vivo del protocollo di interruzione della barriera emato-encefalica. Vengono utilizzati topi C57BL6/J non gravidi, di 4-6 mesi. (A) Attraverso la vena giugulare esterna, gli animali hanno ricevuto sEV (200 μg di proteine totali) isolate da colture placentari normossiche (sEVs-Nor, 8% O2) o ipossiche (sEVs-Hyp, 1% O2). RMCBS viene monitorato a 0-24 ore dopo l'iniezione. (B) 6 ore dopo l'iniezione di sEVs, i cervelli vengono estratti e sezionati in nove segmenti per l'estrazione delle proteine. Claudin 5 (CLDN5) viene analizzata negli omogeneizzati di queste nove sezioni. (C) L'analisi dello stravaso blu di Evan (24 ore dopo l'iniezione di sEVs) è stata analizzata dopo l'iniezione di puntura retroorbitale in ciascuno dei nove segmenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Documentari fotografici del colorante blu di Evan e del protocollo di perfusione intracardica. (A) Il topo ha ricevuto il blu di Evan tramite iniezione retroorbitale. (A sinistra) Animale prima e (a destra) dopo l'iniezione (15 s) del blu di Evan. (B) Toracotomia per eseguire la perfusione intracardica di soluzione tampone fosfato (1x PBS) e paraformaldeide (4% PFA). Il ventricolo sinistro è puntato con la punta dell'ago. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dello stravaso blu di Evan dopo l'iniezione di sEV. (A) Immagine rappresentativa dell'intero cervello che mostra lo stravaso blu di Evan. La linea tratteggiata rappresenta nove sezioni ottenute dall'intero cervello. (B) Cervello sezionato usando un'affettatrice per topi cerebrali. (C) Immagini rappresentative di fette di cervello a 24 ore dopo l'iniezione di sEVs. Controllo (CTL), placenta in condizioni normossiche (sEVs-Nor) o ipossiche (sEVs-Hyp). Barra della scala = 0,4 cm. (D) Contorno digitale della fetta di cervello utilizzando ImageJ. (E) Istogramma nel canale blu. Valori compresi tra 75 e 110 sono associati allo stravaso blu di Evan. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Stravaso blu di Evan e livelli di claudina-5 in topi iniettati con sEV isolate da espianti placentari. (A) Percentuale di stravaso blu (EB) di Evan considerando le intere sezioni cerebrali. Controllo (CTL, blu), placenta in condizioni normossiche (sEVs-Nor, rosso) o ipossiche (sEVs-Hyp, verde). (B) I livelli relativi di claudina 5 (CLDN5) nelle nove sezioni cerebrali sono stati ottenuti dai tre gruppi sperimentali. β-actina viene utilizzata come controllo del carico. I valori sono medi ± intervallo interquartile. Ogni punto rappresenta un singolo soggetto sperimentale. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; Test ANOVA seguito da Bonferroni post-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tempo (h) | Controllo | sEVs-Normoxia | sEVs-Ipossia | ANOVA |
| 0 | 18.75 ± 0.250 | 18,5 ± 0,288 | 18.75 ± 0.250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0.707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19.25 ± 0.750 | 17 ± 0.577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | 16.75 ± 1.109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17.75 ± 0.250 | 10.25 ± 0.853*α | <0.0001 |
| *p < 0,01 rispetto al controllo. αp < 0,01 contro sEVs-Normoxia | ||||
Tabella 1: Coma murino rapido e scala comportamentale (RMCBS) dopo 24 ore dall'iniezione di sEVs. Il punteggio è espresso come media ± SEM. I punteggi degli animali più vicini a 20 sono standard, mentre più basso è il punteggio, maggiore è la disfunzione del SNC.
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Discussion
Questo studio svela nuove intuizioni sul potenziale danno derivante dalle sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche sulla rottura della barriera emato-encefalica dei roditori. Il meccanismo patologico comporta una riduzione di CLND-5 nella regione cerebrale posteriore25.
Indagini precedenti hanno rivelato che le sEV plasmatiche di individui con preeclampsia inducono disfunzione endoteliale in vari organi utilizzando modelli in vitro 46,47. Questa indagine ha esaminato in particolare la barriera emato-encefalica, offrendo una nuova prospettiva sulle sEV isolate dalla placenta coltivata in ipossia, che interrompe questa barriera vitale. Queste scoperte introducono un nuovo regno di ricerca in cui le sEV possono fungere da canale di comunicazione tra la placenta e il cervello sia in scenari normali che patologici, come la preeclampsia.
Il protocollo presentato è semplice, ma diversi passaggi critici meritano di essere menzionati. Questo protocollo richiede placente fresche entro 1 ora dal parto. Si sconsiglia inoltre di prolungare il periodo di coltura oltre le 24 ore per prevenire la degradazione dei tessuti. Questo protocollo mitiga la potenziale contaminazione da sEV prodotte dalle placente di topo. L'analisi digitale dello stravaso blu di Evan richiede molto tempo. Inoltre, la colorazione blu di Evan è meno evidente dopo il sezionamento del cervello. Pertanto, si consiglia una configurazione iniziale per identificare l'intervallo blu utilizzando un controllo positivo. Può anche essere impiegato un controllo negativo, come il cervello di un topo non sottoposto all'iniezione blu di Evan. L'analisi cieca dei gruppi sperimentali è fondamentale per evitare potenziali pregiudizi dell'osservatore.
Durante questo protocollo possono sorgere diverse sfide. Un limite significativo risiede nella variabilità biologica originata sia dalla placenta umana che dai topi iniettati. Per garantire la riproducibilità degli esperimenti di stravaso blu di Evan, si suggerisce di stabilire dosi di sEV isolate da placente umane. Abbiamo optato per una dose di 200 μg di proteine totali; tuttavia, questa quantità può variare in base alla purezza delle vescicole, all'efficacia dell'iniezione giugulare, alla somministrazione blu di Evan, alla sua eliminazione dal sistema circolatorio e, non ultimo, all'impatto biologico delle sEV considerando il loro contenuto.
I meccanismi cellulari attraverso i quali le sEV della placenta umana possono interrompere la barriera emato-encefalica richiedono ulteriori sperimentazioni. Tuttavia, questo metodo ha rilevanza, suggerendo una potenziale comunicazione tra la placenta e il cervello, che giustifica ulteriori esplorazioni. Pertanto, sono incoraggiate le indagini future, concentrandosi sulle sEV e sulle loro interazioni con la barriera emato-encefalica, nonché sull'impatto del loro carico sui tessuti neuronali. Se la compromissione della barriera emato-encefalica porta a conseguenze durature per il cervello materno merita un ulteriore esame.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i ricercatori di GRIVAS Health per il loro prezioso contributo. Inoltre, le ostetriche e il personale clinico del Servizio di Ostetricia e Ginecologia appartengono all'Hospital de Chillan, in Cile. Fondata da Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
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