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हाइपोक्सिक मानव प्लेसेंटा से छोटे बाह्य पुटिकाओं द्वारा माउस रक्त-मस्तिष्क बाधा का विघटन

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65867
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 3, 3,4, 1, 5, 1, 1, 1,6
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan
* These authors contributed equally

Summary

एक प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है कि क्या छोटे ईवीएस (एसईवी) हाइपोक्सिक स्थितियों (प्रीक्लेम्पसिया के एक पहलू मॉडलिंग) के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग हैं, गैर-गर्भवती वयस्क महिला चूहों में रक्त-मस्तिष्क बाधा को बाधित करते हैं।

Abstract

सेरेब्रल एडिमा और इस्केमिक और रक्तस्रावी स्ट्रोक सहित सेरेब्रोवास्कुलर जटिलताओं, प्रीक्लेम्पसिया से जुड़ी मातृ मृत्यु दर का प्रमुख कारण बनती हैं। इन मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं के अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं। हालांकि, वे प्लेसेंटल डिसफंक्शन और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) व्यवधान से जुड़े हुए हैं। फिर भी, इन दो दूर के अंगों के बीच संबंध अभी भी निर्धारित किया जा रहा है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि नाल मातृ परिसंचरण में बाह्य पुटिकाओं सहित सिग्नलिंग अणुओं को छोड़ती है। एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं को उनके आकार के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है, जिसमें छोटे बाह्य पुटिकाओं (व्यास में 200 एनएम से छोटे एसईवी) को शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग कण माना जाता है। प्रीक्लेम्पसिया में, मातृ परिसंचरण में परिसंचारी एसईवी की संख्या में वृद्धि हुई है, जिसके सिग्नलिंग फ़ंक्शन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। प्रीक्लेम्पसिया में या सामान्य गर्भावस्था प्लेसेंटा से हाइपोक्सिया के संपर्क में आने वाले प्लेसेंटस से प्लेसेंटल एसईवी मस्तिष्क एंडोथेलियल डिसफंक्शन और बीबीबी के विघटन को प्रेरित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आकलन करते हैं कि हाइपोक्सिक स्थितियों (प्रीक्लेम्पसिया के एक पहलू मॉडलिंग) के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी विवो में बीबीबी को बाधित करते हैं या नहीं।

Introduction

प्रीक्लेम्पसिया के कारण लगभग 70% मातृ मृत्यु, एक उच्च रक्तचाप से ग्रस्त गर्भावस्था सिंड्रोम बिगड़ा हुआ अपरा प्रक्रियाओं, मातृ प्रणालीगत एंडोथेलियल डिसफंक्शन, और, गंभीर मामलों में, बहु-अंग विफलता 1,2, तीव्र मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं 3,4 से जुड़े हैं। अधिकांश मातृ मृत्यु निम्न और मध्यम आय वाले देशों में होती हैं। हालांकि, प्रीक्लेम्पसिया से जुड़े सेरेब्रोवास्कुलर जटिलताओं के नैदानिक और महामारी विज्ञान प्रासंगिकता के बावजूद अंतर्निहित तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं।

दूसरी ओर, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) (व्यास ~ 30-400 एनएम) ऊतकों और अंगों के बीच अंतरकोशिकीय संचार के आवश्यक मध्यस्थ हैं, जिसमें मातृ-अपरा बातचीत6 शामिल है। बाहरी सतह पर प्रोटीन और लिपिड के अलावा, ईवीएस कार्गो (प्रोटीन, आरएनए और लिपिड) के भीतर ले जाते हैं। ईवीएस को (1) एक्सोसोम (व्यास ~ 50-150 एनएम, जिसे छोटे ईवीएस (एसईवी) भी कहा जाता है), (2) मध्यम/बड़े ईवी, और (3) एपोप्टोटिक निकायों में वर्गीकृत किया जा सकता है, जो आकार, जैवजनन, सामग्री और संभावित सिग्नलिंग फ़ंक्शन से भिन्न होते हैं। ईवीएस की संरचना उन कोशिकाओं द्वारा निर्धारित की जाती है जिनसे वे उत्पन्न होते हैं और रोग प्रकार7। Syncytiotrophoblast-व्युत्पन्न EVs प्लेसेंटल क्षारीय फॉस्फेट (PLAP)8,9 व्यक्त करते हैं, जो गर्भावस्था में प्लेसेन्टे-व्युत्पन्न परिसंचारी छोटे EVs (PDsEVs) का पता लगाता है। इसके अलावा, पीएलएपी पीडीएसईवी कार्गो में परिवर्तन और प्रीक्लेम्पसिया बनाम नॉर्मोटेंसिव गर्भधारण 10,11,12,13,14,15 में उनके प्रभावों को समझने में मदद करता है।

नाल प्रीक्लेम्पसिया16 या इस रोग 17,18,19 के साथ जुड़े मस्तिष्क जटिलताओं के pathophysiology में आवश्यक घटक के रूप में मान्यता दी गई है. हालांकि, यह दूर का अंग मस्तिष्क परिसंचरण में परिवर्तन को कैसे प्रेरित कर सकता है अज्ञात है। चूंकि एसईवी दाता से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं 6,20,21 तक बायोएक्टिव घटकों को स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता के कारण सेल-टू-सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं25,26 सहित मातृ एंडोथेलियल डिसफंक्शन 21,22,23,24 की पीढ़ी के साथ प्लेसेंटल एसईवी को जोड़ा हैप्रीक्लेम्पसिया वाली महिलाओं में। इस प्रकार, मस्तिष्क endothelial समारोह के समझौता रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), प्रीक्लेम्पसिया 3,27 के साथ जुड़े मस्तिष्कवाहिकीय जटिलताओं में एक महत्वपूर्ण घटक के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

फिर भी, प्रीक्लेम्पसिया 28 के साथ महिलाओं के सीरम के संपर्क में चूहे सेरेब्रल वाहिकाओं का उपयोग करने वाले प्रीक्लेम्पसिया28 या मानव मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ प्रीक्लेम्पसिया29 के साथ महिलाओं के प्लाज्मा के संपर्क में आने वाले प्रीक्लिनिकल निष्कर्षों ने बताया कि परिसंचारी कारक बीबीबी के व्यवधान को प्रेरित करते हैं। प्रीक्लेम्पसिया के दौरान मातृ परिसंचरण में मौजूद बीबीबी को नुकसान पहुंचाने की क्षमता वाले कई उम्मीदवारों के बावजूद, जैसे कि प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (यानी, ट्यूमर नेक्रोसिस कारक)18,28 या संवहनी नियामकों (यानी, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ))29,30,31, या ऑक्सीडेटिव अणु जैसे ऑक्सीकृत-लिपोप्रोटीन (ऑक्सो-एलडीएल)32,33, दूसरों के बीच34, उनमें से कोई भी नाल और बीबीबी के बीच सीधा संबंध स्थापित नहीं करता है। हाल ही में, हाइपोक्सिक प्लेसेंटा से अलग किए गए एसईवी ने गैर-गर्भवती महिला चूहों25 में बीबीबी को बाधित करने की क्षमता दिखाई है। चूंकि प्लेसेंटल एसईवी बीबीबी को बाधित करने की क्षमता के साथ अधिकांश सूचीबद्ध परिसंचारी कारकों को ले जा सकते हैं, इसलिए एसईवी को घायल प्लेसेंटा को जोड़ने के लिए उपयुक्त उम्मीदवार माना जाता है, हानिकारक परिसंचारी कारकों का वाहक होता है, और प्रीक्लेम्पसिया में बीबीबी को बाधित करता है।

यह प्रोटोकॉल हमें यह जांचने की अनुमति देता है कि क्या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी प्रीक्लेम्पसिया के दौरान सेरेब्रल जटिलताओं के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने के लिए प्रॉक्सी के रूप में गैर-गर्भवती महिला चूहों में बीबीबी को बाधित कर सकते हैं।

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Protocol

अनुसंधान हेलसिंकी की घोषणा में व्यक्त सिद्धांतों का पालन करते हुए और संबंधित नैतिक समीक्षा बोर्डों के प्राधिकरण के तहत किया गया था। सभी मानव प्रतिभागियों ने नमूना संग्रह से पहले अपनी सूचित सहमति दी, जैसा कि पहले25 बताया गया था। इसके अतिरिक्त, बियो-बिओ विश्वविद्यालय की बायोएथिक्स और बायोसेफ्टी कमेटी ने इस परियोजना (फोंडेसाइट ग्रांट 1200250) को मंजूरी दी। पशु कार्य प्रयोग35 में जानवरों के उपयोग में तीन आर के कार्डिनल सिद्धांतों के अनुसार आयोजित किया गया था, और यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों की सिफारिशों के अनुसार। जानवरों को बियो-बिओ विश्वविद्यालय के मछली पालने का बाड़ा में उपयुक्त वातावरण में रखा गया था। ताजा प्लेसेंटा (एन = 4) माताओं (उम्र 28-31 वर्ष) से वैकल्पिक सिजेरियन सेक्शन के बाद 1 घंटे के भीतर प्राप्त किए गए थे, अवधि में सामान्य गर्भधारण (38 से 41 सप्ताह के गर्भ में)। सिजेरियन सेक्शन हरमिंडा मार्टिन क्लिनिकल हॉस्पिटल, चिल्लन, चिली में किए गए थे, जैसा कि पहले25 बताया गया था। इन विवो मॉडल को लागू करने के लिए, 4-6 महीने की महिला गैर-गर्भवती चूहों (तनाव C57BLACK/6) का उपयोग किया गया था। उन्हें तीन प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया गया था: (1) नियंत्रण (उपचार के बिना), (2) नॉर्मोक्सिया (sEVs-Nor) से sEVs के साथ इलाज किया गया, और (3) हाइपोक्सिक सुसंस्कृत प्लेसेंटा (sEVs-Hyp) से sEVs के साथ इलाज किया गया, जिसका उपयोग विवो25 में BBB के व्यवधान का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। सभी इंजेक्शन समाधान बाँझ थे। इसके अलावा, एसईवी की तैयारी सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में और संदूषण से बचने के लिए एक वर्ग II जैव सुरक्षा हुड के तहत की गई थी।

1. अपरा संस्कृति explants

  1. सामान्य गर्भावस्था प्लेसेंटा के एक्सप्लांट्स को निकालने के लिए, मिलर एट अल द्वारा प्रकाशित विधि की जांच करें।
  2. ध्यान से निष्फल संदंश का उपयोग मानव नाल की बेसल प्लेट से थक्के हटा दें. 10 ग्राम का अंतिम ऊतक निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए छोटे एक्सप्लांट निकालें।
  3. सुनिश्चित करें कि प्लेसेंटा के मातृ भाग के चार चतुर्थांशों से अपरा एक्सप्लांट्स हटा दिए गए हैं। सुनिश्चित करें कि विघटित ऊतक और कैल्सीफाइड क्षेत्रों को बाहर रखा गया है।
  4. अपरा ऊतक में हेरफेर करने के लिए, बर्फ पर, बाँझ परिस्थितियों में, और जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर ऐसा करें।
  5. जितना संभव हो उतना रक्त निकालने के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस 1x, पीएच 7.4) की प्रचुर मात्रा (एक्सप्लांट्स के पांच खंड) के साथ एक्सप्लांट्स (कम से कम तीन बार) धोएं। अपकेंद्रित्र (10 मिनट के लिए 252 x ग्राम ) धोने के बीच कमरे के तापमान पर।
  6. 2% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 माइक्रोग्राम / एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक संस्कृति माध्यम के 20 एमएल में धोए गए एक्सप्लांट्स के 10 ग्राम को फिर से निलंबित करें।
  7. निलंबन को 100 मिमी संस्कृति डिश में रखें। 21% ऑक्सीजन और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए explants छोड़ दें.
  8. उसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस (तीन बार) पर 1x पीबीएस के साथ explants को फिर से धोएं। अपकेंद्रित्र (10 मिनट के लिए 252 x ग्राम ) धोने के बीच कमरे के तापमान पर।
  9. इसके अलावा, पहले नैनोकणों से समाप्त संस्कृति माध्यम के 20 एमएल में ऊतक को फिर से निलंबित करें।
    नोट: नैनोपार्टिकल रिक्तीकरण के लिए, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (कमरे के तापमान पर 18 घंटे के लिए 120,000 x ग्राम ) और माइक्रोफिल्ट्रेशन (0.22 माइक्रोन फिल्टर) करें।
  10. पुन: निलंबित एक्सप्लांट्स को दो संस्कृतियों के व्यंजनों (100 मिमी) में विभाजित करें। प्रत्येक संस्कृति पकवान resuspended explants के 10 एमएल शामिल होना चाहिए.
  11. उसके बाद, मानक संस्कृति की स्थिति (8% ऑक्सीजन और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) में प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स युक्त व्यंजनों में से एक रखें, जबकि दूसरे को 1% ओ2 के साथ हाइपोक्सिक कक्ष में रखें।
    नोट: (वैकल्पिक) ऊतक व्यवहार्यता का विश्लेषण एक ही ऊतक निष्कर्षण और 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड परख (एमटीटी परख) का उपयोग करके किया जा सकता है जैसा कि कहीं औरवर्णित है 37,38. एमटीटी मूल्यों को सामान्य करने के लिए एक्सप्लांट्स होमोजेनेट में मापा गया कुल प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करें।
  12. संस्कृति में 18 घंटे के बाद, एक नई 15 एमएल ट्यूब में explants के वातानुकूलित मीडिया फसल.
    नोट: इस चरण में, वातानुकूलित मीडिया एक विस्तारित अवधि (सप्ताह) के लिए जमे हुए (-80 डिग्री सेल्सियस) हो सकता है।

2. अपरा व्युत्पन्न sEVs अलगाव

  1. पहले प्रकाशित रिपोर्ट25,39 के बाद अंतर centrifugation और microfiltration प्रोटोकॉल का उपयोग वातानुकूलित माध्यम से sEVs अलग.
  2. कटाई वातानुकूलित माध्यम के लिए अनुक्रमिक centrifugation प्रदर्शन. सेंट्रीफ्यूजेशन के अनुक्रमिक चरण हैं (1) 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम , (2) 10 मिनट के लिए 2000 x ग्राम , (3) 30 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम , और (4) 2 घंटे के लिए 120,000 x ग्राम । सेंट्रीफ्यूजेशन कमरे का तापमान करें।
  3. इन सभी centrifugations में, एक 20-100 μL विंदुक का उपयोग कर, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा और गोली त्यागें.
  4. एक बार किया, एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) के माध्यम से पिछले एकत्रित सतह पर तैरनेवाला पास. इसके बाद, कमरे के तापमान पर 18 घंटे के लिए 120,000 x ग्राम पर एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  5. उसके बाद, पीबीएस (पीएच 7.4) के 500 माइक्रोन में गोली (जिसमें अपरा sEVs शामिल हैं) को निलंबित करते हुए सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और फिर से 0.22 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें। अंत में, कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए 120,000 x ग्राम पर एक अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
  6. इसके बाद, पीबीएस के 500 माइक्रोन (पीएच 7.4, पहले से एसईवी से समाप्त) में गोली (जिसमें प्लेसेंटल एसईवी होते हैं) को फिर से निलंबित करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें।
  7. नमूनों को sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) या sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp) के स्टॉक के रूप में लेबल करें।
    नोट: आगे के प्रयोग के लिए पृथक एसईवी के 50-100 माइक्रोन एलिकोट तैयार करें। छोटे ईवीएस को विस्तारित अवधि (महीनों) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. प्लेसेंटल sEVs को आकार, गिनती और sEVs प्रोटीन मार्कर द्वारा चिह्नित करें, जैसा कि पहले25 बताया गया था। एसईवी का आदर्श औसत कण व्यास 50-150 एनएम है।
    नोट: sEVs लक्षण वर्णन में CD63, Tsg101, Alix, और HSP70 का सकारात्मक पता लगाना शामिल है (यानी, एक्सोसोम में समृद्ध sEVs आबादी को चिह्नित करने के लिए)। इसके अलावा, प्लेसेंटल मूल25 के मार्कर के रूप में पीएलएपी का उपयोग करें।
  9. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके एसईवी समाधान में प्रोटीन की कुल मात्रा को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: चित्रा 1 अपरा प्रत्यारोपण संस्कृति और बाह्य पुटिका अलगाव का एक सिंहावलोकन से पता चलता है.

3. चूहे इंजेक्शन

  1. 5% isoflurane वितरण के साथ एक संवेदनाहारी प्रेरण कक्ष में पशु anesthetize ( सामग्री की तालिकादेखें). एक पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण के स्तर को सत्यापित करें।
  2. ~ 40 एस के बाद, एक facemask का उपयोग संज्ञाहरण प्रणाली में माउस डाल दिया और 2% isoflurane के एक संज्ञाहरण स्तर को बनाए रखने.
  3. अगला, 28 डिग्री सेल्सियस के एक कमरे के तापमान पर एक हीटिंग मंच ( सामग्री की तालिकादेखें) पर पशु स्थिति. आंखों को कृत्रिम आंसुओं से चिकना रखें।
  4. इंजेक्शन लगाने से पहले, 70 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने तक फॉस्फेट बफर (पीएच, 7.4) के साथ प्लेसेंटल एसईवी (कुल प्रोटीन का 200 माइक्रोग्राम) पतला करें।
  5. 70% इथेनॉल और कपास झाड़ू का उपयोग इंजेक्शन क्षेत्र कीटाणुरहित. एसईवी समाधान इंजेक्ट करने के लिए 30 जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
    नोट: सिरिंज को शारीरिक तापमान प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए हीटिंग प्लेटफॉर्म पर तैनात किया जा सकता है।
  6. फिर, बाहरी जुगुलर नस में समाधान इंजेक्षन. इस कदम के लिए विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है।
    नोट: प्रक्रिया सावधानी से किया जाना चाहिए, धीरे-धीरे सुई को वापस लेना और धीरे-धीरे रक्त भाटा के सबूत की आकांक्षा करना।
  7. इंजेक्शन के बाद, एक सूखी कपास झाड़ू के साथ ~ 15 एस के लिए इंजेक्शन क्षेत्र के लिए हल्के दबाव लागू होते हैं. उसके बाद, जानवरों को उनके संबंधित पिंजरों में लौटा दें।
  8. 15 मिनट के लिए चेतना और व्यवहार का मूल्यांकन करना सुनिश्चित करें। चेतना उपलब्धि का एक संकेतक कुल मोटर गतिविधि की पशु वसूली है।
    नोट: पशु के पिंजरों में एक गर्म तापमान रखने के लिए सुनिश्चित करें।

4. रैपिड murine कोमा और व्यवहार पैमाने (RMCBS)

  1. जानवरों40 के न्यूरोलॉजिकल और कल्याण मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए आरएमसीबीएस का उपयोग करें।
    नोट: आरएमसीबीएस ऑपरेटर हस्तक्षेप के कारण न्यूनतम पशु तनाव के साथ एक तेजी से मूल्यांकन (~ 3 मिनट) की अनुमति देता है। आरएमसीबीएस में दस पैरामीटर हैं (प्रत्येक स्कोर 0-2 है)।
  2. इंजेक्शन के बाद 0 घंटे (एसईवी इंजेक्शन लगाने से पहले) और 3 एच, 6 एच, 12 एच, और 24 घंटे पर आरएमसीबीएस पैमाने के साथ माउस कल्याण का मूल्यांकन करें।
    नोट: बीबीबी(चित्रा 2)के व्यवधान का मूल्यांकन करने के लिए क्लॉडिन-5 (एसईवीएस इंजेक्शन के बाद 6 घंटे पर) और इवान के नीले एक्सट्रावेशन (एसईवीएस इंजेक्शन के बाद 24 घंटे) का विश्लेषण करें।

5. इवान के नीले अपव्यय का विश्लेषण

  1. प्लेसेंटल sEVs इंजेक्शन (24 h) के बाद, चरण 3.1 में वर्णित चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
  2. इवान का नीला समाधान तैयार करें (2%, फॉस्फेट बफर समाधान में पतला, 1x) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. रेट्रो-ऑर्बिटल एक्सेस25 का उपयोग करके, इवान के ब्लू समाधान को 2 एमएल / किग्रा पर इंजेक्ट करें।
  4. इवान नीले समाधान संज्ञाहरण के रखरखाव के तहत 20 मिनट के लिए प्रसारित करने के लिए अनुमति दें.
  5. अगला, परिसंचरण से इवान की नीली डाई को हटाने के लिए खारा समाधान (~ 3 एमएल, 0.9%, डब्ल्यू / वी) के साथ पहले वर्णित प्रोटोकॉल41 के बाद इंट्राकार्डिक छिड़काव करें। यह कदम अनिवार्य है।
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए, संज्ञाहरण को 5% तक बढ़ाएं और संज्ञाहरण के एक गहरे विमान को सत्यापित करें (यानी, श्वसन दर में भारी कमी)।
  6. औसत दर्जे का thoracotomy41 (चित्रा 3) के माध्यम से दिल बेनकाब.
  7. उसके बाद, पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान (पीबीएस में 4%, वी / वी) के इंट्राकार्डियल जलसेक के साथ पूरे जानवर को ठीक करें।
    नोट: उचित निर्धारण की निगरानी के लिए पूंछ की कठोरता की जांच करें।
  8. इसके अलावा, एक बार निर्धारण पूरा हो गया है, ध्यान से मस्तिष्क निकालने, यह वजन, और यहतस्वीर 41. एक शासक42 के करीब पूरे मस्तिष्क के साथ तस्वीरें लें।
  9. अगला, एक मस्तिष्क माउस स्लाइसर ( सामग्री की तालिकादेखें) में मस्तिष्क डाल दिया.
  10. मस्तिष्क को नौ वर्गों में विच्छेदित करें, क्रेन-दुम, सेरिबैलम (100 माइक्रोन प्रत्येक खंड) सहित।
  11. विच्छेदन के बाद, कल्पना और एक स्टीरियो ज़ूम खुर्दबीन ( सामग्री की तालिकादेखें) में मस्तिष्क स्लाइस की छवियों पर कब्जा.
  12. ImageJ सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका) का उपयोग कर इवान के नीले extravasation यों करने के लिए कब्जा कर लिया छवियों का उपयोग करें.
    नोट: इवान की नीली डाई की उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए, मस्तिष्क अनुभाग के सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करके इवान के नीले मूल्यों को सेट करें (डाई के साथ इंजेक्शन वाले पशु नियंत्रण जानवर से लेकिन इंट्राकार्डियल छिड़काव के बिना)। सकारात्मक नियंत्रण से पहुंचे इवान के नीले मूल्य आम तौर पर नीले चैनल (चित्रा 4) की तीव्रता हिस्टोग्राम में 75 और 110 के बीच होते हैं।
  13. सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क छवियों पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह से बचने के लिए संबंधित प्रयोगात्मक समूह द्वारा आँख बंद करके विश्लेषण कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, स्पेक्ट्रोस्कोपी43 के बाद मस्तिष्क समरूपता द्वारा इवान के नीले बहिर्वाह की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: अलग-अलग प्रयोगों में, sEVs इंजेक्शन चूहों (6 एच) से ताजा पृथक दिमाग का उपयोग करके, क्लॉडिन 5 (CLND-5) ( सामग्री की तालिकादेखें) के प्रोटीन स्तर का विश्लेषण करें, बीबीबी44 (चित्रा 5) की जकड़न में शामिल एक महत्वपूर्ण तंग जंक्शन।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल गैर-गर्भवती चूहों में बीबीबी को बाधित करने के लिए हाइपोक्सिया में सुसंस्कृत प्लेसेंटा से प्राप्त एसईवी की क्षमता का मूल्यांकन करता है। यह विधि सामान्य और रोग स्थितियों में नाल और मस्तिष्क के बीच संभावित संबंध को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देती है। विशेष रूप से, यह विधि प्रीक्लेम्पसिया में मस्तिष्क संबंधी जटिलताओं की शुरुआत में प्लेसेंटल एसईवी की भागीदारी का विश्लेषण करने के लिए एक प्रॉक्सी का गठन कर सकती है।

sEVs-NOR के साथ इंजेक्शन चूहों के विपरीत, sEVs-Hyp के साथ इंजेक्शन चूहों 24 घंटे (तालिका 1) तक न्यूरोलॉजिकल स्कोर में एक प्रगतिशील गिरावट दिखाते हैं, जो मस्तिष्क समारोह को ख़राब करने के लिए sEVs-Hyp क्षमता का सुझाव देता है।

इसके अलावा, sEVs-Hyp इंजेक्शन समूह के चूहों के दिमाग sEVs-NOR या नियंत्रण चूहों (0.51 ± 0.008; 0.46 ± 0.008; 0.47 ± 0.01 ग्राम, क्रमशः) के साथ इंजेक्ट चूहों से अलग उन लोगों की तुलना में अधिक ताजा वजन है, जो मस्तिष्क शोफ45 का सकल संकेतक हो सकता है।

इस खोज के साथ संगत, यह प्रोटोकॉल बीबीबी के विघटन के संकेतक के रूप में इवान के नीले अपव्यय की पहचान करने की अनुमति देता है। उस संबंध में, एसईवी-हाइप के साथ इंजेक्शन वाले चूहों के दिमाग में एसईवी-नोर समूह(चित्रा 5ए)से दिमाग की तुलना में इवान का नीला एक्सट्रावेशन अधिक होता है।

हालांकि sEVs-Hyp द्वारा प्रेरित BBB के विघटन के अंतर्निहित तंत्र इस प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण नहीं किया गया था, परिणाम यह भी संकेत मिलता है कि sEVs-Hyp इंजेक्शन चूहों ने उन क्षेत्रों में CLND-5 की प्रोटीन मात्रा कम दिखाई जिसमें BBB सबसे अधिक प्रभावित था (यानी, पीछे के क्षेत्र) (चित्रा 5B)। इसलिए, यह संभव है कि sEVs-hyp इस महत्वपूर्ण एंडोथेलियल तंग जंक्शन प्रोटीन के कार्य की अभिव्यक्ति को बाधित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्लेसेंटल एक्सप्लांट कल्चर और बाह्य पुटिका अलगाव प्रोटोकॉल। (ए) सामान्य प्लेसेंटा एक्सप्लांट संस्कृतियां। (बी) अपरा छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) के जैवजनन के लिए एक्सप्लांट को दो स्थितियों में वितरित किया जाता है। नॉर्मोक्सिया (sEVs-Nor, 8% O2) या हाइपोक्सिया (sEVs-Hyp, 1% O2) 18 घंटे के लिए। (सी) वातानुकूलित मीडिया सेल मलबे को खत्म करने के लिए काटा, फ़िल्टर्ड और सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। (डी) एसईवी अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग-थलग हैं। (ई) एसईवी को नैनो-ट्रैकिंग विश्लेषण और पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके विशेषता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रक्त-मस्तिष्क बाधा व्यवधान प्रोटोकॉल के विवो मूल्यांकन में । गैर-गर्भवती C57BL6/J चूहों, 4-6 महीने पुराने, का उपयोग किया जाता है। (ए) बाहरी जुगुलर नस के माध्यम से, जानवरों को नॉर्मोक्सिक (एसईवी-नॉर, 8% ओ2) या हाइपोक्सिक (एसईवीएस-हाइप, 1% ओ2) प्लेसेंटल संस्कृतियों से अलग एसईवी (कुल प्रोटीन का 200 माइक्रोग्राम) प्राप्त हुआ। इंजेक्शन के बाद 0-24 घंटे में आरएमसीबीएस की निगरानी की जाती है। (बी) 6 घंटे sEVs इंजेक्शन के बाद, मस्तिष्क निकाला जाता है और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नौ खंडों में खंडित कर रहे हैं. क्लॉडिन 5 (CLDN5) का विश्लेषण उन नौ खंडों के समरूप में किया जाता है। (सी) इवान के नीले एक्सट्रावेशन विश्लेषण (एसईवीएस इंजेक्शन के बाद 24 घंटे) का विश्लेषण नौ खंडों में से प्रत्येक में रेट्रो-ऑर्बिटल पंचर इंजेक्शन के बाद किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इवान की नीली डाई और इंट्राकार्डियल परफ्यूजन प्रोटोकॉल के फोटो वृत्तचित्र। (ए) माउस ने रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के माध्यम से इवान का नीला प्राप्त किया। (बाएं) इवान के नीले रंग के इंजेक्शन (15 एस) से पहले और (दाएं) से पहले जानवर। (बी) फॉस्फेट बफर समाधान (1x पीबीएस) और पैराफॉर्मलडिहाइड (4% पीएफए) के इंट्राकार्डियल छिड़काव करने के लिए थोरैकोटॉमी। बाएं वेंट्रिकल को सुई की नोक से इंगित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसईवी के इंजेक्शन के बाद इवान के नीले एक्सट्रावेशन का विश्लेषण। (ए) इवान के नीले अपव्यय को दिखाते हुए पूरे मस्तिष्क की प्रतिनिधि छवि। धराशायी रेखा पूरे मस्तिष्क से प्राप्त नौ वर्गों का प्रतिनिधित्व करती है। (बी) मस्तिष्क चूहों स्लाइसर का उपयोग कर विच्छेदित मस्तिष्क. (सी)एसईवी इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में मस्तिष्क स्लाइस की प्रतिनिधि छवियों. नियंत्रण (CTL), नॉर्मॉक्सिक (sEVs-Nor) या हाइपोक्सिक स्थितियों (sEVs-Hyp) में प्लेसेंटा । स्केल बार = 0.4 सेमी। (डी) ImageJ का उपयोग कर मस्तिष्क टुकड़ा के डिजिटल रूपरेखा. (ई) नीले चैनल में हिस्टोग्राम। 75-110 के बीच के मान इवान के नीले अपव्यय से जुड़े हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इवान के नीले एक्सट्रावेशन और क्लॉडिन -5 के स्तर चूहों में प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग एसईवी के साथ इंजेक्ट किए गए। (ए) पूरे मस्तिष्क वर्गों पर विचार करते हुए इवान के नीले (ईबी) एक्सट्रावेशन का प्रतिशत। नियंत्रण (CTL, नीला), नॉर्मॉक्सिक में प्लेसेंटा (sEVs-न ही, लाल) या हाइपोक्सिक स्थितियां (sEVs-Hyp, हरा)। (बी) नौ मस्तिष्क वर्गों में क्लॉडिन 5 (सीएलडीएन 5) के सापेक्ष स्तर तीन प्रयोगात्मक समूहों से प्राप्त किए गए थे। β-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता है। मान इंटरक्वार्टाइल रेंज ± माध्य हैं। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत प्रयोगात्मक विषय का प्रतिनिधित्व करता है। *p < 0.05, **p < 0.005. पी < 0.0001। पी < 0.001; एनोवा परीक्षण के बाद Bonferroni परीक्षण के बाद. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समय (ज) नियंत्रण sEVs-नॉर्मोक्सिया sEVs-हाइपोक्सिया एनोवा
0 18.75 ± 0.250 18.5 ± 0.288 18.75 ± 0.250 एन एस
3 18.5 ± 0.866 17 ± 0.707 13.25 ± 1.750*α 0.006
6 19.25 ± 0.750 17 ± 0.577 11.75 ± 1.250*α 0.002
12 18.5 ± 0.645 16.75 ± 1.109 13 ± 0.816*α 0.001
24 19.5 ± 0.288 17.75 ± 0.250 10.25 ± 0.853*α <0.0001
* पी < 0.01 बनाम नियंत्रण। αपी < 0.01 बनाम एसईवी-नॉर्मोक्सिया

तालिका 1: रैपिड murine कोमा और व्यवहार पैमाने (RMCBS) 24 घंटे पोस्ट sEVs इंजेक्शन के बाद. स्कोर को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। 20 के निकटतम जानवरों के स्कोर मानक हैं, जबकि स्कोर जितना कम होगा, सीएनएस की शिथिलता उतनी ही अधिक होगी।

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Discussion

यह अध्ययन कृंतक रक्त-मस्तिष्क बाधा के विघटन पर हाइपोक्सिक स्थितियों में सुसंस्कृत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स से अलग किए गए एसईवी के परिणामस्वरूप संभावित नुकसान में ताजा अंतर्दृष्टि का खुलासा करता है। पैथोलॉजिकल तंत्र में पीछे के मस्तिष्क क्षेत्र25 में CLND-5 में कमी शामिल है।

पूर्व जांच से पता चला है कि प्रीक्लेम्पसिया वाले व्यक्तियों से प्लाज्मा-एसईवीएस इन विट्रो मॉडल46,47 का उपयोग करके विभिन्न अंगों में एंडोथेलियल डिसफंक्शन को प्रेरित करते हैं। इस जांच ने विशेष रूप से रक्त-मस्तिष्क बाधा की जांच की, जो हाइपोक्सिया-सुसंस्कृत प्लेसेंटा से अलग एसईवी पर एक उपन्यास परिप्रेक्ष्य पेश करता है, जो इस महत्वपूर्ण बाधा को बाधित करता है। ये खोजें अनुसंधान के एक नए क्षेत्र का परिचय देती हैं जिसमें एसईवी प्रीक्लेम्पसिया जैसे सामान्य और रोग परिदृश्यों दोनों में नाल और मस्तिष्क के बीच एक संचार चैनल के रूप में काम कर सकते हैं।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीधा है, लेकिन कई महत्वपूर्ण कदम वारंट उल्लेख करते हैं। इस प्रोटोकॉल प्रसव के बाद 1 घंटे के भीतर ताजा प्लेसेंटा की आवश्यकता है। हम ऊतक क्षरण को रोकने के लिए 24 घंटे से परे संस्कृति अवधि का विस्तार करने के खिलाफ भी सलाह देते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस प्लेसेंटा द्वारा उत्पादित sEVs से संभावित संदूषण को कम करता है। इवान के नीले अपव्यय का डिजिटल विश्लेषण समय-गहन है। इसके अलावा, मस्तिष्क सेक्शनिंग के बाद इवान का नीला धुंधला होना कम विशिष्ट है। इसलिए, सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करके नीली सीमा की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक सेटअप की सिफारिश की जाती है। एक नकारात्मक नियंत्रण, जैसे कि माउस से मस्तिष्क जो इवान के नीले इंजेक्शन के अधीन नहीं है, को भी नियोजित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक समूहों के अंधा विश्लेषण संभावित पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह को टालने के लिए जरूरी है.

इस प्रोटोकॉल के दौरान कई चुनौतियां पैदा हो सकती हैं। एक महत्वपूर्ण सीमा जैविक परिवर्तनशीलता में निहित है जो मानव प्लेसेंटा और इंजेक्शन चूहों दोनों से उत्पन्न होती है। इवान के नीले एक्सट्रावेशन प्रयोगों की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, मानव प्लेसेंटा से अलग एसईवी खुराक स्थापित करने का सुझाव दिया गया है। हमने कुल प्रोटीन के 200 μg की खुराक का विकल्प चुना; हालांकि, यह मात्रा पुटिका शुद्धता, जुगुलर इंजेक्शन की प्रभावकारिता, इवान के नीले प्रशासन, संचार प्रणाली से इसकी निकासी, और, कम से कम, उनकी सामग्री पर विचार करने वाले एसईवी के जैविक प्रभाव के आधार पर उतार-चढ़ाव कर सकती है।

सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा मानव नाल से एसईवी रक्त-मस्तिष्क बाधा को बाधित कर सकते हैं, अतिरिक्त प्रयोग की आवश्यकता होती है। फिर भी, यह विधि प्रासंगिकता रखती है, नाल और मस्तिष्क के बीच संभावित संचार पर संकेत देती है, आगे की खोज की गारंटी देती है। इसलिए, भविष्य की जांच को प्रोत्साहित किया जाता है, एसईवी और रक्त-मस्तिष्क बाधा के साथ उनकी बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, साथ ही न्यूरोनल ऊतकों पर उनके कार्गो का प्रभाव भी होता है। क्या रक्त-मस्तिष्क बाधा हानि मातृ मस्तिष्क वारंट के लिए स्थायी परिणामों की ओर ले जाती है, आगे की परीक्षा होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अपने मूल्यवान इनपुट के लिए GRIVAS Health से संबंधित शोधकर्ताओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। इसके अलावा, प्रसूति और स्त्री रोग सेवा से दाइयों और नैदानिक कर्मचारी अस्पताल डी चिलान, चिली से संबंधित हैं। Fondecyt नियमित 1200250 द्वारा स्थापित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices

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References

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हाइपोक्सिक मानव प्लेसेंटा से छोटे बाह्य पुटिकाओं द्वारा माउस रक्त-मस्तिष्क बाधा का विघटन
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Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).

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