Summary
Um protocolo é apresentado para avaliar se pequenos EVs (sEVs) isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) rompem a barreira hematoencefálica em camundongos fêmeas adultas não grávidas.
Abstract
As complicações cerebrovasculares, incluindo edema cerebral e acidente vascular cerebral isquêmico e hemorrágico, constituem a principal causa de mortalidade materna associada à pré-eclâmpsia. Os mecanismos subjacentes dessas complicações cerebrovasculares permanecem obscuros. No entanto, eles estão ligados à disfunção placentária e à interrupção da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, a conexão entre esses dois órgãos distantes ainda está sendo determinada. Evidências crescentes sugerem que a placenta libera moléculas sinalizadoras, incluindo vesículas extracelulares, na circulação materna. As vesículas extracelulares são categorizadas de acordo com seu tamanho, sendo que pequenas vesículas extracelulares (sEVs menores que 200 nm de diâmetro) são consideradas partículas sinalizadoras críticas em condições fisiológicas e patológicas. Na pré-eclâmpsia, há um aumento do número de EVs circulantes na circulação materna, cuja função de sinalização não é bem compreendida. Os EVs placentários liberados na pré-eclâmpsia ou em placentas gestacionais normais expostas à hipóxia induzem disfunção endotelial cerebral e interrupção da BHE. Neste protocolo, avaliamos se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) interrompem a BHE in vivo.
Introduction
Aproximadamente 70% das mortes maternas por pré-eclâmpsia, síndrome hipertensiva da gravidez caracterizada por processos de placentação prejudicados, disfunção endotelial sistêmica materna e, em casos graves, falência de múltiplos órgãos 1,2, estão associadas a complicações cerebrovasculares agudas 3,4. A maioria das mortes maternas ocorre em países de baixa e médiarenda5. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão claros, apesar da relevância clínica e epidemiológica das complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia.
Por outro lado, as vesículas extracelulares (EVs) (diâmetro ~30-400 nm) são mediadores essenciais da comunicação intercelular entre tecidos e órgãos, incluindo a interação materno-placentária6. Além de proteínas e lipídios na superfície externa, os EVs carregam carga dentro (proteínas, RNA e lipídios). Os EVs podem ser categorizados em (1) exossomos (diâmetro ~50-150 nm, também chamados de EVs pequenos (sEVs)), (2) EVs médios/grandes e (3) corpos apoptóticos, que diferem pelo tamanho, biogênese, conteúdo e função de sinalização potencial. A composição dos EVs é determinada pelas células de onde se originam e pelo tipo de doença7. Os EVs derivados de sinciciotrofoblastos expressam fosfatase alcalina placentária (PLAP)8,9, que detecta pequenas EVs circulantes derivadas da placenta (PDsEVs) na gravidez. Além disso, o PLAP ajuda a discernir mudanças na carga de PDsEVs e seus efeitos na pré-eclâmpsia versus gestações normotensas 10,11,12,13,14,15.
A placenta tem sido reconhecida como o componente necessário na fisiopatologia da pré-eclâmpsia16 ou complicações cerebrais associadas a esta doença 17,18,19. No entanto, não se sabe como esse órgão distante pode induzir alterações na circulação cerebral. Uma vez que as EVs desempenham papéis fundamentais na comunicação célula-célula devido à sua capacidade de transferir componentes bioativos das células doadoras para as receptoras 6,20,21, um número crescente de estudos tem associado as EVs placentárias à geração de disfunção endotelial materna 21,22,23,24, incluindo células endoteliais cerebrais 25,26em mulheres com pré-eclâmpsia. Assim, o comprometimento da função endotelial cerebral pode levar à ruptura da barreira hematoencefálica (BHE), componente crítico nas complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia 3,27.
No entanto, achados pré-clínicos utilizando vasos cerebrais de ratas expostos ao soro de mulheres com pré-eclâmpsia28 ou células endoteliais cerebrais humanas expostas ao plasma de mulheres com pré-eclâmpsia29 relataram que o(s) fator(es) circulante(s) induz(em) a interrupção da BHE. Apesar de vários candidatos com potencial para prejudicar a BHE presente na circulação materna durante a pré-eclâmpsia, como níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias (i.e., fator de necrose tumoral)18,28 ou reguladores vasculares (i.e., fator de crescimento endotelial vascular (VEGF))29,30,31, ou moléculas oxidativas como lipoproteínas oxidadas (oxo-LDL)32,33, entre outras34, nenhum deles estabelece uma conexão direta entre a placenta e o BBB. Recentemente, sEVs isolados de placentas hipóxicas mostraram a capacidade de interromper a BBB em camundongos fêmeas não gestantes25. Uma vez que os sEVs placentários podem carregar a maioria dos fatores circulantes listados com a capacidade de interromper o BBB, os sEVs são considerados candidatos adequados para conectar a placenta lesionada, ser o portador de fatores circulantes prejudiciais e interromper o BBB na pré-eclâmpsia.
Este protocolo permite investigar se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas podem interromper a BHE em camundongos fêmeas não gestantes como proxy para a compreensão da fisiopatologia das complicações cerebrais durante a pré-eclâmpsia.
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Protocol
A pesquisa foi realizada seguindo os princípios expressos na Declaração de Helsinque e sob autorização dos respectivos Comitês de Ética em Pesquisa. Todos os participantes humanos deram seu consentimento informado antes da coleta da amostra, conforme relatado anteriormente25. Adicionalmente, o Comitê de Bioética e Biossegurança da Universidade Bío-Bío aprovou este projeto (bolsa Fondecyt 1200250). O trabalho com animais foi conduzido de acordo com os princípios cardeais dos três R's no uso de animais em experimentação35, e de acordo com as recomendações das diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA. Os animais foram mantidos em ambientes apropriados no Biotério da Universidade de Bío-Bío. Placentas frescas (n = 4) foram obtidas dentro de 1 h após cesariana eletiva de mães (28-31 anos) com gestações normais a termo (38 a 41 semanas de gestação). As cesarianas foram realizadas no Hospital Clínico Herminda Martin, Chillán, Chile, conforme relatado anteriormente25. Para aplicação do modelo in vivo , foram utilizadas fêmeas de camundongos não gestantes (linhagem C57BLACK/6) com 4-6 meses de idade. Eles foram divididos em três grupos experimentais: (1) controle (sem tratamento), (2) tratados com sEVs de normóxia (sEVs-Nor) e (3) tratados com sEVs de placentas hipóxicas cultivadas (sEVs-Hyp), que foram usados para avaliar a interrupção da BBB in vivo25. Todas as soluções injetadas eram estéreis. Além disso, o preparo dos sEVs foi realizado em condições assépticas e sob capuz de biossegurança classe II para evitar contaminação.
1. Explantes da cultura placentária
- Para extrair explantes de placentas gestacionais normais, verificar o método publicado por Miller et al., 200536.
- Remova cuidadosamente os coágulos da placa basal da placenta humana usando pinças esterilizadas. Extrair pequenos explantes para obter uma extração final de tecido de 10 g.
- Certifique-se de que os explantes placentários sejam removidos dos quatro quadrantes da porção materna da placenta. Certifique-se de que o tecido desvitalizado e as áreas calcificadas sejam excluídos.
- Para manipular o tecido placentário, faça-o no gelo, em condições estéreis e dentro de um gabinete de biossegurança.
- Lavar os explantes (pelo menos três vezes) com quantidades abundantes (cinco volumes dos explantes) de solução tampão fosfato fria (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) para remover o máximo de sangue possível. Centrifugar (252 x g por 10 min) à temperatura ambiente entre as lavagens.
- Ressuspender 10 g de explantes lavados em 20 mL de meio de cultura suplementado com 2% de soro fetal bovino, 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
- Coloque a suspensão em uma placa de cultura de 100 mm. Deixar os explantes durante 2 h numa estufa a 37 °C com 21% de oxigénio e 5% de CO2.
- Em seguida, lavar novamente os explantes com 1x PBS a 37 °C (três vezes). Centrifugar (252 x g por 10 min) à temperatura ambiente entre as lavagens.
- Em seguida, ressuspender o tecido em 20 mL de meio de cultura previamente esgotado de nanopartículas.
OBS: Para depleção de nanopartículas, realizar ultracentrifugação (120.000 x g por 18 h à temperatura ambiente) e microfiltração (filtro de 0,22 μm). - Divida os explantes ressuspensos em duas placas de culturas (100 mm). Cada placa de cultura deve incluir 10 mL de explantes ressuspensos.
- Em seguida, colocar uma das placas contendo explantes placentários em condições padrão de cultura (37 °C com 8% de oxigênio e 5% de CO2), enquanto a outra em uma câmara hipóxica com 1% de O2.
NOTA: (OPCIONAL) A análise da viabilidade tecidual pode ser realizada utilizando as mesmas extrações teciduais e o ensaio com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT assay), conforme descrito anteriormente37,38. Use a concentração de proteína total medida nos homogeneizados dos explantes para normalizar os valores de MTT. - Após 18 h de cultivo, colher o meio condicionado dos explantes em novo tubo de 15 mL.
NOTA: Nesta etapa, o meio condicionado pode ser congelado (-80 °C) por um período prolongado (semanas).
2. Isolamento de SVs derivados da placenta
- Isolar sEVs do meio condicionado usando o protocolo de centrifugação diferencial e microfiltração seguindo relatos publicados anteriormente25,39.
- Realizar centrifugação sequencial para o meio condicionado colhido. As etapas sequenciais das centrifugações são (1) 300 x g por 10 min, (2) 2000 x g por 10 min, (3) 10.000 x g por 30 min e (4) 120.000 x g por 2 h. Realizar as centrifugações à temperatura ambiente.
- Em todas essas centrifugações, usando uma pipeta de 20-100 μL, colete cuidadosamente o sobrenadante e descarte o pellet.
- Uma vez feito, passe o último sobrenadante coletado através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). Em seguida, realizar uma centrifugação adicional a 120.000 x g por 18 h à temperatura ambiente.
- Depois disso, descarte o sobrenadante enquanto ressuspende o pellet (que contém sEVs placentários) em 500 μL de PBS (pH 7,4) e passe novamente por um filtro de 0,22 μm. Finalmente, realizar uma última centrifugação a 120.000 x g por 3 h à temperatura ambiente.
- Em seguida, ressuspenda o pellet (que contém sEVs placentários) em 500 μL de PBS (pH 7,4, previamente esgotado de sEVs) e passe por um filtro de 0,22 μm.
- Rotular as amostras como estoque de sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) ou sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
NOTA: Preparar alíquotas de 50-100 μL dos sEVs isolados para experimentação posterior. Os pequenos veículos elétricos podem ser armazenados a -80 °C por um período prolongado (meses). - Caracterizar os sEVs placentários por tamanho, contagem e marcador proteico de sEVs, conforme relatado anteriormente25. O diâmetro médio ideal das partículas de sEVs é de 50-150 nm.
NOTA: A caracterização de sEVs inclui detecção positiva de CD63, Tsg101, Alix e HSP70 (ou seja, para caracterizar a população de sEVs enriquecida em exossomos). Utilizar também a PAPL como marcador de origem placentária25. - Meça a quantidade total de proteína na solução de sEVs usando o kit de ensaio de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
NOTA: A Figura 1 mostra uma visão geral da cultura do explante placentário e do isolamento da vesícula extracelular.
3. Injeção em ratos
- Anestesiar o animal em câmara de indução anestésica com distribuição de isoflurano a 5% (ver Tabela de Materiais). Verifique o nível de anestesia através de uma pinça do dedo do pé.
- Após ~40 s, coloque o mouse no sistema de anestesia usando uma máscara facial e mantenha um nível de anestesia de isoflurano a 2%.
- Em seguida, posicione o animal numa plataforma de aquecimento (ver Tabela de Materiais) a uma temperatura ambiente de 28 °C. Mantenha os olhos lubrificados com lágrimas artificiais.
- Antes da injeção, diluir os sEVs placentários (200 μg de proteína total) com tampão fosfato (pH, 7,4) até atingir um volume final de 70 μL.
- Desinfetar a área de injeção com etanol 70% e cotonetes. Certifique-se de usar uma seringa de insulina com uma agulha de 30 G para injetar a solução de sEVs.
NOTA: A seringa pode ser posicionada na plataforma de aquecimento por 5 min para adquirir uma temperatura fisiológica. - Em seguida, injete a solução na veia jugular externa. Esta etapa precisa de treinamento especial.
NOTA: O procedimento deve ser realizado com cautela, retraindo lentamente a agulha e aspirando suavemente até a evidência de refluxo sanguíneo. - Após a injeção, aplique uma leve pressão na área injetada por ~15 s com um cotonete seco. Depois disso, devolva os animais para suas respectivas gaiolas.
- Certifique-se de avaliar a consciência e o comportamento por 15 min. Um indicador da realização da consciência é a recuperação animal da atividade motora total.
NOTA: Certifique-se de manter uma temperatura quente nas gaiolas dos animais.
4. Escala de comportamento e coma murino rápido (RMCBS)
- Utilizar o RMCBS para avaliar os parâmetros neurológicos e de bem-estar dos animais40.
NOTA: O RMCBS permite uma avaliação rápida (~ 3 min) com o mínimo de estresse do animal devido à intervenção do operador. RMCBS tem dez parâmetros (cada escore é 0-2). - Avalie o bem-estar de camundongos com a escala RMCBS em 0 h (antes de injetar sEVs) e 3 h, 6 h, 12 h e 24 h após a injeção.
OBS: Realizar análise de claudina-5 (6 h após a injeção de sEVs) e extravasamento de azul de Evan (24 h após a injeção de sEVs) para avaliar a ruptura da BBB (Figura 2).
5. Análise do extravasamento azul de Evan
- Após a injeção de sEVs placentários (24 h), anestesiar os camundongos conforme descrito no passo 3.1.
- Preparar a solução azul de Evan (2%, diluída em solução tampão fosfato, 1x) (ver Tabela de Materiais).
- Com acesso retro-orbital25, injetar solução de Evan Blue a 2 mL/kg.
- Permitir que a solução azul de Evan circule por 20 minutos sob manutenção da anestesia.
- Em seguida, realizar perfusão intracardíaca seguindo o protocolo41 previamente descrito com solução salina (~3 mL, 0,9%, p/v) para remover o corante azul de Evan da circulação. Esta etapa é obrigatória.
NOTA: Para este procedimento, aumente a anestesia para 5% e verifique um plano profundo de anestesia (ou seja, redução drástica da frequência respiratória). - Expor o coração por toracotomia medial41 (Figura 3).
- Em seguida, fixar todo o animal com uma infusão intracárdica de solução de paraformaldeído (4% em PBS, v/v).
OBS: Verificar a rigidez da cauda para monitorar a fixação adequada. - Além disso, uma vez que a fixação esteja completa, extraia cuidadosamente o cérebro, pese-o e fotografe-o41. Tire fotos com todo o cérebro perto de uma régua42.
- Em seguida, coloque o cérebro em uma fatiadora de camundongos cerebrais (veja Tabela de Materiais).
- Dissecar o cérebro em nove seções, crane-caudal, incluindo o cerebelo (100 μm cada seção).
- Após a dissecção, visualize e capture imagens das fatias cerebrais em um microscópio de zoom estéreo (veja Tabela de Materiais).
- Use as imagens capturadas para quantificar o extravasamento azul de Evan usando o software ImageJ (consulte Tabela de Materiais).
NOTA: Para analisar a presença do corante azul de Evan, defina os valores de azul de Evan usando um controle positivo da seção cerebral (de um animal controle animal injetado com corante, mas sem perfusão intracárdica). Os valores do azul de Evan obtidos a partir do controle positivo estão geralmente entre 75 e 110 no histograma de intensidade do canal azul (Figura 4). - Certifique-se de que as imagens cerebrais sejam analisadas às cegas pelo respectivo grupo experimental para evitar viés de observador. Alternativamente, quantificar o extravasamento do azul de Evan por homogeneização cerebral seguida de espectroscopia43.
NOTA: Em experimentos separados, usando cérebros recém-isolados de camundongos injetados com sEVs (6 h), analise os níveis de proteína de claudina 5 (CLND-5) (ver Tabela de Materiais), uma junção apertada crítica envolvida na estanqueidade do BBB44 (Figura 5).
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Representative Results
Este protocolo avalia a capacidade de sEVs derivados de placentas cultivadas em hipóxia para interromper a BBB em camundongos não gestantes. Este método permite compreender melhor a conexão potencial entre a placenta e o cérebro em condições normais e patológicas. Em particular, este método pode constituir um proxy para analisar a participação de EVs placentárias no aparecimento de complicações cerebrais na pré-eclâmpsia.
Ao contrário dos camundongos injetados com sEVs-Nor, os camundongos injetados com sEVs-Hyp mostram um declínio progressivo no escore neurológico até 24 h (Tabela 1), o que sugere a capacidade dos sEVs-Hyp de prejudicar a função cerebral.
Além disso, cérebros de camundongos do grupo sEVs-Hyp injetado têm maior peso fresco do que aqueles isolados de camundongos injetados com sEVs-Nor ou camundongos controle (0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g, respectivamente), o que pode constituir um indicador grosseiro de edema cerebral45.
Compatível com esse achado, esse protocolo permite identificar o extravasamento azul de Evan como indicador de ruptura do BBB. A esse respeito, cérebros de camundongos injetados com sEVs-Hyp têm maior extravasamento de azul de Evan do que cérebros do grupo sEVs-Nor (Figura 5A).
Embora o mecanismo subjacente de ruptura da BBB induzida por sEVs-Hyp não tenha sido analisado com esse protocolo, os resultados também indicam que camundongos injetados com sEVs-Hyp mostraram quantidades reduzidas de proteína de CLND-5 nas áreas em que a BBB foi mais afetada (ou seja, áreas posteriores) (Figura 5B). Portanto, é factível que sEVs-hyp prejudique a expressão da função dessa proteína crítica de tight junction endotelial.
Figura 1: Protocolo de cultura de explantes placentários e de vesículas extracelulares. (A) Culturas normais de explantes placentários. (B) Os explantes distribuem-se em duas condições para a biogênese de pequenas vesículas extracelulares placentárias (EVs). Normóxia (sEVs-Nor, 8% O2) ou hipóxia (sEVs-Hyp, 1% O2) por 18 h. (C) O meio condicionado é colhido, filtrado e centrifugado para eliminar detritos celulares. (D) os sEVs são isolados por ultracentrifugações. (E) os sEVs são caracterizados usando análise de nano-tracking e western blot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação in vivo do protocolo de ruptura da barreira hematoencefálica. Camundongos C57BL6/J não prenhes, com 4-6 meses de idade, são usados. (A) Via veia jugular externa, os animais receberam sEVs (200 μg de proteína total) isolados de culturas placentárias Normoxic (sEVs-Nor, 8% O2) ou hipóxica (sEVs-Hyp, 1% O2). RMCBS é monitorado em 0-24 h após a injeção. (B) 6 h após a injeção de sEVs, os cérebros são extraídos e seccionados em nove segmentos para extração de proteínas. Claudin 5 (CLDN5) é analisada em homogeneizados dessas nove seções. (C) A análise do extravasamento azul de Evan (24 h após a injeção dos EVs) foi analisada após a injeção de punção retroorbitária em cada um dos nove segmentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Documentários fotográficos do corante azul de Evan e do protocolo de perfusão intracárdica. (A) O camundongo recebeu o azul de Evan por injeção retro-orbital. (Esquerda) Animal antes e (Direita) após a injeção (15 s) do azul de Evan. (B) Toracotomia para realização de perfusão intracárdica de tampão fosfato (1x PBS) e paraformaldeído (PFA 4%). O ventrículo esquerdo é apontado com a ponta da agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise do extravasamento do azul de Evan após injeção de sEVs. (A) Imagem representativa de todo o cérebro mostrando o extravasamento do azul de Evan. A linha tracejada representa nove seções obtidas de todo o cérebro. (B) Cérebro dissecado usando um fatiador de camundongos cerebrais. (C) Imagens representativas de cortes cerebrais em 24 h após a injeção de sEVs. Controle (CTL), placenta em condições normóxicas (sEVs-Nor) ou hipóxicas (sEVs-Hyp). Barra de escala = 0,4 cm. (D) Delineamento digital do corte cerebral usando ImageJ. (E) Histograma no canal azul. Valores entre 75-110 estão associados ao extravasamento do azul de Evan. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Extravasamento do azul de Evan e níveis de claudina-5 em camundongos injetados com sEVs isolados de explantes placentários. (A) Porcentagem de extravasamento do azul de Evan (BE) considerando todo o cérebro. Controle (CTL, azul), placenta em condições normóxicas (sEVs-Nor, vermelho) ou hipóxica (sEVs-Hyp, verde). (B) Os níveis relativos de claudina 5 (CLDN5) nos nove cortes cerebrais foram obtidos dos três grupos experimentais. β-actina é usado como um controle de carga. Os valores são média ± intervalo interquartil. Cada ponto representa um sujeito experimental individual. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; Teste ANOVA seguido de pós-teste de Bonferroni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo (h) | Controle | sEVs-Normoxia | sEVs-Hipóxia | ANOVA |
| 0 | 18,75 ± 0,250 | 18,5 ± 0,288 | 18,75 ± 0,250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19,25 ± 0,750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | 16,75 ± 1,109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17,75 ± 0,250 | 10.25 ± 0.853*α | <0,0001 |
| *p < 0,01 versus controle. αp < 0,01 versus sEVs-Normoxia | ||||
Tabela 1: Escala de comportamento e coma murino rápido (RMCBS) após 24 h após a injeção de EVs. O escore é expresso como média ± EPM. Os escores dos animais mais próximos de 20 são padrão, enquanto quanto menor o escore, maior a disfunção do SNC.
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Discussion
Este estudo revela novos insights sobre danos potenciais resultantes de sEVs isolados de explantes placentários cultivados em condições hipóxicas sobre o rompimento da barreira hematoencefálica de roedores. O mecanismo patológico envolve a redução do CLND-5 na região posterior do cérebro25.
Investigações prévias revelaram que os sEVs plasmáticos de indivíduos com pré-eclâmpsia induzem disfunção endotelial em vários órgãos usando modelos in vitro 46,47. Esta investigação examinou particularmente a barreira hematoencefálica, oferecendo uma nova perspectiva sobre os EVs isolados da placenta cultivada em hipóxia, que rompe essa barreira vital. Essas descobertas introduzem um novo campo de pesquisa em que os sEVs podem servir como um canal de comunicação entre a placenta e o cérebro em cenários normais e patológicos, como a pré-eclâmpsia.
O protocolo apresentado é simples, mas várias etapas críticas merecem ser mencionadas. Este protocolo necessita de placentas frescas dentro de 1 h após o parto. Também desaconselhamos estender o período de cultura para além de 24 h para evitar a degradação do tecido. Este protocolo mitiga a contaminação potencial de sEVs produzidos por placentas de camundongos. A análise digital do extravasamento azul de Evan é demorada. Além disso, a coloração azul de Evan é menos visível após a secção cerebral. Portanto, recomenda-se uma configuração inicial para identificar a faixa azul usando um controle positivo. Um controle negativo, como um cérebro de um camundongo não submetido à injeção azul de Evan, também pode ser empregado. A análise cega dos grupos experimentais é imperativa para evitar o viés do observador potencial.
Vários desafios podem surgir durante este protocolo. Uma limitação significativa reside na variabilidade biológica originada tanto de placentas humanas quanto de camundongos injetados. Para garantir a reprodutibilidade dos experimentos de extravasamento do azul de Evan, sugere-se o estabelecimento de doses de sEV isoladas de placentas humanas. Optou-se pela dose de 200 μg de proteína total; no entanto, essa quantidade pode variar com base na pureza da vesícula, na eficácia da injeção jugular, na administração do azul de Evan, na sua depuração do sistema circulatório e, não menos importante, no impacto biológico dos EVs considerando seu conteúdo.
Os mecanismos celulares pelos quais os sEVs da placenta humana podem romper a barreira hematoencefálica requerem experimentos adicionais. No entanto, esse método tem relevância, sugerindo uma comunicação potencial entre a placenta e o cérebro, justificando uma maior exploração. Portanto, futuras investigações são encorajadas, concentrando-se nos EVs e suas interações com a barreira hematoencefálica, bem como o impacto de sua carga nos tecidos neuronais. Se o comprometimento da barreira hematoencefálica leva a consequências duradouras para o cérebro materno merece um exame mais aprofundado.
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Disclosures
Os autores declaram não haver qualquer conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos pesquisadores da GRIVAS Health pela valiosa contribuição. Além disso, as parteiras e o corpo clínico do Serviço de Obstetrícia e Ginecologia pertencem ao Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
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