Summary
本手稿概述了用于培养原晶状体上皮细胞 （LEC） 的详细视频方案，旨在提高可重复性并帮助白内障和后囊混浊 （PCO） 的研究。它提供了有关晶状体解剖、LEC 分离和验证的分步说明，可作为有价值的指南，尤其是对于该领域的新手而言。
Abstract
晶状体上皮细胞（LECs）在维持晶状体的稳态和正常功能方面发挥着多种重要作用。LEC 决定了晶状体的生长、发育、尺寸和透明度。相反，功能失调的 LEC 可导致白内障形成和后囊混浊 （PCO）。因此，建立强大的原代LEC培养系统对于从事晶状体开发、生物化学、白内障治疗和PCO预防的研究人员非常重要。然而，由于原代LECs的可用性有限、增殖速度慢且性质脆弱，其培育长期以来一直面临挑战。
本研究通过提出原代 LEC 培养的综合方案来解决这些障碍。该方案包含基本步骤，例如配制优化的培养基、晶状体胶囊的精确分离、胰蛋白酶消化技术、传代培养程序、收获方案以及储存和运输指南。在整个培养过程中，使用相差显微镜监测细胞形态。
为了确认培养的LEC的真实性，进行了免疫荧光测定以检测关键晶状体蛋白（即αA和γ晶状体蛋白）的存在和亚细胞分布。这一详细的方案为研究人员提供了培养和表征原发性 LEC 的宝贵资源，从而促进了我们对晶状体生物学的理解和晶状体相关疾病治疗策略的开发。
Introduction
眼睛的晶状体通过将入射光聚焦到视网膜上，在视觉中起着至关重要的作用。它由透明的无血管结构组成，由特化细胞组成，其中晶状体上皮细胞 （LEC） 是关键参与者。LEC 位于晶状体的前表面，负责保持其透明度、调节水平衡并参与晶状体生长和发育 1,2。LEC 是位于晶状体前部的一种独特类型的细胞，通过在整个生命周期中持续产生晶状体纤维，在维持晶状体清晰度和功能方面发挥着关键作用。
白内障的特征是晶状体逐渐混浊，导致光线失真和散射，导致视力受损 3,4。白内障形成的确切机制是复杂和多因素的，涉及各种细胞和分子过程，如紫外线辐射、氧化损伤和糖基化 5,6。已发现 LEC 对白内障的发展有显着贡献，使其成为研究的重要焦点 1,2,7,8,9。
此外，当今眼科最紧迫的问题之一是后囊混浊 （PCO） 的发生率相对较高，也称为继发性白内障。PCO 仍然是白内障手术后最常见的并发症，在手术后 5 年内影响多达 20-40% 的成人患者和 100% 的儿童10.PCO主要是由白内障摘除术后残留在囊袋中的LEC引起的。这些细胞经历多方面的病理生理学转化，不仅涉及上皮-间充质转化 （EMT），还涉及 LEC 向晶状体纤维的分化，从而形成 LEC、纤维和肌成纤维细胞的混合物细胞群 11,12,13。转化的细胞增殖并迁移到晶状体后囊，导致视力障碍。了解培养模型中 LEC 的行为和控制机制可以为 PCO 的预防和管理提供有价值的见解。因此，这种培养 LEC 的方案为眼科研究人员提供了一个重要的工具，旨在研究、理解并最终对抗这种普遍的术后并发症。
为了揭示LEC生物学的复杂性及其在白内障形成和PCO中的作用，必须建立强大且可重复的 体外 原代细胞培养系统。原代 LEC 培养为研究人员提供了一个受控环境来研究 LEC 的功能、信号传导和分子特征。此外，它还允许研究细胞过程和不同实验条件的影响，为晶状体生理学和病理学提供有价值的见解。
先前的研究丰富了我们对LEC培养技术的理解14,15,16,17,18,19,20。尽管这些研究采用了各种方法，并在LEC行为和特征方面取得了重要发现，但目前的文献中缺乏用于培养LEC的全面且可访问的视频记录方案。这种局限性会阻碍新手研究人员准确重现技术的能力，并可能导致实验结果的不一致和变化。通过提供视频录制协议，本文旨在弥合这一差距，并提供一种标准化资源，以提高LEC文化领域的可重复性并促进知识转移。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均按照视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的指南进行。程序批准由北德克萨斯大学健康科学中心动物护理和使用委员会（协议编号：IACUC-2022-0008）授予。这些研究使用了通常低于2周龄的年轻C57BL / 6J小鼠。
1.培养基制备及晶状体解剖
- 通过向 450 mL DMEM 中加入 50 mL 胎牛血清 （FBS） 和 0.1 mL 50 mg/mL 庆大霉素来制备培养基。
- 人道地对小于2周的C57BL / 6J小鼠实施安乐死。
注意：我们使用 CO2 吸入法实施安乐死。CO2 安乐死系统的最佳流速应位移 30% 至 70% 的腔室或笼容积/分钟。 - 用手术剪刀轻轻取下眼睑，并用弯曲的镊子在眼窝的两侧轻轻按压，使眼睛向外突出。使用白内障刀在角膜上仔细切开，然后用弯曲的镊子小心地取出晶状体，确保不会损坏晶状体或其囊。
注意： 执行这些步骤时要小心，以保持镜头囊的完整性。由于镜片的脆弱性，使用带有弯曲和钝头的解剖工具非常重要，以最大限度地降低镜片损坏的风险。 - 使用带有钝头的弯曲镊子将镜片转移到 60 mm 塑料组织培养皿中，该培养皿中装满了 5 mL 预热和无菌的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 溶液，其中含有 10 μg/mL 庆大霉素。
- 用含有 10 μg/mL 庆大霉素的 DPBS 溶液轻轻冲洗镜片，以去除任何潜在的碎屑或污染物，为进一步处理镜片做好准备，并保持无菌培养环境。
- 为了获得足够数量的 LEC，将 4 个透镜用于 24 孔培养板，将 6 个透镜用于 6 孔培养板。
2. LECs隔离
- 完成漂洗过程后，将镜头放在一张滤纸上，让它干燥。
- 镜片充分干燥后，小心地将其转移到培养皿的盖子上，为取出镜片胶囊做准备。
- 向上旋转晶状体，确保前节朝上。在使用镊子夹住前囊的同时，使用惯用手的囊镊子在囊中产生一个小撕裂。向相反方向轻轻拉动两个工具以取出胶囊并将其放入 DPBS 中，直到完成所有晶状体解剖。
注意：为避免任何差异，研究人员应立即解剖每个晶状体上皮囊并将它们暂时储存在 DPBS 中。只有在完成所有解剖后，胶囊才能集体转移到保持在37°C的胰蛋白酶中，确保同步和均匀的暴露。 - 小心地将镜头囊转移到 6 孔板上。向每个孔中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液以启动酶解过程。
- 轻轻搅拌胰蛋白酶溶液以确保均匀渗透。将板置于细胞培养箱中，让胶囊在37°C下消化8-10分钟。
注意：此步骤有助于晶状体囊组织的分解和随后单个上皮细胞的释放。 - 孵育后，使用解剖剪刀小心地切碎消化的晶状体胶囊，以分解任何残留的组织团块并促进细胞分离。
注意：强调组织切碎的彻底性，以确保从消化的晶状体胶囊中有效释放细胞。 - 加入 0.5 mL 含有 10% FBS 的培养基以淬灭胰蛋白酶。将组织样品转移到离心管中，并以1,000× g 离心5分钟。
- 小心地除去上清液，不要干扰细胞沉淀。使用 1 mL 培养基重悬细胞并将细胞接种在 24 孔板中。
- 每 2-3 天更换一次培养基。
3. LECs亚文化
- 一旦细胞达到汇合，从培养皿中取出培养基。继续用 1 mL DPBS 洗涤细胞 2 次。
- 加入 200 μL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将细胞置于培养箱中 5 分钟。
- 孵育后，将细胞从培养箱中取出并在显微镜下检查它们，以确认它们已从培养皿中分离并开始漂浮。
- 加入 1 mL 培养基，轻轻移液细胞 3-5 倍以分离所有细胞。
- 将细胞转移到离心管中，并以1,000× g 离心5分钟。
- 小心地除去上清液并将细胞重悬于完整的生长培养基中。
- 如果需要，使用血细胞计数器计数细胞数量。
- 以 1：2 或 1：3 的比例细分细胞悬液以进行传代培养。
- 当培养物再次汇合时，重复上述过程。
注意：LEC在高密度培养条件下茁壮成长。避免过度稀释细胞，因为这可能会阻碍它们的生长。
4.储存和运输
注意：理想的存储单元数是 ~1 × 106。
- 用 1 mL DPBS 彻底洗涤细胞 3 次。洗涤后，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并将细胞置于培养箱中 5 分钟。
- 加入 2 mL 完全培养基，将细胞悬液转移到离心管中，并以 1,000 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液并将细胞重悬于由 90% FBS 和 10% DMSO 组成的冷冻培养基中，目标是细胞密度为 1 ×10 6 个细胞/mL。将细胞悬液转移到冷冻管中。
- 立即将细胞移至-20°C环境中1小时，然后在-80°C下过夜，然后永久储存在液氮中。
注意：如果没有液氮，则可以在-80°C下初始一小时后将细胞储存在-20°C。 - 如果需要发货，请将冷冻管中的细胞装在装有干冰的包装中，以便隔夜交付。
- 收到细胞后，确保快速回收并将细胞置于传代培养中。如果立即培养不可行，则将细胞转移到液氮中进行长时间储存。
注意： 如果要运送细胞，请确保样品深埋在干冰中，以防止温度波动造成潜在损坏。
5. LEC验证
- 将LEC板入带有盖玻璃的35mm培养皿中，并培养约48小时。
- 用PBS洗涤细胞2次，并在-20°C下用冷甲醇固定细胞10分钟。
- 用PBS洗涤固定细胞3×5分钟，并在室温下用封闭缓冲液孵育固定细胞1小时，以防止非特异性结合。
- 封闭后，将细胞在4°C下与一抗（αA-晶状体蛋白，γ-晶状体蛋白和PROX1抗体）在稀释缓冲液中以1：50的比例单独稀释。
- 用PBS洗涤细胞3×5分钟，并将二抗在稀释缓冲液中以1：100稀释的二抗孵育1小时。
- 用PBS洗涤细胞3×5分钟，并在室温下用PBS中的5μg/ mLHoechst 33342染色细胞10分钟以观察细胞核。
- 用PBS洗涤细胞2×5分钟以除去多余的染色溶液，并使用荧光显微镜捕获细胞的荧光图像，使用DAPI通道用于细胞核，FITC通道用于αA-，γ-晶状体蛋白和PROX1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
如 图2所示，通过遵循该方案，来自C57BL / 6J小鼠的原代LEC在4小时内粘附在培养皿上。值得注意的是，有其他组织的可见残留物，例如后囊和晶状体纤维细胞的部分。然而，这些意想不到的元素并没有附着在培养皿上，因此可以通过改变培养基来去除。随后，在第三天和第五天之间，LEC开始了其扩散阶段。然后，在第七天和第十天之间可以观察到快速增长，这是对数增殖阶段的特征。在细胞未进入快速生长阶段的情况下，建议将生长补充剂（如 EpiCGS-a）加入培养基中。此外，我们观察到，与10%FBS相比，细胞在含有20%FBS的培养基中表现出更快的生长速度。较低的 FBS 浓度通常促进较慢的生长，反映了晶状体中央上皮的特征，而 20% 的 FBS 浓度复制了晶状体增殖区的属性。
根据开发永生化人晶状体上皮细胞系 B3 的 Reddy 等人和 Andley 等人的说法，预计 LEC 应该表达各种晶状体特异性蛋白，例如 αA 和 γ-晶状体蛋白 2,21。因此，在这项研究中，我们采用αA和γ-晶状体蛋白作为细胞标记物来验证细胞作为LEC的身份。在玻璃盖玻片上培养最初三个通道内的LEC。使用对αA和γ-晶状体蛋白具有特异性的一抗将细胞孵育过夜。如图 3 所示，这些细胞表现出 αA 和 γ-晶状体蛋白的强烈表达，为它们是晶状体衍生的上皮细胞提供了明确的证据。此外，我们使用 PROX1 作为纤维细胞的成熟标记物来标记主要 LEC。数据表明，这些LECs对PROX1的染色呈阴性，证实这些细胞是上皮细胞，尚未分化为纤维细胞。
图 1：LEC 培养的分步工作流程。 该图描绘了原代晶状体上皮细胞培养所涉及的连续步骤。第 1 步涉及在前囊中产生小撕裂。第 2 步需要轻轻取下镜片囊。在步骤3中，将透镜囊小心地转移到24孔板中，并在37°C下与0.05%胰蛋白酶溶液一起孵育10分钟。孵育后，使用解剖剪刀将消化的晶状体胶囊切碎以促进细胞分离。步骤4涉及通过向离心管中加入0.5 mL含有20%FBS的培养基来淬灭胰蛋白酶，并将组织样品以1,000× g 离心5分钟。步骤 5 需要将细胞重悬于 1 mL 培养基中，并将其接种在 24 孔板中。最后，步骤 6 涉及每 2-3 天更换一次培养基，以支持整个实验过程中的细胞生长和维持。缩写：LECs = 晶状体上皮细胞;FBS = 胎牛血清。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：LEC 随时间的变化模式。 在相差显微镜下记录原代晶状体上皮细胞在其生长过程中不同时间点的形态变化。第 1、2、3、5、7 和 10 天拍摄的图像描绘了不断演变的细胞形态，提供了对晶状体上皮细胞随时间推移的发育和行为的见解。红色箭头表示活跃增殖的晶状体上皮细胞的位置。比例尺 = 100 μm。缩写：LECs = 晶状体上皮细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：LECs的验证。 （A）小鼠LECs中αA-晶状体蛋白的免疫染色。用 Hoechst 33342（蓝色）和 αA-晶状体蛋白抗体（绿色）对原代 mLEC 进行染色。（B） 小鼠LEC中γ-晶状体蛋白的免疫染色。（C） 小鼠 LEC 中 PROX1 的免疫染色。用 Hoechst 33342（蓝色）和 PROX1 抗体（绿色）对原代 mLEC 进行染色。比例尺 = 50 μm。缩写：LECs = 晶状体上皮细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文介绍的方案为成功分离、培养和传代 LEC 提供了全面的分步指南，并附有视频文档。详细的视觉指南和书面说明增强了协议的清晰度和可访问性，促进了该领域研究人员的使用和可重复性。最终目的是促进围绕 LEC 在白内障形成和 PCO（白内障手术后普遍存在的并发症）中的作用的知识体系的扩展。
当将原代 LEC 与晶状体上皮细胞系（如 HLE-B3 和 SRA01/04）进行比较时，每种细胞在研究环境中都具有独特的优势和挑战。HLE-B3 细胞系与 SRA01/04 一起代表了一类细胞系，虽然易于处理和耐用，但由于其持续复制和长时间的培养条件，经常表现出遗传和表型变化。这可能导致与原始 LEC 的功能存在显着差异，从而降低其响应的真实性。相反，直接从患者或研究动物的活组织中分离出的原代LEC更准确地反映了 体内晶状体的自然细胞环境和固有反应。尽管它们的提取和培养增加了复杂性，但它们在需要高度生理相关性的研究中通常是首选，因为它们提供了更准确和可靠的结果。
在遵循此协议时必须考虑一些关键点。这些研究使用了通常低于2周龄的年轻C57BL / 6J小鼠。我们观察到，与来自 2 个月或以上小鼠的 LEC 相比，从这些年轻小鼠身上收获的 LEC 表现出更旺盛的生长。这表明小鼠的年龄与细胞生长之间存在负相关。
从鼠眼中解剖晶状体是一项微妙的任务，需要小心使用解剖工具来保持晶状体及其胶囊的完整性。协议第 1 节中概述的程序可确保以最小的损坏成功取出晶状体。虽然保持晶状体囊的健康和完整性具有挑战性，但其重要性不容小觑，因为任何损坏都可能影响分离的 LEC 的质量和数量。值得注意的是，大多数细胞分裂通常发生在晶状体赤道区域附近的萌发区，该区域不容易进行培养。根据 Zetterberg 等人的说法，尽管晶状体上皮的中央部分在正常情况下表现出最小的有丝分裂活性，但利用氚化胸苷 （3H-Tdr） 标记的实验已将这些位于中心位置的晶状体上皮细胞标记为潜在的干细胞17,22。干细胞表现出独特的特征，例如尽管在标准条件下具有较低的增殖速率，但具有无限的增殖能力。因此，晶状体上皮的中央部分可能比萌发区更能代表 LEC 的增殖能力。
如协议第2节所述，LEC的分离构成了该实验程序中的关键步骤。仔细执行包括去除晶状体囊、酶消化和组织碎裂在内的整体动作，以将单个上皮细胞从囊中分离出来。该过程中的关键因素之一是胰蛋白酶消化的持续时间。建议将消化时间设置在8至10分钟之间。如果该时间缩短到少于 5 分钟，则可能导致细胞分离不完全。相反，这个时间范围的过度延长可能会严重损害细胞活力。采用胰蛋白酶-EDTA作为细胞解离试剂，结合补充有20%FBS和10 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基，可优化细胞释放和随后的增殖，同时降低潜在的污染风险。
抗生素常用于预防原代LEC培养过程中的细菌污染。但是，应谨慎选择抗生素。常用的抗生素（如青霉素和链霉素）以及抗真菌剂有可能影响 LEC 的活力。作为替代方案，建议使用浓度为 10 μg/mL 的庆大霉素溶液以获得最佳 LEC 生长。
此外，保持高细胞密度是成功进行原代LEC培养的另一个关键因素。与已建立的细胞系不同，原代 LEC 需要更高的细胞密度才能实现最佳生长。这主要是由于它们依赖于有效的细胞间通讯，通过直接接触或旁分泌信号传导促进，这有助于维持它们的分化状态和功能。高细胞密度还可以减轻“培养休克”的不利影响，“培养休克”是原代细胞在分离并置于与其体内来源明显不同的体外环境中时所经历的一种情况23。通过模拟更像体内的环境，高细胞密度可以提高存活率。此外，这种密度有助于建立生长因子和细胞因子的浓度梯度，以支持细胞生长和功能。鉴于许多原代细胞是锚定依赖性的，需要表面附着才能增殖，高细胞密度提供了足够数量的相邻细胞进行粘附，从而促进健康生长。因此，细胞密度的调节是原代细胞培养中的关键考虑因素，因为它对细胞通讯、存活和增殖有重大影响。建议选择较小的培养皿，例如 24 孔或 6 孔板，为 LEC 创造理想的环境。遵循该方案通常会导致 LEC 在培养后 ~10-14 天达到汇合状态。我们建议在较少的传代次数（理想情况下在 P0 和 P6 之间）使用 LEC，以确保实验中最自然的行为。超过 7-10 次传代后，LEC 可能表现出生长减弱，并且可能不会像下层传代中的细胞那样对实验条件做出反应。
血清浓度与细胞生长速率直接相关。较低水平的FBS更有可能诱导较慢的生长，类似于中央上皮的特征。相反，较高的FBS水平与增殖区的条件相似。如果细胞生长缓慢，例如需要从老年或转基因动物中分离LEC时可能发生的情况，则将FBS增加到20%或向培养基中添加生长添加剂，如EpiCGS-a（5mL，参见 材料表）可能是有益的。这种血清和补充剂的富集可以增强细胞增殖，促进上皮细胞的最佳生长。
储存和运输协议（协议第5节）考虑了与活细胞保存和运输相关的挑战。冷冻介质的选择对于LEC在储存和运输过程中的生存至关重要。我们尝试了不同的冷冻培养基，包括 70% 完全培养基 + 20% FBS + 10% DMSO;90% FBS + 10% DMSO;以及无DMSO和无血清的冷冻培养基。我们的实验证据表明，含有 10% DMSO 和 90% FBS 的溶液在保持细胞活力方面表现出卓越的性能。利用这种特定的配方，我们成功地将原代LECs维持在-80°C的储存时间超过10年，证明了这种方法的稳健性及其促进储存后细胞再生的能力。
αA-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白用作LECs的标志物。PROX1被用作晶状体光纤细胞的标志物。PAX6、FOXE3 和 E-cadherin 等其他标志物也可用于表征 LEC 表型。如果研究人员有兴趣探索EMT，则应使用αSMA作为标记物。必须根据实验的具体要求和为所用的相应抗体提供的建议调整孵育时间和稀释度。
虽然这项研究提出了一种培养原代LEC的稳健方法，但重要的是要承认其局限性。虽然最初分离的细胞是原代 LEC，但任何传代培养、胰蛋白酶消化和复活程序都会导致其状态的改变。我们设计的方案主要使用鼠标镜头作为LEC的来源;然而，LEC也可以从其他资源中培养，包括白内障患者样本、眼库眼睛或患有不同眼部疾病（包括青光眼和糖尿病视网膜病变）的患者17,24。从老年人或患有特定眼部疾病的人身上收获的LEC可能不如来自更年轻、更健康的细胞那样有效地遵守该方案。从较老或转基因的个体或动物中培养LEC可能需要优化培养基，可能通过将FBS增加到20%或加入额外的生长因子。此外，Menko 等人先前对原代胚胎雏鸡晶状体上皮细胞培养物进行的研究表明，在培养的第二天后发生自发分化25。因此，研究人员应谨慎行事并考虑方法的差异，特别是如果研究差异是他们的主要研究目标。
可以使用各种方法培养原代 LEC。例如，Ibaraki 等人、Sundelin 等人和 Andjelic 等人开发的方法涉及使用白内障手术期间收集的晶状体囊的前部直接在培养皿上培养原代 LEC 16,17,19,20。这种方法保持了细胞间的自然接触和细胞外基质，提供了对PCO等疾病至关重要的高度生理相关性。或者，晶状体外植体方法，如Zelenka等人概述的，保留了天然组织结构，允许进行更具生理相关性的研究，特别有利于探索LEC的终末分化、细胞相互作用和晶状体发育过程，从而详细了解分化过程中的连续细胞和分子事件26。
相比之下，本方案中描述的胰蛋白酶消化方法产生均匀的单细胞悬浮液，简化了均匀接种和精确细胞计数，这有利于某些实验，如细胞活力和增殖测定、药物筛选和细胞信号通路分析。然而，重要的是要承认，虽然这种方法由于其均匀的细胞群而促进了对照和精确的研究，但由于酶处理，它可能会改变细胞行为并损害外植体和直接培养方法中的生理相关性。对于专注于研究上皮细胞的研究人员来说，这种方法被证明是高度适用和方便的，为这些细胞的特征和行为提供了可靠的见解。然而，对于那些科学研究延伸到细胞分化的人来说，考虑替代方法（例如外植体技术）或调整和优化当前方法以涵盖这些方面变得至关重要。
总体而言，该协议的设计仔细考虑了LEC的特定需求和要求。从解剖到验证，每一步都经过精心设计，以保持细胞的活力和功能。因此，对于研究LEC及其在眼部生理学和病理学中的作用的研究人员来说，它可以成为有价值的指南。未来的研究可以调整和修改该协议，以探索LEC生物学的不同方面，为进一步了解晶状体相关疾病以及开发白内障和PCO预防的新治疗策略提供平台。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NEI R21EY033941（对吴洪利）的支持;国防部W81XWH2010896（致吴洪利）;R15GM123463-02 （致Kayla Green和Hongli Wu）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
