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Biology

माउस प्राथमिक लेंस उपकला सेल संस्कृति का अनुकूलन: Trypsinization के लिए एक व्यापक गाइड

Published: June 21, 2024 doi: 10.3791/65912
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि प्राथमिक लेंस उपकला कोशिकाओं (एलईसी) के संवर्धन के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करती है, जिसका उद्देश्य मोतियाबिंद और पीछे कैप्सूल ओपेसिफिकेशन (पीसीओ) में प्रजनन क्षमता और सहायता अनुसंधान में सुधार करना है। यह लेंस विच्छेदन, एलईसी अलगाव और सत्यापन पर चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है, विशेष रूप से क्षेत्र में नए लोगों के लिए एक मूल्यवान मार्गदर्शक के रूप में कार्य करता है।

Abstract

लेंस उपकला कोशिकाएं (एलईसी) होमियोस्टैसिस और लेंस के सामान्य कार्य को बनाए रखने में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एलईसी लेंस वृद्धि, विकास, आकार और पारदर्शिता निर्धारित करते हैं। इसके विपरीत, बेकार एलईसी मोतियाबिंद गठन और पीछे कैप्सूल अपारदर्शिता (पीसीओ) का कारण बन सकता है। नतीजतन, लेंस विकास, जैव रसायन, मोतियाबिंद चिकित्सा विज्ञान और पीसीओ की रोकथाम में लगे शोधकर्ताओं के लिए एक मजबूत प्राथमिक एलईसी संस्कृति प्रणाली स्थापित करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, प्राथमिक एलईसी की खेती ने उनकी सीमित उपलब्धता, धीमी प्रसार दर और नाजुक प्रकृति के कारण लंबे समय से चुनौतियां पेश की हैं।

यह अध्ययन प्राथमिक एलईसी संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पेश करके इन बाधाओं को संबोधित करता है। प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम शामिल हैं जैसे कि एक अनुकूलित संस्कृति माध्यम का निर्माण, लेंस कैप्सूल का सटीक अलगाव, ट्रिप्सिनाइजेशन तकनीक, उपसंस्कृति प्रक्रियाएं, फसल प्रोटोकॉल और भंडारण और शिपमेंट के लिए दिशानिर्देश। संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, सेल आकृति विज्ञान चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की गई थी.

सुसंस्कृत एलईसी की प्रामाणिकता की पुष्टि करने के लिए, महत्वपूर्ण लेंस प्रोटीन, अर्थात् αA- और γ-क्रिस्टलीय की उपस्थिति और उपकोशिकीय वितरण का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आयोजित किए गए थे। यह विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को प्राथमिक एलईसी की खेती और विशेषता के लिए एक मूल्यवान संसाधन से लैस करता है, लेंस जीव विज्ञान की हमारी समझ में प्रगति और लेंस से संबंधित विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम करता है।

Introduction

आंख का लेंस रेटिना पर आने वाली रोशनी को केंद्रित करके दृष्टि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसमें विशेष कोशिकाओं से बना एक पारदर्शी, अवशिष्ट संरचना होती है, जिनमें से लेंस उपकला कोशिकाएं (एलईसी) प्रमुख खिलाड़ी होती हैं। एलईसी लेंस के पूर्वकाल सतह पर स्थित हैं और इसकी पारदर्शिता बनाए रखने, पानी के संतुलन को विनियमित करने, और लेंस विकास औरविकास 1,2 में भाग लेने के लिए जिम्मेदार हैं. एलईसी लेंस के पूर्वकाल भाग में स्थित एक अद्वितीय प्रकार की कोशिकाएं हैं, जो जीवन भर लेंस फाइबर का लगातार उत्पादन करके लेंस स्पष्टता और कार्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।

मोतियाबिंद लेंस के प्रगतिशील बादल की विशेषता है, विरूपण और प्रकाश के प्रकीर्णन में जिसके परिणामस्वरूप, समझौता दृष्टि 3,4 के लिए अग्रणी. मोतियाबिंद गठन अंतर्निहित सटीक तंत्र जटिल और बहुक्रियाशील हैं, जिसमें यूवी विकिरण, ऑक्सीडेटिव क्षति और ग्लाइकेशन 5,6जैसे विभिन्न सेलुलर और आणविक प्रक्रियाएं शामिल हैं। एलईसी मोतियाबिंद के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए पाया गया है, जिससे उन्हेंअनुसंधान 1,2,7,8,9का एक महत्वपूर्ण केंद्र बना दिया गया है।

इसके अलावा, नेत्र विज्ञान में सबसे अधिक दबाव वाले मुद्दों में से एक आज पोस्टीरियर कैप्सूल ओपेसिफिकेशन (पीसीओ) की अपेक्षाकृत उच्च घटना है, जिसे माध्यमिक मोतियाबिंद भी कहा जाता है। पीसीओ मोतियाबिंद सर्जरी के बाद सबसे आम जटिलता बनी हुई है, जो 20-40% वयस्क रोगियों और 100% बच्चों को 5 साल के भीतर सर्जरी के बादप्रभावित करती है। पीसीओ मुख्य रूप से अवशिष्ट एलईसी के कारण होता है जो मोतियाबिंद निष्कर्षण के बाद कैप्सुलर बैग में रहते हैं। इन कोशिकाओं को एक बहुआयामी पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन से गुजरना पड़ता है जिसमें न केवल उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) बल्कि लेंस फाइबर के लिए एलईसी का भेदभाव भी होता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल आबादी होती है जो एलईसी, फाइबर और मायोफिब्रोब्लास्ट्स 11,12,13का मिश्रण होती है। रूपांतरित कोशिकाएं पीछे के लेंस कैप्सूल में फैलती हैं और पलायन करती हैं, जिससे दृश्य हानि होती है। संस्कृति मॉडल में एलईसी के व्यवहार और नियंत्रण तंत्र को समझना पीसीओ की रोकथाम और प्रबंधन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसलिए, एलईसी संवर्धन का यह प्रोटोकॉल नेत्र शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रस्तुत करता है जिसका उद्देश्य इस प्रचलित पश्चात जटिलता का अध्ययन, समझना और अंततः मुकाबला करना है।

एलईसी जीव विज्ञान की पेचीदगियों और मोतियाबिंद गठन और पीसीओ में इसकी भूमिका को जानने के लिए, इन विट्रो प्राथमिक सेल संस्कृति प्रणालियों में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थापित करना आवश्यक है। प्राथमिक एलईसी संस्कृति शोधकर्ताओं को एलईसी के कार्यों, सिग्नलिंग और आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती है। इसके अलावा, यह सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच और विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रभावों की अनुमति देता है, लेंस शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

पूर्व अनुसंधान ने एलईसी संस्कृति तकनीकों 14,15,16,17,18,19,20की हमारी समझ को समृद्ध किया है। यद्यपि इन अध्ययनों ने विभिन्न पद्धतियों को नियोजित किया है और एलईसी व्यवहार और विशेषताओं पर महत्वपूर्ण निष्कर्ष निकाले हैं, एलईसी संवर्धन के लिए एक व्यापक और सुलभ वीडियो रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल वर्तमान साहित्य में अनुपस्थित है। यह सीमा नौसिखिए शोधकर्ताओं की तकनीकों को सटीक रूप से पुन: पेश करने की क्षमता में बाधा डाल सकती है और प्रयोगात्मक परिणामों में विसंगतियों और विविधताओं को जन्म दे सकती है। एक वीडियो रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल प्रदान करके, इस शोध पत्र का उद्देश्य इस अंतर को पाटना और एक मानकीकृत संसाधन प्रदान करना है जो प्रजनन क्षमता को बढ़ा सकता है और एलईसी संस्कृति के क्षेत्र में ज्ञान हस्तांतरण की सुविधा प्रदान कर सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए विजन और नेत्र विज्ञान दिशा निर्देशों में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के अनुसार प्रदर्शन किया गया. यूनिवर्सिटी ऑफ नॉर्थ टेक्सास हेल्थ साइंस सेंटर एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (प्रोटोकॉल नंबर: IACUC-2022-0008) द्वारा प्रक्रियात्मक अनुमोदन प्रदान किया गया था। युवा C57BL/6J चूहों, आमतौर पर 2 सप्ताह से कम उम्र के, इन अध्ययनों में उपयोग किए गए थे।

1. संस्कृति मध्यम तैयारी और लेंस विच्छेदन

  1. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल और डीएमईएम के 450 एमएल में 50 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के 0.1 एमएल जोड़कर संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  2. मानवीय रूप से C57BL/6J चूहों को 2 सप्ताह से कम उम्र का इच्छामृत्यु दें।
    नोट: हमने सीओ2 इनहेलेशन विधि का उपयोग करके इच्छामृत्यु की। सीओ2 इच्छामृत्यु प्रणालियों के लिए एक इष्टतम प्रवाह दर कक्ष या पिंजरे की मात्रा / मिनट के 30% से 70% विस्थापित करना चाहिए।
  3. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके पलकों को धीरे से हटा दें और आंख सॉकेट के विपरीत किनारों पर घुमावदार चिमटी के साथ नाजुक दबाव लागू करें, जिससे आंख बाहर की ओर फैलती है। मोतियाबिंद चाकू का उपयोग करके कॉर्निया पर सावधानीपूर्वक चीरा लगाएं और लेंस या उसके कैप्सूल को कोई नुकसान सुनिश्चित नहीं करते हुए, घुमावदार चिमटी का उपयोग करके लेंस को सावधानीपूर्वक निकालें।
    नोट: लेंस कैप्सूल की अखंडता को बनाए रखने के लिए इन चरणों को करते समय सावधानी बरतें। लेंस की नाजुक प्रकृति के कारण, लेंस क्षति के जोखिम को कम करने के लिए घुमावदार और कुंद युक्तियों के साथ विदारक उपकरणों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
  4. लेंस को 60 मिमी प्लास्टिक टिशू कल्चर डिश में स्थानांतरित करने के लिए कुंद युक्तियों के साथ घुमावदार चिमटी का उपयोग करें, जो 5 एमएल प्रीवार्म्ड और बाँझ डलबेको के फॉस्फेट बफर खारा (डीपीबीएस) समाधान से भरा हुआ है जिसमें 10 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन है।
  5. किसी भी संभावित मलबे या दूषित पदार्थों को हटाने के लिए 10 μg/mL जेंटामाइसिन युक्त DPBS समाधान के साथ लेंस को धीरे से कुल्ला, आगे की प्रक्रिया के लिए लेंस तैयार करें, और एक बाँझ संस्कृति वातावरण बनाए रखें।
  6. एलईसी की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, 24-अच्छी संस्कृति प्लेट के लिए चार लेंस और 6-अच्छी संस्कृति प्लेट के लिए छह लेंस पूल करें।

2. एलईसी अलगाव

  1. रिंसिंग प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, लेंस को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर रखें, जिससे यह सूख जाए।
  2. एक बार लेंस पर्याप्त रूप से सूख जाता है, लेंस कैप्सूल हटाने के लिए तैयारी में एक पेट्री डिश के कवर करने के लिए यह ध्यान से हस्तांतरण.
  3. लेंस को ऊपर की ओर घुमाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूर्वकाल खंड ऊपर की ओर है। पूर्वकाल कैप्सूल को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करते समय, कैप्सूल में एक छोटा आंसू बनाने के लिए प्रमुख हाथ में कैप्सुलोरहेक्सिस संदंश को नियोजित करें। कैप्सूल को हटाने के लिए दो उपकरणों को विपरीत दिशाओं में धीरे से खींचें और इसे डीपीबीएस में तब तक रखें जब तक कि सभी लेंस विच्छेदन पूरे न हो जाएं।
    नोट: किसी भी विसंगतियों से बचने के लिए, शोधकर्ताओं को तुरंत प्रत्येक लेंस उपकला कैप्सूल को विच्छेदित करना चाहिए और अस्थायी रूप से उन्हें डीपीबीएस में संग्रहीत करना चाहिए। सभी विच्छेदन को पूरा करने के बाद ही कैप्सूल सामूहिक रूप से 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा ट्रिप्सिन को स्थानांतरित कर रहे हैं, सिंक्रनाइज़ और वर्दी जोखिम सुनिश्चित करते हैं।
  4. ध्यान से एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए लेंस कैप्सूल हस्तांतरण. एंजाइमी पाचन प्रक्रिया शुरू करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 0.05% ट्रिप्सिन समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
  5. धीरे-धीरे ट्रिप्सिन समाधान को भी पारगम्यता सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजित करें। एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और कैप्सूल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 मिनट के लिए पचाने की अनुमति दें।
    नोट: यह कदम लेंस कैप्सूल ऊतक के टूटने और व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं के बाद की रिहाई की सुविधा प्रदान करता है।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, ध्यान से किसी भी शेष ऊतक गुच्छों को तोड़ने और सेल जुदाई को बढ़ावा देने के लिए विदारक कैंची का उपयोग करके पचने वाले लेंस कैप्सूल को कीमा बनाएं।
    नोट: ऊतक खनन में पूर्णता पचने वाले लेंस कैप्सूल से कुशल सेल रिलीज सुनिश्चित करने के लिए जोर दिया जाता है।
  7. ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए 10% एफबीएस युक्त संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें। ऊतक के नमूनों को एक सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर स्थानांतरित करें।
  8. ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और 24-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को बीज देने के लिए संस्कृति माध्यम के 1 एमएल का उपयोग करें।
  9. हर 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम बदलें।

3. LECs उपसंस्कृति

  1. एक बार कोशिकाओं संगम प्राप्त करने के बाद, संस्कृति पकवान से माध्यम को हटा दें. डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 2x धोने के लिए आगे बढ़ें।
  2. ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को 5 मिन के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और यह पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत उनका निरीक्षण करें कि वे संस्कृति पकवान से अलग हो गए हैं और तैरने लगे हैं।
  4. संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और धीरे सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोशिकाओं को 3-5x विंदुक करें।
  5. कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर स्थानांतरित करें।
  6. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें और पूर्ण विकास माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. यदि आवश्यक हो, तो हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर की गणना करें।
  8. उपसंवर्धन उद्देश्यों के लिए सेल निलंबन को 1:2 या 1:3 के अनुपात में उप-विभाजित करें।
  9. जब संस्कृति फिर से संगम हो जाती है, तो उपरोक्त प्रक्रियाओं को दोहराएं।
    नोट: LECs उच्च घनत्व वाली संस्कृति स्थितियों में फलते-फूलते हैं। कोशिकाओं को अत्यधिक पतला करने से बचें, क्योंकि इससे उनकी वृद्धि में बाधा आ सकती है।

4. भंडारण और शिपमेंट

नोट: भंडारण के लिए आदर्श सेल नंबर ~ 1 × 106 है।

  1. डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3x अच्छी तरह से धो लें। धोने के बाद, ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 5 मिन के लिए रखें।
  2. पूर्ण संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर स्थानांतरित करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं को 90% एफबीएस और 10% डीएमएसओ से बना एक ठंड माध्यम में फिर से निलंबित करें, जिसका लक्ष्य 1 ×10 6 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व के लिए है। सेल निलंबन को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
  4. तरल नाइट्रोजन में स्थायी भंडारण से पहले, तुरंत कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस वातावरण में ले जाएं, इसके बाद रात भर -80 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: यदि तरल नाइट्रोजन अनुपलब्ध है, तो कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक घंटे के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. यदि शिपमेंट की आवश्यकता होती है, तो रात भर डिलीवरी के लिए सूखी बर्फ वाले पैकेज में क्रायोवियल में कोशिकाओं को शिप करें।
  6. कोशिकाओं की प्राप्ति पर, तेजी से वसूली सुनिश्चित करें और कोशिकाओं को उपसंस्कृति में रखें। यदि तत्काल संस्कृति संभव नहीं है, तो लंबे समय तक भंडारण के लिए कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि कोशिकाओं को भेज दिया जाना है, तो सुनिश्चित करें कि नमूने तापमान में उतार-चढ़ाव से संभावित नुकसान को रोकने के लिए सूखी बर्फ में गहराई से दफन हैं।

5. LECs सत्यापन

  1. कवर चश्मे के साथ 35 मिमी संस्कृति व्यंजनों में प्लेट एलईसी और लगभग 48 घंटे के लिए उन्हें संस्कृति।
  2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ठंडे मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट के लिए निश्चित कोशिकाओं को धोएं और गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर के साथ निश्चित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. अवरुद्ध करने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (αA-क्रिस्टलीन, γ-क्रिस्टलीन, और PROX1 एंटीबॉडी) के साथ रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, व्यक्तिगत रूप से मंदक बफर में 1:50 अनुपात में पतला हो।
  5. पीबीएस के साथ 3 x 5 मिन के लिए कोशिकाओं को धोएं और 1 घंटे के लिए मंदक बफर में 1:100 पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोएं और नाभिक की कल्पना करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम/एमएल होचस्ट 33342 के साथ कोशिकाओं को दाग दें।
  7. अतिरिक्त धुंधला समाधान को हटाने के लिए पीबीएस के साथ 2 x 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को धोएं और αA-, γ-क्रिस्टलीय और PROX1 के लिए नाभिक और FITC चैनल के लिए DAPI चैनल का उपयोग करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करें।

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Representative Results

जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल का पालन करके, C57BL/6J चूहों से प्राथमिक LECs ने 4 घंटे की अवधि के भीतर व्यंजनों का पालन किया। विशेष रूप से, अन्य ऊतकों के दृश्य अवशेष थे जैसे कि पीछे के कैप्सूल और लेंस फाइबर कोशिकाओं के खंड। हालांकि, ये अनपेक्षित तत्व पकवान से जुड़े नहीं थे और इसलिए, संस्कृति माध्यम को बदलकर हटाया जा सकता था। इसके बाद, तीसरे और पांचवें दिन के बीच, एलईसी ने अपने प्रसार चरण की शुरुआत की। तेजी से विकास, लघुगणक प्रसार चरण की विशेषता, तब सातवें और दसवें दिन के बीच देखी जा सकती थी। ऐसे उदाहरणों में जब कोशिकाएं तेजी से विकास के चरण में प्रगति नहीं करती हैं, तो संस्कृति माध्यम में एपिसीजीएस-ए जैसे विकास की खुराक को शामिल करना उचित हो सकता है। इसके अलावा, हमने देखा कि कोशिकाएं 10% एफबीएस की तुलना में 20% एफबीएस युक्त माध्यम में तेजी से विकास दर प्रदर्शित करती हैं। एक कम एफबीएस एकाग्रता आमतौर पर धीमी वृद्धि को बढ़ावा देती है, लेंस के केंद्रीय उपकला के लक्षणों को प्रतिबिंबित करती है, जबकि 20% एफबीएस एकाग्रता लेंस के प्रोलिफेरेटिव ज़ोन की विशेषताओं को दोहराती है।

रेड्डी एट अल और एंडले एट अल के अनुसार, जिन्होंने अमर मानव लेंस उपकला सेल लाइन बी 3 विकसित की, यह उम्मीद की जाती है कि एलईसी को विभिन्न लेंस-विशिष्ट प्रोटीन जैसे αA- और γ-क्रिस्टलीय 2,21व्यक्त करना चाहिए। इसलिए, इस अध्ययन में, हमने एलईसी के रूप में कोशिकाओं की पहचान को मान्य करने के लिए सेलुलर मार्कर के रूप में αA- और γ-क्रिस्टलीय को नियोजित किया। शुरुआती तीन मार्गों के भीतर एलईसी को ग्लास कवरस्लिप पर सुसंस्कृत किया गया था। αA- और γ-क्रिस्टलीय के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करने के लिए किया गया था। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, इन कोशिकाओं ने αA- और γ-क्रिस्टलीय दोनों की मजबूत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जिससे निश्चित सबूत मिले कि वे लेंस-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाएं हैं। इसके अतिरिक्त, हमने प्राथमिक LECs को लेबल करने के लिए फाइबर कोशिकाओं के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर के रूप में PROX1 का उपयोग किया। डेटा ने संकेत दिया कि इन एलईसी ने PROX1 के लिए नकारात्मक धुंधला दिखाया, यह पुष्टि करते हुए कि ये कोशिकाएं उपकला कोशिकाएं हैं और अभी तक फाइबर कोशिकाओं में भेदभाव नहीं हुआ है।

Figure 1
चित्रा 1: एलईसी संस्कृति के लिए चरण-दर-चरण कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा प्राथमिक लेंस उपकला कोशिकाओं की संस्कृति में शामिल अनुक्रमिक चरणों को दर्शाता है। चरण 1 में पूर्वकाल कैप्सूल में एक छोटा आंसू बनाना शामिल है। चरण 2 लेंस कैप्सूल को धीरे से हटाने पर जोर देता है। चरण 3 में, लेंस कैप्सूल को ध्यान से 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन समाधान के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद, सेल पृथक्करण को बढ़ावा देने के लिए विदारक कैंची का उपयोग करके पचाने वाले लेंस कैप्सूल को कीमा बनाया जाता है। चरण 4 में सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में 20% एफबीएस युक्त संस्कृति माध्यम के 0.5 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को शमन करना और 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर ऊतक के नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करना शामिल है। चरण 5 संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करने और उन्हें 24 अच्छी तरह से थाली में बोने की आवश्यकता है. अंत में, चरण 6 प्रयोग के दौरान सेल विकास और रखरखाव का समर्थन करने के लिए हर 2-3 दिनों में संस्कृति मीडिया को बदलना शामिल है। संक्षिप्ताक्षर: LECs = लेंस उपकला कोशिकाएं; FBS = भ्रूण गोजातीय सीरम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: समय के साथ एलईसी का विकास पैटर्न। उनके विकास के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर प्राथमिक लेंस उपकला कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत दर्ज किए गए थे। 1, 2, 3, 5, 7 और 10 दिनों पर कैप्चर की गई छवियां विकसित सेल आकृति विज्ञान को दर्शाती हैं, जो समय के साथ लेंस उपकला कोशिकाओं के विकास और व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं। लाल तीर सक्रिय रूप से लेंस उपकला कोशिकाओं के प्रसार के स्थान का संकेत देता है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: LECs = लेंस उपकला कोशिकाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एलईसी का सत्यापन। (ए) माउस एलईसी में αA-क्रिस्टलीय का इम्यूनोस्टेनिंग। प्राथमिक mLECs Hoechst 33342 (नीला) और αA-क्रिस्टलीय एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग रहे थे. (बी) माउस एलईसी में γ-क्रिस्टलीय का इम्यूनोस्टेनिंग। (सी) माउस एलईसी में PROX1 का इम्यूनोस्टेनिंग। प्राथमिक mLECs Hoechst 33342 (नीला) और PROX1 एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग रहे थे. स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: LECs = लेंस उपकला कोशिकाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक एलईसी के सफल अलगाव, संस्कृति और उपसंस्कृति के लिए एक व्यापक, चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है, जो वीडियो प्रलेखन के साथ पूरा होता है। लिखित निर्देशों के साथ विस्तृत दृश्य मार्गदर्शिका प्रोटोकॉल की स्पष्टता और पहुंच को बढ़ाती है, क्षेत्र में शोधकर्ताओं के बीच इसके उपयोग और प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देती है। अंतिम उद्देश्य मोतियाबिंद गठन और पीसीओ में एलईसी की भूमिका के आसपास के ज्ञान के विस्तार के शरीर में योगदान करना है, जो मोतियाबिंद सर्जरी के बाद एक प्रचलित जटिलता है।

लेंस उपकला सेल लाइनों के साथ प्राथमिक एलईसी की तुलना करते समय, जैसे कि एचएलई-बी 3 और एसआरए 01/04, प्रत्येक एक शोध संदर्भ में अद्वितीय फायदे और चुनौतियां प्रस्तुत करता है। SRA01/04 के साथ HLE-B3 सेल लाइन, सेल लाइनों की एक श्रेणी का प्रतिनिधित्व करती है, जो संभालने में आसान और टिकाऊ होने के बावजूद, अक्सर उनकी निरंतर प्रतिकृति और लंबे समय तक संस्कृति की स्थिति के कारण आनुवंशिक और फेनोटाइपिक परिवर्तन प्रदर्शित करती है। इससे मूल एलईसी के कार्य से महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है, जिससे उनकी प्रतिक्रियाओं की प्रामाणिकता कम हो जाती है। इसके विपरीत, प्राथमिक एलईसी, रोगियों या अनुसंधान जानवरों से जीवित ऊतक से सीधे अलग, प्राकृतिक सेलुलर वातावरण और विवो में लेंस की अंतर्निहित प्रतिक्रियाओं को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करते हैं। उनके निष्कर्षण और संस्कृति की अतिरिक्त जटिलता के बावजूद, उन्हें अक्सर उच्च शारीरिक प्रासंगिकता की मांग करने वाले अध्ययनों में पसंद किया जाता है, क्योंकि वे अधिक सटीक और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय कुछ प्रमुख बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। युवा C57BL/6J चूहों, आमतौर पर 2 सप्ताह से कम उम्र के, इन अध्ययनों में उपयोग किए गए थे। हमने देखा कि इन युवा चूहों से काटे गए एलईसी ने 2 महीने या उससे अधिक उम्र के चूहों से एलईसी की तुलना में अधिक जोरदार वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह चूहों की उम्र और कोशिका वृद्धि के बीच एक नकारात्मक सहसंबंध को इंगित करता है।

माउस आंख से लेंस का विच्छेदन एक नाजुक काम है, लेंस और उसके कैप्सूल की अखंडता को बनाए रखने के लिए विदारक उपकरणों के सावधानीपूर्वक उपयोग की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल खंड 1 में उल्लिखित प्रक्रिया यह सुनिश्चित करती है कि लेंस को न्यूनतम क्षति के साथ सफलतापूर्वक निकाला जाए। लेंस कैप्सूल के स्वास्थ्य और अखंडता को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है, इसके महत्व को कम करके नहीं आंका जा सकता है क्योंकि कोई भी क्षति संभावित रूप से एलईसी की गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित कर सकती है। यह उल्लेखनीय है कि अधिकांश कोशिका विभाजन आमतौर पर लेंस में भूमध्यरेखीय क्षेत्र के पास अंकुरण क्षेत्र में होते हैं, एक ऐसा क्षेत्र जो संवर्धन के लिए आसानी से सुलभ नहीं होता है। ज़ेटरबर्ग एट अल के अनुसार, हालांकि लेंस उपकला का मध्य भाग सामान्य परिस्थितियों में न्यूनतम माइटोटिक गतिविधि दिखाता है, ट्राइटिएटेड थाइमिडीन (3एच-टीडीआर) लेबलिंग का उपयोग करने वाले प्रयोगों ने इन केंद्रीय रूप से तैनात लेंस उपकला कोशिकाओं को संभावित स्टेम सेल 17,22के रूप में चिह्नित किया है। स्टेम सेल अलग-अलग विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, जैसे कि मानक परिस्थितियों में कम प्रसार दर होने के बावजूद असीम प्रसार क्षमता। जैसे, लेंस उपकला का मध्य भाग अंकुरित क्षेत्र की तुलना में एलईसी की प्रसार क्षमता का बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकता है।

एलईसी का अलगाव, जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 2 में विस्तृत है, इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। लेंस कैप्सूल को हटाने, एंजाइमेटिक पाचन और ऊतक विखंडन सहित अभिन्न क्रियाएं कैप्सूल से व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए सावधानीपूर्वक की जाती हैं। इस प्रक्रिया के भीतर महत्वपूर्ण तत्वों में से एक ट्रिप्सिन पाचन की अवधि है। यह अनुशंसा की जाती है कि पाचन अवधि 8 और 10 मिनट के बीच निर्धारित की जाए। यदि इस अवधि को 5 मिनट से कम समय तक छोटा किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप अपूर्ण सेल पृथक्करण हो सकता है। इसके विपरीत, इस समय सीमा का ओवरएक्सटेंशन सेल व्यवहार्यता से काफी समझौता कर सकता है। सेल पृथक्करण अभिकर्मक के रूप में ट्रिप्सिन-ईडीटीए को नियोजित करने की रणनीतिक पसंद, डीएमईएम संस्कृति माध्यम के साथ संयोजन के रूप में 20% एफबीएस और 10 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन के साथ पूरक, संभावित संदूषण जोखिमों को कम करते हुए सेल रिलीज और बाद में प्रसार का अनुकूलन करता है।

प्राथमिक एलईसी संस्कृतियों के दौरान जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक्स का अक्सर उपयोग किया जाता है। हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं का चुनाव सावधानी से किया जाना चाहिए। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक्स जैसे पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, साथ ही एंटिफंगल एजेंट, एलईसी की व्यवहार्यता को प्रभावित करने की क्षमता रखते हैं। एक विकल्प के रूप में, इष्टतम एलईसी विकास के लिए 10 μg/mL की एकाग्रता पर एक जेंटामाइसिन समाधान को नियोजित करने की सिफारिश की जाती है।

इसके अलावा, एक उच्च सेल घनत्व को बनाए रखना सफल प्राथमिक एलईसी संस्कृति के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। स्थापित सेल लाइनों के विपरीत, प्राथमिक एलईसी को इष्टतम विकास के लिए उच्च सेल घनत्व की आवश्यकता होती है। यह मुख्य रूप से प्रभावी अंतरकोशिकीय संचार पर उनकी निर्भरता के कारण है, जो सीधे संपर्क या पैराक्राइन सिग्नलिंग द्वारा सुगम है, जो उनकी भेदभाव स्थिति और कार्य को बनाए रखने में मदद करता है। उच्च सेल घनत्व भी "संस्कृति सदमे," प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा अनुभव की जाने वाली एक शर्त जब अलग और एक इन विट्रो वातावरण में काफी विवो मूल23 में उनके से अलग में रखा के प्रतिकूल प्रभाव को कम करता है. विवो जैसे वातावरण में अधिक नकल करके, एक उच्च कोशिका घनत्व जीवित रहने की दर को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, यह घनत्व विकास कारकों और साइटोकिन्स की एकाग्रता ढाल स्थापित करने में मदद करता है जो कोशिका वृद्धि और कार्य का समर्थन करता है। यह देखते हुए कि कई प्राथमिक कोशिकाएं लंगर-निर्भर हैं, प्रसार के लिए सतह लगाव की आवश्यकता होती है, एक उच्च कोशिका घनत्व आसंजन के लिए पर्याप्त संख्या में पड़ोसी कोशिकाएं प्रदान करता है, इस प्रकार स्वस्थ विकास को बढ़ावा देता है। नतीजतन, सेल संचार, अस्तित्व और प्रसार पर इसके महत्वपूर्ण प्रभाव के कारण प्राथमिक कोशिकाओं की खेती में सेल घनत्व का विनियमन एक महत्वपूर्ण विचार है। एलईसी के लिए एक आदर्श वातावरण बनाने के लिए 24-अच्छी या 6-अच्छी तरह से प्लेटों जैसे छोटे संस्कृति व्यंजनों का चयन करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल के बाद आम तौर पर LECs एक संगम राज्य ~ 10-14 दिनों के बाद खेती तक पहुँचने में परिणाम. हम प्रयोगों में सबसे प्राकृतिक व्यवहार सुनिश्चित करने के लिए, आदर्श रूप से P0 और P6 के बीच, कम संख्या में LECs का उपयोग करने की सलाह देते हैं। 7-10 मार्ग से परे, एलईसी कम विकास का प्रदर्शन कर सकते हैं और निचले मार्ग में कोशिकाओं के समान प्रयोगात्मक स्थितियों पर प्रतिक्रिया नहीं कर सकते हैं।

सीरम एकाग्रता सीधे कोशिका वृद्धि की दर से संबंधित है। एफबीएस के निचले स्तर धीमी वृद्धि को प्रेरित करने की अधिक संभावना है, जो केंद्रीय उपकला की विशेषताओं से मिलता-जुलता है। इसके विपरीत, उच्च एफबीएस स्तर प्रोलिफ़ेरेटिव ज़ोन की स्थितियों की नकल करते हैं। यदि सेल विकास धीमा है, जैसा कि तब हो सकता है जब एलईसी को पुराने या आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों से अलग करने की आवश्यकता होती है, तो एफबीएस को 20% तक बढ़ाना या ईपीआईसीजीएस-ए (5 एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) जैसे विकास पूरक को जोड़ना फायदेमंद हो सकता है। यह सीरम और पूरक संवर्धन सेल प्रसार को बढ़ा सकता है और उपकला कोशिकाओं के इष्टतम विकास को बढ़ावा दे सकता है।

भंडारण और शिपमेंट प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल अनुभाग 5) जीवित कोशिकाओं के संरक्षण और परिवहन से जुड़ी चुनौतियों पर विचार करता है। भंडारण और परिवहन के दौरान एलईसी के अस्तित्व के लिए ठंड माध्यम का चुनाव महत्वपूर्ण है। हमने विभिन्न ठंड माध्यमों के साथ प्रयोग किया है, जिसमें 70% पूर्ण संस्कृति माध्यम + 20% एफबीएस + 10% डीएमएसओ शामिल हैं; 90% एफबीएस + 10% डीएमएसओ; और डीएमएसओ- और सीरम मुक्त ठंड माध्यम। हमारे प्रयोगों के साक्ष्य से पता चलता है कि 10% डीएमएसओ और 90% एफबीएस वाला समाधान सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने में बेहतर प्रदर्शन प्रदर्शित करता है। इस विशिष्ट सूत्रीकरण का उपयोग करते हुए, हमने 10 वर्षों से अधिक की अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में प्राथमिक एलईसी को सफलतापूर्वक बनाए रखा है, इस दृष्टिकोण की मजबूती और सेल पुनरुद्धार पोस्ट स्टोरेज की सुविधा के लिए इसकी क्षमता का प्रदर्शन किया है।

αA-क्रिस्टलीय और γ-क्रिस्टलीय LECs के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया. PROX1 लेंस फाइबर कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एलईसी फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए PAX6, FOXE3, और E-cadherin जैसे अतिरिक्त मार्करों को भी नियोजित किया जा सकता है। यदि शोधकर्ता ईएमटी की खोज में रुचि रखते हैं, तो αSMA को मार्कर के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए। प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं और उपयोग किए गए संबंधित एंटीबॉडी के लिए प्रदान की गई सिफारिशों के अनुसार इनक्यूबेशन समय और कमजोर पड़ने को समायोजित करना आवश्यक है।

हालांकि यह अध्ययन प्राथमिक एलईसी की खेती के लिए एक मजबूत पद्धति प्रस्तुत करता है, लेकिन इसकी सीमाओं को स्वीकार करना महत्वपूर्ण है। जबकि शुरू में पृथक कोशिकाएं प्राथमिक एलईसी हैं, किसी भी उपसंस्कृति, ट्रिप्सिनाइजेशन और पुनर्मिलन प्रक्रियाओं से उनकी स्थिति में बदलाव होगा। हमारे द्वारा डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल मुख्य रूप से माउस लेंस को एलईसी के स्रोत के रूप में नियोजित करता है; हालांकि, एलईसी को मोतियाबिंद रोगी के नमूने, आंख बैंक आंखों, या ग्लूकोमा और मधुमेह रेटिनोपैथी 17,24सहित विभिन्न नेत्र रोगों वाले रोगियों सहित अन्य संसाधनों से भी सुसंस्कृत किया जा सकता है। पुराने व्यक्तियों या विशिष्ट नेत्र स्थितियों वाले लोगों से काटे गए एलईसी प्रोटोकॉल के साथ-साथ छोटे, स्वस्थ समकक्षों से कोशिकाओं के रूप में प्रभावी ढंग से पालन नहीं कर सकते हैं। पुराने या आनुवंशिक रूप से संशोधित व्यक्तियों या जानवरों से एलईसी की खेती करने के लिए संस्कृति माध्यम को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, संभवतः एफबीएस को 20% तक बढ़ाकर या अतिरिक्त विकास कारकों को शामिल करके। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक भ्रूण चूजे लेंस उपकला सेल संस्कृतियों पर आयोजित Menko एट अल द्वारा पिछले अध्ययन, संस्कृति25 के दूसरे दिन के बाद होने वाली सहज भेदभाव का प्रदर्शन किया. इसलिए, शोधकर्ताओं को सावधानी बरतनी चाहिए और कार्यप्रणाली में अंतर पर विचार करना चाहिए, खासकर अगर भेदभाव का अध्ययन करना उनका मुख्य शोध लक्ष्य है।

प्राथमिक एलईसी को संस्कृति के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इबाराकी एट अल, Sundelin एट अल, और Andjelic एट अल द्वारा विकसित तरीकों मोतियाबिंद सर्जरी 16,17,19,20के दौरान एकत्र लेंस कैप्सूल के पूर्वकाल भाग का उपयोग पेट्री डिश पर सीधे प्राथमिक LECs संवर्धन शामिल है. यह दृष्टिकोण प्राकृतिक सेल-टू-सेल संपर्कों और बाह्य मैट्रिक्स को बनाए रखता है, जो पीसीओ जैसी स्थितियों के लिए महत्वपूर्ण उच्च शारीरिक प्रासंगिकता प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, लेंस एक्सप्लांट विधि, जैसे कि ज़ेलेंका एट अल द्वारा उल्लिखित देशी ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करता है, जो अध्ययन के लिए अनुमति देता है जो अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, विशेष रूप से एलईसी, सेलुलर इंटरैक्शन और लेंस विकास प्रक्रियाओं के टर्मिनल भेदभाव की खोज के लिए फायदेमंद है, भेदभाव26 के दौरान अनुक्रमिक सेलुलर और आणविक घटनाओं की विस्तृत समझ प्रदान करता है।

इसके विपरीत, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ट्रिप्सिनाइजेशन विधि एक समान एकल-सेल निलंबन का उत्पादन करती है, जो सेल व्यवहार्यता और प्रसार परख, ड्रग स्क्रीनिंग और सेल सिग्नलिंग मार्ग विश्लेषण जैसे कुछ प्रयोगों के लिए फायदेमंद है, वर्दी सीडिंग और सटीक सेल गिनती को सरल बनाती है। हालांकि, यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि जबकि यह विधि अपनी समान कोशिका आबादी के कारण नियंत्रित और सटीक अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है, यह सेलुलर व्यवहार को बदल सकती है और एंजाइमी प्रसंस्करण के कारण एक्सप्लांट और प्रत्यक्ष-संस्कृति विधियों में देखी गई शारीरिक प्रासंगिकता से समझौता कर सकती है। शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, यह विधि अत्यधिक लागू और सुविधाजनक साबित होती है, इन कोशिकाओं की विशेषताओं और व्यवहारों में भरोसेमंद अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हालांकि, उन लोगों के लिए जिनकी वैज्ञानिक पूछताछ सेलुलर भेदभाव तक फैली हुई है, इन पहलुओं को शामिल करने के लिए वैकल्पिक तरीकों जैसे कि एक्सप्लांट तकनीकों पर विचार करना या वर्तमान को अनुकूलित और अनुकूलित करना आवश्यक हो जाता है।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को एलईसी की विशिष्ट आवश्यकताओं और आवश्यकताओं पर सावधानीपूर्वक विचार करने के साथ डिज़ाइन किया गया है। सत्यापन के लिए विच्छेदन से हर कदम, सोच-समझकर कोशिकाओं की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए तैयार की जाती है. नतीजतन, यह एलईसी का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं और ओकुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी में उनकी भूमिका के लिए एक मूल्यवान मार्गदर्शिका हो सकती है। भविष्य के अध्ययन एलईसी जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित और संशोधित कर सकते हैं, लेंस से संबंधित बीमारियों की समझ में और प्रगति के लिए एक मंच प्रदान करते हैं और मोतियाबिंद और पीसीओ रोकथाम के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों का विकास करते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनईआई R21EY033941 (होंगली वू को) द्वारा समर्थित किया गया था; रक्षा विभाग W81XWH2010896 (होंगली वू को); R15GM123463-02 (कायला ग्रीन और होंगली वू को)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher #25300054 For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody  Jackson ImmunoResearch #715-545-150 For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-605-003 For cell validation
Antibody dilution buffer Licor #927-60001 For cell validation
Beaver safety knife Beaver-Visitec International #3782235 For lens dissection
Blocking buffer Licor #927-60001 For cell validation
Capsulorhexis forceps Titan Medical Instruments TMF-124 For lens capsule isolation
DMEM Sigma Aldrich D6429 For LECs culture medium
DMSO Sigma Aldrich #D2650 For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher #J67802 For lens dissection
Dumont tweezers Roboz Surgical Instrument RS-4976 For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional) ScienCell 4182 For LECs culture medium
FBS Sigma Aldrich F2442 For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL) Sigma-Aldrich G1397 For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution Thermo Fisher #62249 For cell validation
Micro-dissecting scissors Roboz Surgical Instrument  RS-5983 For lens dissection
Micro-dissecting tweezers Roboz Surgical Instrument  RS5137  For lens dissection
PROX1 antibody Thermo Fisher 11067-2-AP For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors Roboz Surgical Instrument RS-5608 For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody Santa Cruz sc-28306 For cell validation 
γ-crystallin antibody Santa Cruz sc-365256 For cell validation

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Yu, Y., Zhang, J., Wu, H. Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization. J. Vis. Exp. (208), e65912, doi:10.3791/65912 (2024).

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