Summary
Bu makale, katarakt ve arka kapsül opaklaşmasında (PCO) tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi ve araştırmalara yardımcı olmayı amaçlayan primer lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) kültürlenmesi için ayrıntılı bir video protokolünü özetlemektedir. Lens diseksiyonu, LEC izolasyonu ve validasyonu hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle bu alanda yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.
Abstract
Lens epitel hücreleri (LEC'ler), lensin homeostazını ve normal fonksiyonunu korumada birçok önemli rol oynar. LEC'ler lens büyümesini, gelişimini, boyutunu ve şeffaflığını belirler. Tersine, işlevsiz LEC'ler katarakt oluşumuna ve arka kapsül opaklaşmasına (PCO) yol açabilir. Sonuç olarak, sağlam bir birincil LEC kültür sistemi oluşturmak, lens geliştirme, biyokimya, katarakt terapötikleri ve PCO önleme ile uğraşan araştırmacılar için önemlidir. Bununla birlikte, birincil LEC'lerin yetiştirilmesi, sınırlı kullanılabilirlikleri, yavaş çoğalma oranları ve hassas yapıları nedeniyle uzun süredir zorluklar ortaya çıkarmaktadır.
Bu çalışma, birincil LEC kültürü için kapsamlı bir protokol sunarak bu engelleri ele almaktadır. Protokol, optimize edilmiş bir kültür ortamının formülasyonu, lens kapsüllerinin hassas izolasyonu, tripsinizasyon teknikleri, alt kültür prosedürleri, hasat protokolleri ve depolama ve sevkiyat kılavuzları gibi temel adımları kapsar. Kültür işlemi boyunca, hücre morfolojisi faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi.
Kültürlenmiş LEC'lerin gerçekliğini doğrulamak için, kritik lens proteinlerinin, yani αA- ve γ-kristalinlerin varlığını ve hücre altı dağılımını tespit etmek için immünofloresan testleri yapılmıştır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıları birincil LEC'leri geliştirmek ve karakterize etmek için değerli bir kaynakla donatarak, lens biyolojisini anlamamızda ve lensle ilgili bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesinde ilerlemeler sağlar.
Introduction
Göz merceği, gelen ışığı retinaya odaklayarak görmede çok önemli bir rol oynar. Lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) anahtar oyuncular olduğu özel hücrelerden oluşan şeffaf, avasküler bir yapıdan oluşur. LEC'ler lensin ön yüzeyinde bulunur ve şeffaflığını korumaktan, su dengesini düzenlemekten ve lens büyümesine ve gelişimine katılmaktansorumludur 1,2. LEC'ler, lensin ön kısmında bulunan benzersiz bir hücre türüdür ve yaşam boyunca sürekli olarak lens lifleri üreterek lens netliğini ve işlevini korumada kritik bir rol oynar.
Katarakt, merceğin ilerleyici bulanıklaşması ile karakterizedir, bu da ışığın bozulmasına ve saçılmasına neden olarak görme bozukluğuna yol açar 3,4. Katarakt oluşumunun altında yatan kesin mekanizmalar, UV radyasyonu, oksidatif hasar ve glikasyon gibi çeşitli hücresel ve moleküler süreçleri içeren karmaşık ve çok faktörlüdür 5,6. LEC'lerin katarakt gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğu bulunmuştur ve bu da onları araştırmaların hayati bir odak noktası haline getirmiştir 1,2,7,8,9.
Ayrıca, günümüzde oftalmolojideki en acil konulardan biri, sekonder katarakt olarak da bilinen posterior kapsül opaklaşmasının (PCO) nispeten yüksek insidansıdır. PKO, katarakt ameliyatından sonra en sık görülen komplikasyon olmaya devam etmekte olup, ameliyattan sonraki 5 yıl içinde yetişkin hastaların %20-40'ını ve çocukların %100'ünü etkilemektedir10. PCO'ya öncelikle katarakt ekstraksiyonunu takiben kapsül torbasında kalan rezidüel LEC'ler neden olur. Bu hücreler, sadece epitelden mezenkimal geçişe (EMT) değil, aynı zamanda LEC'lerin lens liflerine farklılaşmasını da içeren çok yönlü bir patofizyolojik dönüşüme uğrar, bu da LEC'lerin, liflerin ve miyofibroblastların bir karışımı olan bir hücre popülasyonu ile sonuçlanır 11,12,13. Dönüştürülen hücreler çoğalır ve arka lens kapsülü boyunca göç ederek görme bozukluğuna yol açar. Kültür modellerinde LEC'lerin davranış ve kontrol mekanizmalarını anlamak, PKO'nun önlenmesi ve yönetimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, LEC'lerin kültürlenmesine yönelik bu protokol, bu yaygın postoperatif komplikasyonu incelemeyi, anlamayı ve nihayetinde bunlarla mücadele etmeyi amaçlayan oftalmik araştırmacılar için hayati bir araç sunmaktadır.
LEC biyolojisinin inceliklerini ve katarakt oluşumu ve PCO'daki rolünü çözmek için sağlam ve tekrarlanabilir in vitro primer hücre kültürü sistemleri kurmak esastır. Birincil LEC kültürü, araştırmacılara LEC'lerin işlevlerini, sinyalizasyonunu ve moleküler özelliklerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar. Ayrıca, hücresel süreçlerin ve farklı deneysel koşulların etkilerinin araştırılmasına olanak tanıyarak lens fizyolojisi ve patolojisi hakkında değerli bilgiler sağlar.
Önceki araştırmalar, LEC kültür teknikleri 14,15,16,17,18,19,20 hakkındaki anlayışımızı zenginleştirdi. Bu çalışmalar çeşitli metodolojiler kullanmış ve LEC davranışı ve özellikleri hakkında önemli bulgular vermiş olsa da, mevcut literatürde LEC'leri kültürlemek için kapsamlı ve erişilebilir bir video kayıt protokolü yoktur. Bu sınırlama, acemi araştırmacıların teknikleri doğru bir şekilde yeniden üretme yeteneğini engelleyebilir ve deneysel sonuçlarda tutarsızlıklara ve farklılıklara yol açabilir. Bu araştırma makalesi, bir video kayıt protokolü sağlayarak bu boşluğu doldurmayı ve LEC kültürü alanında tekrarlanabilirliği artırabilecek ve bilgi aktarımını kolaylaştırabilecek standartlaştırılmış bir kaynak sağlamayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi. Prosedür onayı, Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından verilmiştir (protokol numarası: IACUC-2022-0008). Bu çalışmalarda tipik olarak 2 haftalıktan küçük genç C57BL / 6J fareleri kullanılmıştır.
1. Kültür ortamı hazırlama ve lens diseksiyonu
- 450 mL DMEM'e 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 0.1 mL 50 mg / mL gentamisin ekleyerek kültür ortamı hazırlayın.
- 2 haftadan küçük C57BL / 6J farelerine insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
NOT: CO2 inhalasyon yöntemini kullanarak ötenazi yaptık. CO2 ötanazi sistemleri için optimal bir akış hızı, oda veya kafes hacminin/dakikasının %30 ila %70'ini değiştirmelidir. - Cerrahi makas kullanarak göz kapaklarını nazikçe çıkarın ve göz yuvasının zıt taraflarına kavisli cımbızla hassas bir baskı uygulayarak gözün dışa doğru çıkmasına neden olun. Katarakt bıçağını kullanarak kornea üzerinde dikkatli bir kesi yapın ve kavisli cımbız kullanarak lensi dikkatlice çıkarın, lense veya kapsülüne zarar vermemesini sağlayın.
NOT: Lens kapsülünün bütünlüğünü korumak için bu adımları gerçekleştirirken dikkatli olun. Lensin hassas yapısı nedeniyle, lens hasarı riskini en aza indirmek için kavisli ve künt uçlu diseksiyon aletlerinin kullanılması önemlidir. - Lensleri, 10 μg/mL gentamisin içeren 5 mL önceden ısıtılmış ve steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) solüsyonu ile doldurulmuş 60 mm'lik plastik doku kültürü kabına aktarmak için künt uçlu kavisli cımbız kullanın.
- Potansiyel kalıntıları veya kirleticileri gidermek, lensleri daha sonraki işlemlere hazırlamak ve steril bir kültür ortamı sağlamak için lensleri 10 μg/mL gentamisin içeren DPBS solüsyonu ile nazikçe durulayın.
- Yeterli sayıda LEC elde etmek için, 24 oyuklu bir kültür plakası için dört lensi ve 6 oyuklu bir kültür plakası için altı lensi bir araya getirin.
2. LEC'lerin izolasyonu
- Durulama işlemini tamamladıktan sonra, lensi kurumasını bekleyin ve bir parça filtre kağıdına yerleştirin.
- Lens yeterince kuruduktan sonra, lens kapsülünün çıkarılmasına hazırlanırken dikkatlice bir Petri kabının kapağına aktarın.
- Ön segmentin yukarı baktığından emin olarak lensi yukarı doğru döndürün. Ön kapsülü tutmak için cımbız kullanırken, kapsülde küçük bir yırtık oluşturmak için baskın eldeki kapsülorheksis forsepslerini kullanın. Kapsülü çıkarmak için iki aleti yavaşça zıt yönlerde çekin ve tüm lens diseksiyonları tamamlanana kadar DPBS'ye koyun.
NOT: Herhangi bir tutarsızlığı önlemek için, araştırmacılar her bir lens epitel kapsülünü derhal incelemeli ve bunları geçici olarak DPBS'de saklamalıdır. Sadece tüm diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, kapsüller toplu olarak 37 ° C'de tutulan tripsine aktarılır ve senkronize ve homojen maruziyet sağlanır. - Lens kapsülünü dikkatlice 6 oyuklu bir plakaya aktarın. Enzimatik sindirim sürecini başlatmak için her oyuğa 1 mL %0.05 tripsin çözeltisi ekleyin.
- Eşit geçirgenlik sağlamak için tripsin çözeltisini hafifçe çalkalayın. Plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve kapsülün 37 ° C'de 8-10 dakika sindirilmesine izin verin.
NOT: Bu adım, lens kapsülü dokusunun parçalanmasını ve ardından tek tek epitel hücrelerinin salınmasını kolaylaştırır. - İnkübasyondan sonra, kalan doku kümelerini parçalamak ve hücre ayrılmasını desteklemek için diseksiyon makası kullanarak sindirilmiş lens kapsülünü dikkatlice kıyın.
NOT: Sindirilmiş lens kapsüllerinden verimli hücre salınımını sağlamak için doku kıymada titizlik vurgulanır. - Tripsini söndürmek için% 10 FBS içeren 0.5 mL kültür ortamı ekleyin. Doku örneklerini bir santrifüj tüpüne aktarın ve 1.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreleri yeniden süspanse etmek ve hücreleri 24 oyuklu bir plakaya tohumlamak için 1 mL kültür ortamı kullanın.
- Kültür ortamını 2-3 günde bir değiştirin.
3. LEC'lerin alt kültürü
- Hücreler birleştiğinde, ortamı kültür kabından çıkarın. Hücreleri 2x 1 mL DPBS ile yıkamaya devam edin.
- 200 μL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika inkübatöre yerleştirin.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri inkübatörden çıkarın ve kültür kabından ayrıldıklarını ve yüzmeye başladıklarını doğrulamak için mikroskop altında inceleyin.
- 1 mL kültür ortamı ekleyin ve tüm hücreleri ayırmak için hücreleri 3-5x hafifçe pipetleyin.
- Hücreleri santrifüj tüplerine aktarın ve 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.
- Gerekirse, bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
- Alt kültürleme amacıyla hücre süspansiyonunu 1:2 veya 1:3 oranında alt bölümlere ayırın.
- Kültür tekrar birleştiğinde, yukarıda belirtilen prosedürleri tekrarlayın.
NOT: LEC'ler yüksek yoğunluklu kültür koşullarında gelişir. Hücreleri aşırı seyreltmekten kaçının, çünkü bu onların büyümesini engelleyebilir.
4. Depolama ve sevkiyat
NOT: Depolama için ideal hücre sayısı ~1 × 106'dır.
- Hücreleri 3x 1 mL DPBS ile iyice yıkayın. Yıkadıktan sonra 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika inkübatöre koyun.
- 2 mL tam kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri% 90 FBS ve% 10 DMSO'dan oluşan bir dondurucu ortamda yeniden süspanse edin, 1 × 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu hedefleyin. Hücre süspansiyonunu kriyoviyal'e aktarın.
- Sıvı nitrojen içinde kalıcı olarak saklamadan önce hücreleri hemen 1 saat boyunca -20 °C'lik bir ortama, ardından gece boyunca -80 °C'ye taşıyın.
NOT: Sıvı nitrojen mevcut değilse, hücreler -20 °C'de bir başlangıç saatinden sonra -80 °C'de saklanabilir. - Bir sevkiyat gerekiyorsa, kriyoviyaldeki hücreleri bir gecede teslimat için kuru buzlu bir pakette gönderin.
- Hücrelerin alınmasından sonra, hızlı bir şekilde iyileşmeyi sağlayın ve hücreleri alt kültüre yerleştirin. Acil kültür mümkün değilse, uzun süreli depolama için hücreleri sıvı nitrojene aktarın.
NOT: Hücreler sevk edilecekse, sıcaklık dalgalanmalarından kaynaklanan olası hasarı önlemek için numunelerin kuru buza derinlemesine gömüldüğünden emin olun.
5. LEC'lerin doğrulanması
- LEC'leri 35 mm'lik kültür kaplarına kapak camları ile yerleştirin ve yaklaşık 48 saat kültürleyin.
- Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın ve hücreleri -20 ° C'de 10 dakika boyunca soğuk metanol ile sabitleyin.
- Sabit hücreleri PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için sabit hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tamponla inkübe edin.
- Bloklamadan sonra, hücreleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve birincil antikorlar (αA-kristalin, γ-kristalin ve PROX1 antikorları) seyreltici tamponunda 1:50 oranında ayrı ayrı seyreltilir.
- Hücreleri PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın ve hücreleri seyreltici tamponda 1:100 oranında seyreltilmiş ikincil antikor ile 1 saat inkübe edin.
- Hücreleri PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın ve çekirdekleri görselleştirmek için hücreleri PBS'de 5 μg/mL Hoechst 33342 ile oda sıcaklığında 10 dakika boyayın.
- Fazla boyama solüsyonunu çıkarmak için hücreleri PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın ve çekirdekler için DAPI kanalını ve αA-, γ-kristalinler ve PROX1 için FITC kanalını kullanarak bir floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin floresan görüntülerini yakalayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu protokolü izleyerek, C57BL / 6J farelerinden elde edilen birincil LEC'ler 4 saatlik bir süre içinde bulaşıklara yapıştı. Özellikle, arka kapsül kesitleri ve lens lifi hücreleri gibi diğer dokuların görünür kalıntıları vardı. Bununla birlikte, bu istenmeyen unsurlar yemeğe yapışmamıştır ve bu nedenle kültür ortamı değiştirilerek çıkarılabilir. Daha sonra, üçüncü ve beşinci günler arasında, LEC'ler çoğalma aşamalarını başlattı. Logaritmik proliferasyon fazının karakteristiği olan hızlı büyüme, yedinci ve onuncu günler arasında gözlemlenebilir. Hücrelerin hızlı büyüme fazına ilerlemediği durumlarda, EpiCGS-a gibi büyüme takviyelerinin kültür ortamına dahil edilmesi tavsiye edilebilir. Ayrıca, hücrelerin %20 FBS içeren besiyerinde %10 FBS'ye kıyasla daha hızlı bir büyüme oranı sergilediğini gözlemledik. Daha düşük bir FBS konsantrasyonu tipik olarak lensin merkezi epitelinin özelliklerini yansıtarak daha yavaş büyümeyi teşvik ederken, %20'lik bir FBS konsantrasyonu lensin proliferatif bölgesinin özelliklerini kopyalar.
Ölümsüzleştirilmiş insan merceği epitel hücre hattı B3'ü geliştiren Reddy ve ark. ve Andley ve ark.'ya göre, LEC'lerin αA- ve γ-kristalinler gibi çeşitli lense özgü proteinleri eksprese etmesi beklenmektedir 2,21. Bu nedenle, bu çalışmada, hücrelerin LEC'ler olarak kimliğini doğrulamak için hücresel belirteçler olarak αA ve γ-kristalinleri kullandık. İlk üç pasajdaki LEC'ler cam lameller üzerinde kültürlendi. αA- ve γ-kristalinlere özgü birincil antikorlar, hücreleri gece boyunca inkübe etmek için kullanıldı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bu hücreler hem αA hem de γ-kristalinlerin güçlü ekspresyonunu sergilediler ve lensten türetilmiş epitel hücreleri olduklarına dair kesin kanıt sağladılar. Ek olarak, birincil LEC'leri etiketlemek için fiber hücreler için köklü bir işaretleyici olarak PROX1'i kullandık. Veriler, bu LEC'lerin PROX1 için negatif boyama gösterdiğini ve bu hücrelerin epitel hücreleri olduğunu ve henüz lif hücrelerine farklılaşmadığını doğruladı.
Şekil 1: LEC kültürü için adım adım iş akışı. Şekil, primer lens epitel hücrelerinin kültüründe yer alan sıralı adımları göstermektedir. Adım 1, ön kapsülde küçük bir yırtık oluşturmayı içerir. Adım 2, lens kapsülünün nazikçe çıkarılmasını gerektirir. Adım 3'te, lens kapsülü dikkatlice 24 oyuklu bir plakaya aktarılır ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.05 tripsin çözeltisi ile inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, sindirilmiş lens kapsülü, hücre ayrılmasını desteklemek için diseksiyon makası kullanılarak kıyılır. Adım 4, santrifüj tüpüne% 20 FBS içeren 0.5 mL kültür ortamı ekleyerek ve doku örneklerini 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyerek tripsinin söndürülmesini içerir. Adım 5, hücrelerin 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edilmesini ve 24 oyuklu bir plakaya tohumlanmasını gerektirir. Son olarak, Adım 6, deney boyunca hücre büyümesini ve bakımını desteklemek için kültür ortamının her 2-3 günde bir değiştirilmesini içerir. Kısaltmalar: LEC'ler = lens epitel hücreleri; FBS = fetal sığır serumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LEC'lerin zaman içindeki büyüme modeli. Primer lens epitel hücrelerinin büyümeleri sırasında çeşitli zaman noktalarındaki morfolojik değişimleri faz kontrast mikroskobu altında kaydedildi. 1., 2., 3., 5., 7. ve 10. günlerde çekilen görüntüler, gelişen hücre morfolojisini tasvir ederek lens epitel hücrelerinin zaman içindeki gelişimi ve davranışı hakkında fikir verir. Aktif olarak çoğalan lens epitel hücrelerinin yerini gösteren kırmızı ok. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: LEC'ler = lens epitel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LEC'lerin doğrulanması. (A) Fare LEC'lerinde αA-kristalinin immün boyama. Primer mLEC'ler Hoechst 33342 (mavi) ve αA-kristalin antikoru (yeşil) ile boyandı. (B) Fare LEC'lerinde γ-kristalinin immün boyaması. (C) Fare LEC'lerinde PROX1'in immün boyaması. Primer mLEC'ler Hoechst 33342 (mavi) ve PROX1 antikoru (yeşil) ile boyandı. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: LEC'ler = lens epitel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu belgede sunulan protokol, birincil LEC'lerin başarılı izolasyonu, kültürü ve alt kültürü için kapsamlı, adım adım bir kılavuz ve beraberindeki video belgeleriyle birlikte sunulmaktadır. Yazılı talimatların yanı sıra ayrıntılı görsel kılavuz, protokolün netliğini ve erişilebilirliğini artırarak alandaki araştırmacılar arasında kullanımını ve tekrarlanabilirliğini teşvik eder. Nihai amaç, katarakt cerrahisini takiben yaygın bir komplikasyon olan katarakt oluşumu ve PCO'da LEC'lerin rolünü çevreleyen genişleyen bilgi birikimine katkıda bulunmaktır.
Primer LEC'leri HLE-B3 ve SRA01/04 gibi lens epitel hücre dizileri ile karşılaştırırken, her biri araştırma bağlamında benzersiz avantajlar ve zorluklar sunar. HLE-B3 hücre hattı, SRA01/04 ile birlikte, kullanımı kolay ve dayanıklı olmakla birlikte, sürekli replikasyonları ve uzun süreli kültür koşulları nedeniyle genellikle genetik ve fenotipik değişiklikler sergileyen bir hücre hattı kategorisini temsil eder. Bu, orijinal LEC'lerin işlevinden önemli farklılıklara yol açabilir ve böylece yanıtlarının gerçekliğini azaltabilir. Tersine, hastalardan veya araştırma hayvanlarından alınan canlı dokudan doğrudan izole edilen birincil LEC'ler, doğal hücresel ortamı ve lensin doğal tepkilerini in vivo olarak daha doğru bir şekilde yansıtır. Ekstraksiyon ve kültürlerinin ek karmaşıklığına rağmen, daha doğru ve güvenilir sonuçlar verdikleri için yüksek fizyolojik alaka gerektiren çalışmalarda sıklıkla tercih edilirler.
Bu protokolü takip ederken bazı önemli noktalar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu çalışmalarda tipik olarak 2 haftalıktan küçük genç C57BL / 6J fareleri kullanılmıştır. Bu genç farelerden toplanan LEC'lerin, 2 aylık veya daha büyük farelerden alınan LEC'lere kıyasla daha güçlü bir büyüme gösterdiğini gözlemledik. Bu, farelerin yaşı ile hücre büyümesi arasında negatif bir korelasyon olduğunu gösterir.
Lensin fare gözünden diseksiyonu, lensin ve kapsülünün bütünlüğünü korumak için diseksiyon aletlerinin dikkatli bir şekilde kullanılmasını gerektiren hassas bir iştir. Protokol bölüm 1'de özetlenen prosedür, lensin minimum hasarla başarılı bir şekilde çıkarılmasını sağlar. Lens kapsülünün sağlığını ve bütünlüğünü korumak zor olsa da, herhangi bir hasar izole edilen LEC'lerin kalitesini ve miktarını potansiyel olarak etkileyebileceğinden önemi küçümsenemez. Hücre bölünmelerinin çoğunluğunun tipik olarak, kültürleme için kolayca erişilemeyen bir alan olan mercekteki ekvator bölgesinin yakınındaki çimlenme bölgesinde meydana gelmesi dikkat çekicidir. Zetterberg ve arkadaşlarına göre, lens epitelinin orta kısmı normal şartlar altında minimal mitotik aktivite göstermesine rağmen, tritiye timidin (3H-Tdr) etiketlemesini kullanan deneyler, bu merkezi olarak konumlandırılmış lens epitel hücrelerini potansiyel kök hücreler olarak işaretlemiştir17,22. Kök hücreler, standart koşullar altında düşük çoğalma hızına sahip olmalarına rağmen sınırsız çoğalma kapasitesi gibi farklı özellikler sergilerler. Bu nedenle, lens epitelinin merkezi kısmı, LEC'lerin proliferatif kapasitesinin çimlenme bölgesinden daha iyi bir temsilini sağlayabilir.
Protokol bölüm 2'de detaylandırıldığı gibi LEC'lerin izolasyonu, bu deneysel prosedürde çok önemli bir adım oluşturmaktadır. Lens kapsülünün çıkarılması, enzimatik sindirim ve doku parçalanması dahil olmak üzere integral eylemler, tek tek epitel hücrelerini kapsülden ayırmak için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilir. Bu süreçteki kritik unsurlardan biri tripsin sindiriminin süresidir. Sindirim süresinin 8 ila 10 dakika arasında ayarlanması önerilir. Bu süre 5 dakikadan daha kısa bir süreye kısaltılırsa, eksik hücre ayrılmasına neden olabilir. Tersine, bu zaman diliminin aşırı uzaması, hücre canlılığını önemli ölçüde tehlikeye atabilir. %20 FBS ve 10 μg/mL gentamisin ile takviye edilmiş bir DMEM kültür ortamı ile birlikte bir hücre ayrışma reaktifi olarak tripsin-EDTA'nın kullanılmasının stratejik seçimi, potansiyel kontaminasyon risklerini azaltırken hücre salınımını ve müteakip proliferasyonu optimize eder.
Antibiyotikler, birincil LEC kültürleri sırasında bakteriyel kontaminasyonu önlemek için sıklıkla kullanılır. Ancak antibiyotik seçimi dikkatli yapılmalıdır. Penisilin ve streptomisin gibi yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin yanı sıra antifungal ajanlar, LEC'lerin canlılığını etkileme potansiyeline sahiptir. Alternatif olarak, optimum LEC büyümesi için 10 μg/mL konsantrasyonda bir gentamisin çözeltisi kullanılması önerilir.
Ayrıca, yüksek hücre yoğunluğunun korunması, başarılı birincil LEC kültürü için bir diğer önemli faktördür. Yerleşik hücre hatlarının aksine, birincil LEC'ler optimum büyüme için daha yüksek bir hücre yoğunluğuna ihtiyaç duyar. Bunun başlıca nedeni, farklılaşma durumlarını ve işlevlerini korumaya yardımcı olan doğrudan temas veya parakrin sinyalleme ile kolaylaştırılan etkili hücreler arası iletişime güvenmeleridir. Yüksek hücre yoğunluğu ayrıca, birincil hücrelerin izole edildiğinde ve in vivo orijinlerinden önemli ölçüde farklı bir in vitro ortama yerleştirildiğinde yaşadığı bir durum olan "kültür şokunun" olumsuz etkilerini de azaltır23. Daha in vivo benzeri bir ortamı taklit ederek, yüksek hücre yoğunluğu hayatta kalma oranlarını artırır. Ek olarak, bu yoğunluk, hücre büyümesini ve işlevini destekleyen büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin konsantrasyon gradyanının oluşturulmasına yardımcı olur. Birçok birincil hücrenin ankraja bağımlı olduğu ve proliferasyon için yüzeye bağlanmayı gerektirdiği göz önüne alındığında, yüksek hücre yoğunluğu yapışma için yeterli sayıda komşu hücre sunar ve böylece sağlıklı büyümeyi destekler. Sonuç olarak, hücre yoğunluğunun düzenlenmesi, hücre iletişimi, hayatta kalma ve çoğalma üzerindeki önemli etkisi nedeniyle birincil hücrelerin yetiştirilmesinde çok önemli bir husustur. LEC'ler için ideal bir ortam yaratmak için 24 kuyulu veya 6 oyuklu plakalar gibi daha küçük kültür kaplarının tercih edilmesi önerilir. Bu protokolün izlenmesi tipik olarak LEC'lerin ekimden ~ 10-14 gün sonra birleşik bir duruma ulaşmasına neden olur. Deneylerde en doğal davranışı sağlamak için LEC'leri ideal olarak P0 ve P6 arasında olmak üzere düşük sayıda geçişte kullanmanızı öneririz. 7-10 pasajın ötesinde, LEC'ler azalmış büyüme gösterebilir ve deneysel koşullara alt pasajlardaki hücrelerle aynı şekilde tepki vermeyebilir.
Serum konsantrasyonu doğrudan hücre büyüme hızı ile ilgilidir. Daha düşük FBS seviyelerinin, merkezi epitelin özelliklerine benzeyen daha yavaş büyümeye neden olma olasılığı daha yüksektir. Buna karşılık, daha yüksek FBS seviyeleri proliferatif bölgenin koşullarını taklit eder. Hücre büyümesi yavaşsa, LEC'lerin daha yaşlı veya genetiği değiştirilmiş hayvanlardan izole edilmesi gerektiğinde ortaya çıkabileceği gibi, FBS'yi% 20'ye çıkarmak veya EpiCGS-a (5 mL, bkz. Malzeme Tablosu) gibi bir büyüme takviyesi eklemek faydalı olabilir. Bu serum ve takviye zenginleştirme, hücre proliferasyonunu artırabilir ve epitel hücrelerinin optimal büyümesini teşvik edebilir.
Depolama ve sevkiyat protokolü (protokol bölüm 5), canlı hücrelerin korunması ve taşınması ile ilgili zorlukları dikkate alır. Dondurma ortamının seçimi, depolama ve nakliye sırasında LEC'lerin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. % 70 tam kültür ortamı +% 20 FBS +% 10 DMSO dahil olmak üzere farklı dondurma ortamlarını denedik; %90 FBS + %10 DMSO; ve DMSO ve serumsuz dondurma ortamı. Deneylerimizden elde edilen kanıtlar, %10 DMSO ve %90 FBS içeren bir çözeltinin hücre canlılığını korumada üstün performans sergilediğini göstermektedir. Bu özel formülasyonu kullanarak, birincil LEC'leri 10 yılı aşan süreler boyunca -80 °C'de depolamada başarıyla koruduk ve bu yaklaşımın sağlamlığını ve depolama sonrası hücre canlanmasını kolaylaştırma yeteneğini gösterdik.
LEC'ler için belirteçler olarak αA-kristallin ve γ-kristalin kullanıldı. PROX1, lens fiber hücreleri için bir işaretleyici olarak kullanıldı. LEC fenotipini karakterize etmek için PAX6, FOXE3 ve E-kaderin gibi ek belirteçler de kullanılabilir. Araştırmacılar EMT'yi keşfetmekle ilgileniyorlarsa, αSMA bir belirteç olarak kullanılmalıdır. İnkübasyon sürelerinin ve seyreltmelerin, deneyin özel gereksinimlerine ve kullanılan ilgili antikorlar için sağlanan önerilere uygun olarak ayarlanması esastır.
Bu çalışma, birincil LEC'lerin kültürlenmesi için sağlam bir metodoloji sunarken, sınırlamalarını kabul etmek önemlidir. Başlangıçta izole edilen hücreler birincil LEC'ler olsa da, herhangi bir alt kültürleme, tripsinizasyon ve yeniden canlandırma prosedürleri durumlarında değişikliklere yol açacaktır. Tasarladığımız protokol, LEC'lerin kaynağı olarak öncelikle fare merceğini kullanır; bununla birlikte, LEC'ler katarakt hasta örnekleri, göz bankası gözleri veya glokom ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere farklı oküler hastalıkları olan hastalar dahil olmak üzere diğer kaynaklardan da kültürlenebilir17,24. Yaşlı bireylerden veya belirli oküler rahatsızlıkları olanlardan toplanan LEC'ler, protokole daha genç, daha sağlıklı meslektaşlarından alınan hücreler kadar etkili bir şekilde uymayabilir. LEC'lerin daha yaşlı veya genetiği değiştirilmiş bireylerden veya hayvanlardan kültürlenmesi, potansiyel olarak FBS'yi %20'ye çıkararak veya ek büyüme faktörleri ekleyerek kültür ortamının optimize edilmesini gerektirebilir. Ek olarak, Menko ve ark. tarafından primer embriyonik civciv lensi epitel hücre kültürleri üzerinde yapılan önceki çalışmalar, kültürün ikinci gününden sonra meydana gelen spontan farklılaşmayı göstermiştir25. Bu nedenle, araştırmacılar dikkatli olmalı ve metodolojilerdeki farklılıkları göz önünde bulundurmalıdır, özellikle de farklılaşmayı incelemek ana araştırma hedefleriyse.
Birincil LEC'leri kültürlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Örneğin, Ibaraki ve ark., Sundelin ve ark. ve Andjelic ve ark. tarafından geliştirilen yöntemler, katarakt cerrahisi sırasında toplanan lens kapsülünün ön kısmı kullanılarak birincil LEC'lerin doğrudan Petri kabı üzerinde kültürlenmesini içerir 16,17,19,20. Bu yaklaşım, doğal hücreden hücreye temasları ve hücre dışı matrisi koruyarak, PCO gibi durumlar için çok önemli olan yüksek fizyolojik alaka düzeyi sağlar. Alternatif olarak, Zelenka ve ark. tarafından ana hatlarıyla belirtildiği gibi lens eksplant yöntemi, doğal doku mimarisini koruyarak, fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara izin verir, özellikle LEC'lerin terminal farklılaşmasını, hücresel etkileşimleri ve lens geliştirme süreçlerini araştırmak için faydalıdır ve farklılaşma sırasında ardışık hücresel ve moleküler olayların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar26.
Buna karşılık, bu protokolde açıklanan tripsinizasyon yöntemi, hücre canlılığı ve proliferasyon deneyleri, ilaç taraması ve hücre sinyal yolu analizi gibi belirli deneyler için avantajlı olan tek tip tohumlamayı ve hassas hücre sayımını basitleştiren tek hücreli bir süspansiyon üretir. Bununla birlikte, bu yöntemin tek tip hücre popülasyonu nedeniyle kontrollü ve kesin çalışmaları kolaylaştırırken, hücresel davranışı değiştirebileceğini ve enzimatik işleme nedeniyle eksplant ve doğrudan kültür yöntemlerinde görülen fizyolojik alaka düzeyini tehlikeye atabileceğini kabul etmek çok önemlidir. Yalnızca epitel hücrelerini incelemeye odaklanan araştırmacılar için bu yöntem, bu hücrelerin özellikleri ve davranışları hakkında güvenilir bilgiler sunarak son derece uygulanabilir ve kullanışlı olduğunu kanıtlamaktadır. Bununla birlikte, bilimsel araştırmaları hücresel farklılaşmaya kadar uzananlar için, eksplant teknikleri gibi alternatif yöntemler düşünmek veya mevcut olanı bu yönleri kapsayacak şekilde uyarlamak ve optimize etmek zorunlu hale gelir.
Genel olarak, bu protokol LEC'lerin özel ihtiyaçları ve gereksinimleri dikkatli bir şekilde değerlendirilerek tasarlanmıştır. Diseksiyondan doğrulamaya kadar her adım, hücrelerin canlılığını ve işlevselliğini korumak için düşünceli bir şekilde hazırlanmıştır. Sonuç olarak, LEC'leri ve bunların oküler fizyoloji ve patolojideki rollerini inceleyen araştırmacılar için değerli bir rehber olabilir. Gelecekteki çalışmalar, LEC biyolojisinin farklı yönlerini keşfetmek için bu protokolü uyarlayabilir ve değiştirebilir, lensle ilgili hastalıkların anlaşılmasında daha fazla ilerleme ve katarakt ve PCO önleme için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma NEI R21EY033941 (Hongli Wu'ya) tarafından desteklendi; Savunma Bakanlığı W81XWH2010896 (Hongli Wu'ya); R15GM123463-02 (Kayla Green ve Hongli Wu'ya)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
