Summary
Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.
Abstract
As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.
Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.
Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.
Introduction
A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo continuamente fibras da lente ao longo da vida.
A catarata caracteriza-se pela turvação progressiva do cristalino, resultando em distorção e espalhamento da luz, levando ao comprometimento da visão 3,4. Os mecanismos precisos subjacentes à formação da catarata são complexos e multifatoriais, envolvendo vários processos celulares e moleculares, como radiação UV, dano oxidativo e glicação 5,6. Descobriu-se que as LECs contribuem significativamente para o desenvolvimento da catarata, tornando-as um foco vital de pesquisa 1,2,7,8,9.
Além disso, uma das questões mais prementes em oftalmologia atualmente é a incidência relativamente alta de opacificação da cápsula posterior (PCO), também conhecida como catarata secundária. A PCO continua sendo a complicação mais comum após a cirurgia de catarata, afetando até 20-40% dos pacientes adultos e 100% das crianças dentro de 5 anos após a cirurgia10. A PCO é causada principalmente pelas LECs residuais que permanecem na bolsa capsular após a extração da catarata. Essas células sofrem uma transformação fisiopatológica multifacetada, envolvendo não apenas a transição epitélio-mesenquimal (EMT), mas também a diferenciação das LECs em fibras do cristalino, resultando em uma população celular que é uma mistura de LECs, fibras e miofibroblastos11,12,13. As células transformadas proliferam e migram através da cápsula posterior do cristalino, levando à deficiência visual. A compreensão do comportamento e dos mecanismos de controle das LECs em modelos de cultura pode fornecer informações valiosas sobre a prevenção e o manejo da PCO. Portanto, este protocolo de cultivo de LECs apresenta-se como uma ferramenta vital para os pesquisadores oftalmológicos com o objetivo de estudar, compreender e, finalmente, combater essa complicação pós-operatória prevalente.
Para desvendar os meandros da biologia LEC e seu papel na formação de catarata e PCO, é essencial estabelecer sistemas de cultura de células primárias robustos e reprodutíveis. A cultura primária de LEC fornece aos pesquisadores um ambiente controlado para estudar as funções, sinalização e características moleculares de LECs. Além disso, permite a investigação de processos celulares e dos efeitos de diferentes condições experimentais, fornecendo informações valiosas sobre a fisiologia e patologia do cristalino.
Pesquisas anteriores enriqueceram nosso entendimento sobre as técnicas de cultura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Embora esses estudos tenham empregado várias metodologias e produzido achados significativos sobre o comportamento e as características do LEC, um protocolo de videogravação abrangente e acessível para a cultura de LECs está ausente na literatura atual. Essa limitação pode dificultar a capacidade de pesquisadores iniciantes em reproduzir com precisão as técnicas e pode levar a inconsistências e variações nos resultados experimentais. Ao fornecer um protocolo de gravação de vídeo, este artigo de pesquisa visa preencher essa lacuna e fornecer um recurso padronizado que possa aumentar a reprodutibilidade e facilitar a transferência de conhecimento no campo da cultura LEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.
1. Preparo do meio de cultura e dissecção do cristalino
- Preparar o meio de cultura adicionando 50 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,1 mL de 50 mg/mL de gentamicina a 450 mL de DMEM.
- Eutanasiar humanamente camundongos C57BL/6J com menos de 2 semanas.
OBS: Nós sacrificamos usando o método de inalação de CO2 . Uma taxa de fluxo ótima para sistemas de eutanásia por CO2 deve deslocar 30% a 70% do volume da câmara ou gaiola/min. - Remova suavemente as pálpebras usando tesouras cirúrgicas e aplique uma pressão delicada com pinças curvas em lados opostos da cavidade ocular, fazendo com que o olho se projete para fora. Faça uma incisão cuidadosa na córnea usando a faca de catarata e extraia cuidadosamente o cristalino usando pinças curvas, garantindo que não haja danos ao cristalino ou à sua cápsula.
NOTA: Tenha cuidado ao executar estas etapas para manter a integridade da cápsula da lente. Devido à natureza delicada da lente, é importante usar ferramentas de dissecação com pontas curvas e rombas para minimizar o risco de danos à lente. - Utilize pinças curvas com pontas rombas para transferir as lentes para uma placa de cultura de tecido plástico de 60 mm preenchida com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecida e estéril de Dulbecco contendo 10 μg/mL de gentamicina.
- Enxaguar suavemente as lentes com solução de DPBS contendo 10 μg/mL de gentamicina para remover quaisquer detritos ou contaminantes potenciais, preparar as lentes para processamento posterior e manter um ambiente de cultura estéril.
- Para obter um número adequado de LECs, agrupe quatro lentes para uma placa de cultura de 24 poços e seis lentes para uma placa de cultura de 6 poços.
2. Isolamento de LECs
- Após concluir o processo de enxágue, coloque a lente em um pedaço de papel de filtro, deixando-a secar.
- Quando a lente estiver adequadamente seca, transfira-a cuidadosamente para a tampa de uma placa de Petri em preparação para a remoção da cápsula da lente.
- Gire a lente para cima, garantindo que o segmento anterior esteja voltado para cima. Ao usar a pinça para segurar a cápsula anterior, empregue a pinça capsulorrexis na mão dominante para criar uma pequena ruptura na cápsula. Puxe suavemente as duas ferramentas em direções opostas para remover a cápsula e coloque-a em DPBS até que todas as dissecações da lente sejam concluídas.
NOTA: Para evitar discrepâncias, os pesquisadores devem dissecar prontamente cada cápsula epitelial do cristalino e armazená-las temporariamente em DPBS. Somente após o término de todas as dissecções, as cápsulas são transferidas coletivamente para tripsina mantidas a 37 °C, garantindo uma exposição sincronizada e uniforme. - Transfira cuidadosamente a cápsula da lente para uma placa de 6 poços. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05% em cada poço para iniciar o processo de digestão enzimática.
- Agite suavemente a solução de tripsina para garantir uma permeação uniforme. Coloque a placa em uma incubadora de cultura celular e deixe a cápsula ser digerida por 8-10 min a 37 °C.
NOTA: Esta etapa facilita a quebra do tecido da cápsula do cristalino e a subsequente liberação de células epiteliais individuais. - Após a incubação, pique cuidadosamente a cápsula do cristalino digerido usando uma tesoura dissecante para quebrar quaisquer aglomerados de tecido restantes e promover a separação celular.
NOTA: O rigor na picagem do tecido é enfatizado para garantir a liberação eficiente de células das cápsulas da lente digerida. - Adicionar 0,5 mL do meio de cultura contendo FBS a 10% para extinguir a tripsina. Transfira as amostras de tecido para um tubo de centrifugação e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Use 1 mL de meio de cultura para ressuspender as células e semear as células em uma placa de 24 poços.
- Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias.
3. Subcultura de LECs
- Assim que as células atingirem a confluência, retire o meio da placa de cultura. Proceder à lavagem das células 2x com 1 mL de DPBS.
- Adicionar 200 μL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora durante 5 minutos.
- Após a incubação, remova as células da incubadora e inspecione-as ao microscópio para confirmar se elas se desprenderam da placa de cultura e começaram a flutuar.
- Adicionar 1 mL de meio de cultura e pipetar suavemente as células 3-5x para separar todas as células.
- Transfira as células para tubos de centrífuga e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células no meio de crescimento completo.
- Se necessário, conte o número de células usando um hemocitômetro.
- Subdividir a suspensão celular na proporção de 1:2 ou 1:3 para fins de subcultivo.
- Quando a cultura voltar a se tornar confluente, repita os procedimentos supracitados.
NOTA: LECs florescem em condições de cultura de alta densidade. Evite diluir excessivamente as células, pois isso pode dificultar seu crescimento.
4. Armazenamento e expedição
NOTA: O número de célula ideal para armazenamento é ~1 × 106.
- Lave bem as células 3x com 1 mL de DPBS. Após a lavagem, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora por 5 min.
- Adicionar 2 mL de meio de cultura completo e transferir a suspensão celular para o tubo de centrífuga e centrifugar a 1.000 × g por 5 min.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de congelamento composto por SFB 90% e DMSO 10%, visando densidade celular de 1 × 106 células/mL. Transfira a suspensão celular para o criovial.
- Mover imediatamente as células para um ambiente de -20 °C por 1 h, seguido de -80 °C durante a noite, antes do armazenamento permanente em nitrogênio líquido.
NOTA: Se o azoto líquido não estiver disponível, as células podem ser armazenadas a -80 °C após uma hora inicial a -20 °C. - Se for necessário um envio, envie as células no criovial em um pacote com gelo seco para entrega durante a noite.
- Após o recebimento das células, garanta a rápida recuperação e coloque as células na subcultura. Se a cultura imediata não for viável, transferir as células para nitrogênio líquido para armazenamento prolongado.
NOTA: Se as células forem enviadas, certifique-se de que as amostras estejam profundamente enterradas no gelo seco para evitar danos potenciais causados por flutuações de temperatura.
5. Validação de LECs
- Placa LECs em pratos de cultura de 35 mm com copos de cobertura e cultivá-los por aproximadamente 48 h.
- Lave as células 2x com PBS e fixe as células com metanol frio por 10 min a -20 °C.
- Lavar as células fixas por 3 x 5 min com PBS e incubar as células fixas com tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica.
- Após o bloqueio, incubar as células durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários (αA-cristalino, γ-cristalino e anticorpos PROX1) diluídos individualmente na proporção de 1:50 em tampão diluente.
- Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e incubar as células com o anticorpo secundário diluído 1:100 em tampão diluente por 1 h.
- Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e corá-las com 5 μg/mL Hoechst 33342 em PBS por 10 min à temperatura ambiente para visualizar os núcleos.
- Lavar as células por 2 x 5 min com PBS para remover o excesso de solução corante e capturar imagens fluorescentes das células usando um microscópio de fluorescência usando o canal DAPI para núcleos e canal FITC para αA-, γ-cristalinos e PROX1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como mostrado na Figura 2, seguindo esse protocolo, LECs primárias de camundongos C57BL/6J aderiram às placas em um período de 4 h. Notadamente, havia resquícios visíveis de outros tecidos, como cortes da cápsula posterior e células de fibras do cristalino. No entanto, esses elementos não intencionais não se prenderam ao prato e, portanto, poderiam ser removidos com a mudança do meio de cultura. Posteriormente, entre o terceiro e o quinto dia, as LECs iniciaram sua fase de proliferação. O crescimento rápido, característico da fase de proliferação logarítmica, pôde então ser observado entre o sétimo e o décimo dia. Nos casos em que as células não progridem para a fase de crescimento rápido, pode ser aconselhável incorporar suplementos de crescimento, como EpiCGS-a, no meio de cultura. Além disso, observamos que as células exibem uma taxa de crescimento mais rápida no meio contendo 20% de SFB em comparação com 10% de SFB. Uma concentração mais baixa de FBS normalmente promove um crescimento mais lento, espelhando as características do epitélio central da lente, enquanto uma concentração de 20% de FBS replica os atributos da zona proliferativa da lente.
De acordo com Reddy e col. e Andley et al., que desenvolveram a linhagem celular epitelial humana Imortalizada B3, espera-se que as LECs expressem várias proteínas específicas do cristalino, como αA- e γ-cristalinos 2,21. Assim, neste estudo, empregamos αA- e γ-cristalinos como marcadores celulares para validar a identidade das células como LECs. LECs dentro das três passagens iniciais foram cultivadas em lamínulas de vidro. Os anticorpos primários específicos para αA- e γ-cristalinos foram usados para incubar as células durante a noite. Como mostrado na Figura 3, essas células exibiram expressão robusta de αA- e γ-cristalinos, fornecendo evidências definitivas de que são células epiteliais derivadas do cristalino. Além disso, usamos PROX1 como um marcador bem estabelecido para células de fibra para marcar as LECs primárias. Os dados indicaram que essas LECs apresentaram coloração negativa para PROX1, confirmando que essas células são epiteliais e ainda não haviam sofrido diferenciação em células fibrosas.
Figura 1: Fluxo de trabalho passo a passo para cultura LEC. A figura retrata as etapas sequenciais envolvidas no cultivo de células epiteliais primárias do cristalino. O passo 1 envolve a criação de uma pequena ruptura na cápsula anterior. O passo 2 envolve a remoção suave da cápsula da lente. Na Etapa 3, a cápsula do cristalino é cuidadosamente transferida para uma placa de 24 poços e incubada com solução de tripsina a 0,05% a 37 °C por 10 min. Após a incubação, a cápsula do cristalino digerido é picada usando tesoura dissecante para promover a separação celular. A etapa 4 envolve a supressão da tripsina adicionando 0,5 mL de meio de cultura contendo 20% de SFB ao tubo de centrifugação e centrifugação das amostras de tecido a 1.000 × g por 5 min. O passo 5 requer a ressuspensão das células em 1 mL de meio de cultura e sua semeadura em placa de 24 poços. Finalmente, a Etapa 6 envolve a troca do meio de cultura a cada 2-3 dias para apoiar o crescimento e a manutenção celular durante todo o experimento. Abreviações: LECs = células epiteliais do cristalino; SFB = soro fetal bovino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Padrão de crescimento das LECs ao longo do tempo. As alterações morfológicas das células epiteliais primárias do cristalino em vários momentos durante seu crescimento foram registradas em microscópio de contraste de fase. As imagens capturadas nos dias 1, 2, 3, 5, 7 e 10 retratam a morfologia celular em evolução, fornecendo informações sobre o desenvolvimento e o comportamento das células epiteliais do cristalino ao longo do tempo. Seta vermelha indicando a localização das células epiteliais do cristalino em proliferação ativa. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: LECs = células epiteliais do cristalino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação das LECs. (A) Imunomarcação da αA-cristalina em LECs de camundongos. Os mLECs primários foram corados com Hoechst 33342 (azul) e anticorpo αA-cristalina (verde). (B) Imunomarcação de γ-cristalina em LECs de camundongos. (C) Imunomarcação de PROX1 em LECs de camundongos. Os mLECs primários foram corados com Hoechst 33342 (azul) e anticorpo PROX1 (verde). Barras de escala = 50 μm. Abreviação: LECs = células epiteliais do cristalino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarata e PCO, uma complicação prevalente após a cirurgia de catarata.
Ao comparar LECs primárias com linhagens celulares epiteliais do cristalino, como HLE-B3 e SRA01/04, cada uma apresenta vantagens e desafios únicos em um contexto de pesquisa. A linhagem celular HLE-B3, juntamente com a SRA01/04, representam uma categoria de linhagens celulares que, embora sejam de fácil manuseio e duráveis, frequentemente exibem alterações genéticas e fenotípicas devido à sua replicação contínua e condições de cultura prolongadas. Isso pode levar a diferenças significativas em relação à função das LECs originais, reduzindo assim a autenticidade de suas respostas. Por outro lado, as LECs primárias, isoladas diretamente de tecidos vivos de pacientes ou animais de pesquisa, espelham com mais precisão o ambiente celular natural e as respostas inerentes do cristalino in vivo. Apesar da complexidade adicional de sua extração e cultura, muitas vezes são preferidos em estudos que exigem alta relevância fisiológica, pois fornecem resultados mais precisos e confiáveis.
Alguns pontos-chave devem ser considerados ao seguir esse protocolo. Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos. Observamos que as LECs colhidas desses camundongos jovens demonstraram crescimento mais vigoroso em comparação com as LECs de camundongos com 2 meses ou mais de idade. Isso indica uma correlação negativa entre a idade dos camundongos e o crescimento celular.
A dissecção do cristalino a partir de um olho de rato é uma tarefa delicada, necessitando do uso cuidadoso de ferramentas de dissecação para preservar a integridade do cristalino e de sua cápsula. O procedimento descrito na seção 1 do protocolo garante que a lente seja extraída com sucesso com o mínimo de danos. Embora manter a saúde e a integridade da cápsula da lente seja um desafio, sua importância não pode ser subestimada, pois qualquer dano poderia potencialmente afetar a qualidade e a quantidade de LECs isolados. Vale ressaltar que a maioria das divisões celulares ocorre tipicamente na zona germinativa próxima à região equatorial do cristalino, área de difícil acesso para cultivo. De acordo com Zetterberg et al., embora a parte central do epitélio do cristalino apresente atividade mitótica mínima em circunstâncias normais, experimentos utilizando marcação com timidina tritiada (3H-Tdr) marcaram essas células do epitélio do cristalino posicionadas centralmente como células-tronco potenciais17,22. As células-tronco exibem características distintas, como capacidade de proliferação ilimitada, apesar de terem uma baixa taxa de proliferação em condições padrão. Como tal, a parte central do epitélio do cristalino pode fornecer uma melhor representação da capacidade proliferativa das LECs do que a zona germinativa.
O isolamento das LECs, conforme detalhado na seção 2 do protocolo, constitui uma etapa fundamental neste procedimento experimental. Ações integrais, incluindo a remoção da cápsula do cristalino, digestão enzimática e fragmentação do tecido são cuidadosamente realizadas para separar as células epiteliais individuais da cápsula. Um dos elementos críticos dentro deste processo é a duração da digestão de tripsina. Recomenda-se que o período de digestão seja definido entre 8 e 10 min. Se esse período for encurtado para menos de 5 min, pode resultar em separação celular incompleta. Por outro lado, a extensão excessiva desse período de tempo pode comprometer significativamente a viabilidade celular. A escolha estratégica de empregar tripsina-EDTA como reagente de dissociação celular, em conjunto com um meio de cultura DMEM suplementado com 20% de SFB e 10 μg/mL de gentamicina, otimiza a liberação celular e a subsequente proliferação, ao mesmo tempo em que mitiga potenciais riscos de contaminação.
Antibióticos são frequentemente usados para prevenir contaminação bacteriana durante culturas primárias de LEC. No entanto, a escolha dos antibióticos deve ser feita com cuidado. Antibióticos comumente utilizados, como penicilina e estreptomicina, bem como agentes antifúngicos, têm o potencial de afetar a viabilidade das LECs. Como alternativa, recomenda-se o emprego de uma solução de gentamicina na concentração de 10 μg/mL para um ótimo crescimento da LEC.
Além disso, a manutenção de uma alta densidade celular é outro fator crucial para o sucesso da cultura primária de LEC. Ao contrário das linhagens celulares estabelecidas, as LECs primárias precisam de uma densidade celular maior para um crescimento ideal. Isso se deve principalmente à sua dependência de uma comunicação intercelular eficaz, facilitada pelo contato direto ou sinalização parácrina, que ajuda a manter seu status de diferenciação e função. A alta densidade celular também atenua os efeitos adversos do "choque de cultura", uma condição experimentada por células primárias quando isoladas e colocadas em um ambiente in vitro significativamente diferente de sua origem in vivo 23. Ao mimetizar um ambiente mais in vivo, uma alta densidade celular aumenta as taxas de sobrevivência. Além disso, essa densidade ajuda a estabelecer um gradiente de concentração de fatores de crescimento e citocinas que suporta o crescimento e a função celular. Como muitas células primárias são dependentes de ancoragem, necessitando de fixação superficial para proliferação, uma alta densidade celular oferece um número adequado de células vizinhas para adesão, promovendo assim um crescimento saudável. Consequentemente, a regulação da densidade celular é uma consideração crucial no cultivo de células primárias devido ao seu impacto significativo na comunicação, sobrevivência e proliferação celular. Optar por pratos de cultura menores, como pratos de 24 ou 6 poços, é recomendado para criar um ambiente ideal para LECs. Seguir este protocolo normalmente resulta em LECs atingindo um estado confluente ~10-14 dias após o cultivo. Recomendamos a utilização de LECs em um número baixo de passagens, idealmente entre P0 e P6, para garantir o comportamento mais natural em experimentos. Além de 7-10 passagens, as LECs podem apresentar crescimento diminuído e podem não reagir às condições experimentais da mesma maneira que as células em passagens inferiores.
A concentração sérica está diretamente relacionada com a taxa de crescimento celular. Níveis mais baixos de SFB são mais propensos a induzir um crescimento mais lento, assemelhando-se às características do epitélio central. Em contraste, níveis mais elevados de FBS mimetizam as condições da zona proliferativa. Se o crescimento celular for lento, como pode ocorrer quando os LECs precisam ser isolados de animais mais velhos ou geneticamente modificados, pode ser benéfico aumentar o FBS para 20% ou adicionar um suplemento de crescimento como EpiCGS-a (5 mL, ver Tabela de Materiais) ao meio de cultura. Este enriquecimento de soro e suplemento pode aumentar a proliferação celular e promover o crescimento ideal de células epiteliais.
O protocolo de armazenamento e embarque (seção 5 do protocolo) considera os desafios associados à preservação e transporte de células vivas. A escolha do meio de congelamento é fundamental para a sobrevivência dos LECs durante o armazenamento e transporte. Experimentamos diferentes meios de congelamento, incluindo 70% de meio de cultura completo + 20% de SFB + 10% de DMSO; 90% SFB + 10% DMSO; e meio de congelação livre de DMSO e soro. Evidências de nossos experimentos sugerem que uma solução contendo 10% de DMSO e 90% de FBS apresenta desempenho superior na preservação da viabilidade celular. Utilizando esta formulação específica, mantivemos com sucesso LECs primários em armazenamento a -80 °C por durações superiores a 10 anos, demonstrando a robustez dessa abordagem e sua capacidade de facilitar o renascimento celular após o armazenamento.
αA-cristalina e γ-cristalina foram utilizados como marcadores para LECs. O PROX1 foi utilizado como marcador para células de fibras do cristalino. Marcadores adicionais como PAX6, FOXE3 e E-caderina também podem ser empregados para caracterizar o fenótipo LEC. Se os pesquisadores estão interessados em explorar EMT, αSMA deve ser usado como um marcador. É essencial ajustar os tempos de incubação e diluições de acordo com as exigências específicas do experimento e as recomendações fornecidas para os respectivos anticorpos utilizados.
Embora este estudo apresente uma metodologia robusta para o cultivo de LECs primárias, é importante reconhecer suas limitações. Embora as células isoladas inicialmente sejam LECs primárias, qualquer procedimento de subcultura, tripsinização e reanimação levará a alterações em seu estado. O protocolo que projetamos emprega principalmente lentes de mouse como fonte de LECs; no entanto, as LECs também podem ser cultivadas a partir de outros recursos, incluindo amostras de pacientes com catarata, olhos de bancos de olhos ou pacientes com diferentes doenças oculares, incluindo glaucoma e retinopatia diabética17,24. LECs colhidas de indivíduos mais velhos ou com condições oculares específicas podem não cumprir o protocolo de forma tão eficaz quanto células de contrapartes mais jovens e saudáveis. O cultivo de LECs de indivíduos ou animais mais velhos ou geneticamente modificados pode exigir a otimização do meio de cultura, potencialmente aumentando a FBS para 20% ou incorporando fatores de crescimento adicionais. Além disso, estudos prévios de Menko et al., realizados em culturas de células epiteliais primárias de lentes embrionárias de pintinhos, demonstraram diferenciação espontânea ocorrendo após o segundo dia de cultura25. Portanto, os pesquisadores devem ter cautela e considerar as diferenças nas metodologias, especialmente se estudar a diferenciação é seu principal objetivo de pesquisa.
Vários métodos podem ser utilizados para o cultivo de CTEs primárias. Por exemplo, os métodos desenvolvidos por Ibaraki et al., Sundelin et al., e Andjelic et al., envolvem a cultura de CLEs primárias diretamente na placa de Petri usando a porção anterior da cápsula do cristalino coletada durante a cirurgia de catarata16,17,19,20. Essa abordagem mantém os contatos naturais célula-célula e a matriz extracelular, proporcionando alta relevância fisiológica crucial para condições como a PCO. Alternativamente, o método do explante do cristalino, como descrito por Zelenka e col. preserva a arquitetura do tecido nativo, permitindo estudos fisiologicamente mais relevantes, especialmente benéficos para explorar a diferenciação terminal de LECs, interações celulares e processos de desenvolvimento do cristalino, proporcionando uma compreensão detalhada dos eventos celulares e moleculares sequenciais durante adiferenciação26.
Em contraste, o método de tripsinização descrito neste protocolo produz uma suspensão unicelular uniforme, simplificando a semeadura uniforme e a contagem precisa de células, o que é vantajoso para certos experimentos, como ensaios de viabilidade e proliferação celular, triagem de drogas e análise de vias de sinalização celular. No entanto, é fundamental reconhecer que, embora este método facilite estudos controlados e precisos devido à sua população celular uniforme, pode alterar o comportamento celular e comprometer a relevância fisiológica observada nos métodos de explante e cultivo direto devido ao processamento enzimático. Para pesquisadores focados exclusivamente no estudo de células epiteliais, esse método se mostra altamente aplicável e conveniente, oferecendo insights confiáveis sobre as características e comportamentos dessas células. Entretanto, para aqueles cujas investigações científicas se estendem à diferenciação celular, torna-se essencial contemplar métodos alternativos, como as técnicas de explante, ou adaptar e otimizar o atual para abranger esses aspectos.
Em geral, este protocolo é projetado com uma consideração cuidadosa das necessidades e requisitos específicos dos LECs. Cada etapa, da dissecção à validação, é cuidadosamente trabalhada para manter a viabilidade e a funcionalidade das células. Como resultado, pode ser um guia valioso para os pesquisadores que estudam LECs e seu papel na fisiologia e patologia ocular. Estudos futuros podem adaptar e modificar este protocolo para explorar diferentes aspectos da biologia do LEC, fornecendo uma plataforma para novos avanços na compreensão das doenças relacionadas ao cristalino e o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a prevenção da catarata e da PCO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
