Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat videoprotokoll för odling av primära linsepitelceller (LEC), som syftar till att förbättra reproducerbarheten och underlätta forskning inom grå starr och bakre kapselopacifiering (PCO). Den erbjuder steg-för-steg-instruktioner om linsdissektion, LEC-isolering och validering, och fungerar som en värdefull guide, särskilt för nykomlingar inom området.
Abstract
Linsepitelceller (LEC) spelar flera viktiga roller för att upprätthålla linsens homeostas och normala funktion. LEC bestämmer linsens tillväxt, utveckling, storlek och transparens. Omvänt kan dysfunktionella LEC leda till kataraktbildning och bakre kapselopacifiering (PCO). Följaktligen är det viktigt att etablera ett robust primärt LEC-odlingssystem för forskare som är engagerade i linsutveckling, biokemi, kataraktterapi och PCO-förebyggande. Att odla primära LEC:er har dock länge inneburit utmaningar på grund av deras begränsade tillgänglighet, långsamma spridningshastighet och känsliga natur.
Denna studie tar itu med dessa hinder genom att presentera ett omfattande protokoll för primär LEC-kultur. Protokollet omfattar viktiga steg såsom formulering av ett optimerat odlingsmedium, exakt isolering av linskapslar, trypsiniseringstekniker, subkulturprocedurer, skördeprotokoll och riktlinjer för lagring och transport. Under hela odlingsprocessen övervakades cellmorfologin med faskontrastmikroskopi.
För att bekräfta äktheten hos de odlade LEC:erna utfördes immunofluorescensanalyser för att detektera närvaron och subcellulär distribution av kritiska linsproteiner, nämligen αA- och γ-kristalliner. Detta detaljerade protokoll utrustar forskare med en värdefull resurs för att odla och karakterisera primära LEC, vilket möjliggör framsteg i vår förståelse av linsbiologi och utvecklingen av terapeutiska strategier för linsrelaterade sjukdomar.
Introduction
Ögats lins spelar en avgörande roll för synen genom att fokusera inkommande ljus på näthinnan. Den består av en transparent, avaskulär struktur som består av specialiserade celler, bland vilka linsepitelceller (LEC) är nyckelspelare. LEC är placerade på linsens främre yta och är ansvariga för att upprätthålla dess transparens, reglera vattenbalansen och delta i linsens tillväxt och utveckling 1,2. LEC är en unik typ av celler som finns i den främre delen av linsen och spelar en avgörande roll för att upprätthålla linsens klarhet och funktion genom att kontinuerligt producera linsfibrer under hela livet.
Grå starr kännetecknas av en progressiv grumling av linsen, vilket resulterar i förvrängning och spridning av ljus, vilket leder till nedsatt syn 3,4. De exakta mekanismerna bakom kataraktbildning är komplexa och multifaktoriella, och involverar olika cellulära och molekylära processer såsom UV-strålning, oxidativ skada och glykation 5,6. LEC har visat sig bidra avsevärt till utvecklingen av grå starr, vilket gör dem till ett viktigt fokus för forskning 1,2,7,8,9.
Dessutom är en av de mest angelägna frågorna inom oftalmologi idag den relativt höga förekomsten av bakre kapselopacifiering (PCO), även känd som sekundär katarakt. PCO är fortfarande den vanligaste komplikationen efter kataraktoperation och drabbar upp till 20-40 % av vuxna patienter och 100 % av barnen inom 5 år efter operationen10. PCO orsakas främst av de kvarvarande LEC som finns kvar i kapselpåsen efter kataraktextraktion. Dessa celler genomgår en mångfacetterad patofysiologisk omvandling som inte bara involverar epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) utan också differentiering av LEC till linsfibrer, vilket resulterar i en cellpopulation som är en blandning av LECs, fibrer och myofibroblaster 11,12,13. De transformerade cellerna förökar sig och migrerar över den bakre linskapseln, vilket leder till synnedsättning. Att förstå beteendet och kontrollmekanismerna hos LEC i odlingsmodeller kan ge värdefulla insikter om förebyggande och hantering av PCO. Därför utgör detta protokoll för odling av LEC ett viktigt verktyg för oftalmologiska forskare som syftar till att studera, förstå och i slutändan bekämpa denna utbredda postoperativa komplikation.
För att reda ut komplexiteten i LEC-biologi och dess roll i kataraktbildning och PCO är det viktigt att etablera robusta och reproducerbara in vitro primära cellodlingssystem. Primär LEC-odling ger forskare en kontrollerad miljö för att studera funktioner, signalering och molekylära egenskaper hos LEC. Dessutom möjliggör det undersökning av cellulära processer och effekterna av olika experimentella förhållanden, vilket ger värdefulla insikter i linsfysiologi och patologi.
Tidigare forskning har berikat vår förståelse av LEC-kulturtekniker 14,15,16,17,18,19,20. Även om dessa studier har använt olika metoder och gett betydande resultat om LEC-beteende och egenskaper, saknas ett omfattande och tillgängligt videoinspelningsprotokoll för odling av LEC i den nuvarande litteraturen. Denna begränsning kan hindra nybörjarforskares förmåga att korrekt reproducera teknikerna och kan leda till inkonsekvenser och variationer i experimentella resultat. Genom att tillhandahålla ett videoinspelningsprotokoll syftar denna forskningsrapport till att överbrygga denna klyfta och tillhandahålla en standardiserad resurs som kan förbättra reproducerbarheten och underlätta kunskapsöverföring inom området LEC-kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Association for Research in Vision and Ophthalmology guidelines for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Förfarandegodkännande beviljades av University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee (protokollnummer: IACUC-2022-0008). Unga C57BL/6J-möss, vanligtvis under 2 veckors ålder, användes i dessa studier.
1. Förberedelse av odlingsmedium och dissektion av linsen
- Bered odlingsmediet genom att tillsätta 50 ml fetalt bovint serum (FBS) och 0,1 ml 50 mg/ml gentamicin till 450 ml DMEM.
- Avliva C57BL/6J-möss som är yngre än 2 veckor på ett humant sätt.
OBS: Vi avlivade med CO2 -inhalationsmetoden. En optimal flödeshastighet för CO2 - eutanasisystem bör förskjuta 30 % till 70 % av kammarens eller burens volym/min. - Ta försiktigt bort ögonlocken med en kirurgisk sax och tryck försiktigt med en böjd pincett på motsatta sidor av ögonhålan, vilket gör att ögat sticker ut utåt. Gör ett försiktigt snitt på hornhinnan med gråstarrkniven och dra försiktigt ut linsen med en böjd pincett, se till att linsen eller dess kapsel inte skadas.
OBS: Var försiktig när du utför dessa steg för att bibehålla linskapselns integritet. På grund av linsens ömtåliga natur är det viktigt att använda dissektionsverktyg med böjda och trubbiga spetsar för att minimera risken för linsskador. - Använd en böjd pincett med trubbiga spetsar för att överföra linserna till en 60 mm plastvävnadsodlingsskål fylld med 5 ml förvärmd och steril Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) som innehåller 10 μg/ml gentamicin.
- Skölj försiktigt linserna med DPBS-lösning som innehåller 10 μg/ml gentamicin för att avlägsna eventuellt skräp eller föroreningar, förbereda linserna för vidare bearbetning och upprätthålla en steril odlingsmiljö.
- För att få ett tillräckligt antal LEC, slå samman fyra linser för en odlingsplatta med 24 brunnar och sex linser för en odlingsplatta med 6 brunnar.
2. LEC-isolering
- När du har avslutat sköljningsprocessen, placera linsen på en bit filterpapper och låt den torka.
- När linsen är tillräckligt torr, överför den försiktigt till locket på en petriskål som förberedelse för borttagning av linskapseln.
- Vrid linsen uppåt och se till att det främre segmentet är vänt uppåt. Medan du använder pincetten för att hålla den främre kapseln, använd kapsulorhexis-pincetten i den dominanta handen för att skapa en liten reva i kapseln. Dra försiktigt de två verktygen i motsatta riktningar för att ta bort kapseln och lägg den i DPBS tills alla linsdissektioner är klara.
OBS: För att undvika avvikelser bör forskare omedelbart dissekera varje linsepitelkapsel och tillfälligt förvara dem i DPBS. Först efter att alla dissektioner har slutförts överförs kapslarna kollektivt till trypsin som hålls vid 37 °C, vilket säkerställer synkroniserad och enhetlig exponering. - Överför försiktigt linskapseln till en 6-hålsplatta. Tillsätt 1 ml 0,05 % trypsinlösning till varje brunn för att initiera den enzymatiska nedbrytningsprocessen.
- Skaka försiktigt trypsinlösningen för att säkerställa jämn genomträngning. Placera plattan i en cellodlingsinkubator och låt kapseln smältas i 8-10 minuter vid 37 °C.
OBS: Detta steg underlättar nedbrytningen av linskapselvävnaden och den efterföljande frisättningen av enskilda epitelceller. - Efter inkubationen, hacka försiktigt den smälta linskapseln med dissekerande sax för att bryta ner eventuella kvarvarande vävnadsklumpar och främja cellseparation.
OBS: Noggrannhet i vävnadsmalning betonas för att säkerställa effektiv cellfrisättning från de smälta linskapslarna. - Tillsätt 0,5 ml av odlingsmediet som innehåller 10 % FBS för att släcka trypsinet. Överför vävnadsproverna till ett centrifugeringsrör och centrifugera vid 1 000 × g i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten. Använd 1 ml odlingsmedium för att återsuspendera cellerna och så cellerna i en platta med 24 brunnar.
- Byt odlingsmedium var 2-3:e dag.
3. LECs subkultur
- När cellerna har sammanfötts, ta bort mediet från odlingsskålen. Fortsätt att tvätta cellerna 2x med 1 ml DPBS.
- Tillsätt 200 μl trypsin-EDTA-lösning och placera cellerna i inkubatorn i 5 min.
- Efter inkubationen tas cellerna ut ur inkubatorn och inspekteras i mikroskop för att bekräfta att de har lossnat från odlingsskålen och börjat flyta.
- Tillsätt 1 ml odlingsmedium och pipettera försiktigt cellerna 3-5 gånger för att lossa alla celler.
- Överför cellerna till centrifugrör och centrifugera vid 1 000 × g i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i det kompletta odlingsmediet.
- Om det behövs, räkna cellantalet med hjälp av en hemocytometer.
- Dela upp cellsuspensionen i förhållandet 1:2 eller 1:3 för subkulturändamål.
- När kulturen blir sammanflytande igen, upprepa de ovan nämnda procedurerna.
OBS: LEC:er frodas i odlingsförhållanden med hög densitet. Undvik att späda ut cellerna för mycket, eftersom det kan hindra deras tillväxt.
4. Lagring och transport
OBS: Det idealiska cellnumret för lagring är ~1 × 106.
- Tvätta cellerna noggrant 3 gånger med 1 ml DPBS. Efter tvätt, tillsätt 1 ml trypsin-EDTA-lösning och placera cellerna i inkubatorn i 5 minuter.
- Tillsätt 2 ml helodlingsmedium och överför cellsuspensionen till centrifugröret och centrifugera vid 1 000 × g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i ett frysmedium bestående av 90 % FBS och 10 % DMSO, med sikte på en celltäthet på 1 × 106 celler/ml. Överför cellsuspensionen till kryovialen.
- Flytta omedelbart cellerna till en miljö på -20 °C i 1 timme, följt av -80 °C över natten, innan permanent förvaring i flytande kväve.
OBS: Om flytande kväve inte är tillgängligt kan cellerna förvaras vid -80 °C efter en första timme vid -20 °C. - Om en försändelse krävs, skicka cellerna i kryovialen i ett paket med torris för leverans över natten.
- Vid mottagandet av cellerna, se till att cellerna snabbt återhämtar sig och placera dem i subkulturen. Om omedelbar odling inte är möjlig, överför cellerna till flytande kväve för långvarig lagring.
OBS: Om cellerna ska skickas, se till att proverna är djupt begravda i torrisen för att förhindra potentiella skador från temperaturfluktuationer.
5. LEC-validering
- Platta LEC i 35 mm odlingsformar med täckglas och odla dem i cirka 48 timmar.
- Tvätta cellerna 2x med PBS och fixera cellerna med kall metanol i 10 min vid -20 °C.
- Tvätta de fasta cellerna i 3 x 5 minuter med PBS och inkubera de fasta cellerna med blockeringsbuffert i 1 timme vid rumstemperatur för att förhindra ospecifik bindning.
- Efter blockering inkuberas cellerna över natten vid 4 °C med de primära antikropparna (αA-kristallin-, γ-kristallin- och PROX1-antikroppar) individuellt utspädda i spädningsbuffert i förhållandet 1:50.
- Tvätta cellerna i 3 x 5 minuter med PBS och inkubera cellerna med den sekundära antikroppen utspädd 1:100 i spädningsbuffert i 1 timme.
- Tvätta cellerna i 3 x 5 minuter med PBS och färga cellerna med 5 μg/ml Hoechst 33342 i PBS i 10 min i rumstemperatur för att visualisera kärnorna.
- Tvätta cellerna i 2 x 5 minuter med PBS för att ta bort överflödig färgningslösning och ta fluorescerande bilder av cellerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop med DAPI-kanalen för kärnor och FITC-kanalen för αA-, γ-kristalliner och PROX1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som visas i figur 2, genom att följa detta protokoll, fäste primära LEC från C57BL/6J-möss på disken inom en period av 4 timmar. Noterbart var att det fanns synliga rester av andra vävnader såsom delar av den bakre kapseln och linsfiberceller. Dessa oavsiktliga element fäste dock inte på skålen och kunde därför avlägsnas genom att byta odlingsmedium. Därefter, mellan den tredje och femte dagen, inledde LEC sin spridningsfas. Snabb tillväxt, karakteristisk för den logaritmiska proliferationsfasen, kunde sedan observeras mellan den sjunde och tionde dagen. I de fall då cellerna inte utvecklas till den snabba tillväxtfasen kan det vara lämpligt att införliva tillväxttillskott, såsom EpiCGS-a, i odlingsmediet. Dessutom observerade vi att celler uppvisar en snabbare tillväxthastighet i mediet som innehåller 20 % FBS jämfört med 10 % FBS. En lägre FBS-koncentration främjar vanligtvis långsammare tillväxt, vilket speglar egenskaperna hos linsens centrala epitel, medan en 20 % FBS-koncentration replikerar attributen för linsens proliferativa zon.
Enligt Reddy et al. och Andley et al., som utvecklade den odödliga humana linsepitelcellinjen B3, förväntas det att LEC bör uttrycka olika linsspecifika proteiner såsom αA- och γ-kristalliner 2,21. Därför använde vi i denna studie αA- och γ-kristalliner som cellulära markörer för att validera identiteten hos cellerna som LEC. LEC:er inom de tre första passagerna odlades på täckglas av glas. De primära antikropparna som är specifika för αA- och γ-kristalliner användes för att inkubera cellerna över natten. Som visas i figur 3 uppvisade dessa celler ett robust uttryck av både αA- och γ-kristalliner, vilket ger definitiva bevis för att de är linshärledda epitelceller. Dessutom använde vi PROX1 som en väletablerad markör för fiberceller för att märka de primära LEC:erna. Data indikerade att dessa LEC visade negativ färgning för PROX1, vilket bekräftar att dessa celler är epitelceller och ännu inte hade genomgått differentiering till fiberceller.
Bild 1: Steg-för-steg-arbetsflöde för LEC-kultur. Figuren visar de sekventiella stegen som är involverade i odlingen av primära linsepitelceller. Steg 1 innebär att man skapar en liten reva i den främre kapseln. Steg 2 innebär att försiktigt ta bort linskapseln. I steg 3 överförs linskapseln försiktigt till en platta med 24 brunnar och inkuberas med 0,05 % trypsinlösning vid 37 °C i 10 minuter. Efter inkubationen mals den smälta linskapseln med dissekerande sax för att främja cellseparationen. Steg 4 innebär att trypsinet släcks genom att 0,5 ml odlingsmedium som innehåller 20 % FBS tillsätts till centrifugeringsröret och vävnadsproverna centrifugeras vid 1 000 × g i 5 minuter. Steg 5 kräver att cellerna suspenderas i 1 ml odlingsmedium och sås i en 24-hålsplatta. Slutligen innebär steg 6 att man byter odlingsmedium var 2-3:e dag för att stödja celltillväxt och underhåll under hela experimentet. Förkortningar: LECs = linsepitelceller; FBS = serum hos foster hos nötkreatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tillväxtmönster för LEC över tid. De morfologiska förändringarna av primära linsepitelceller vid olika tidpunkter under deras tillväxt registrerades under ett faskontrastmikroskop. Bilderna som togs dag 1, 2, 3, 5, 7 och 10 visar den utvecklande cellmorfologin, vilket ger insikt i linsepitelcellernas utveckling och beteende över tid. Röd pil som indikerar platsen för aktivt prolifererande linsepitelceller. Skalstreck = 100 μm. Förkortning: LECs = linsepitelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Validering av LEC. (A) Immunfärgning av αA-kristallin i LEC hos möss. Primära mLEC färgades med Hoechst 33342 (blå) och αA-kristallinantikropp (grön). B) Immunfärgning av γ-kristallin i LEC hos möss. (C) Immunfärgning av PROX1 i LEC hos möss. Primära mLEC färgades med Hoechst 33342 (blå) och PROX1-antikropp (grön). Skalstaplar = 50 μm. Förkortning: LECs = linsepitelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras i detta dokument ger en omfattande, steg-för-steg-guide till framgångsrik isolering, kultur och subkultur av primära LEC:er, komplett med tillhörande videodokumentation. Den detaljerade visuella guiden tillsammans med de skriftliga instruktionerna ökar protokollets tydlighet och tillgänglighet och främjar dess användning och reproducerbarhet bland forskare inom området. Det slutliga målet är att bidra till den växande kunskapen kring LECs roll i kataraktbildning och PCO, en vanlig komplikation efter kataraktkirurgi.
När man jämför primära LEC med linsepitelcellinjer, såsom HLE-B3 och SRA01/04, presenterar var och en unika fördelar och utmaningar i ett forskningssammanhang. HLE-B3-cellinjen, tillsammans med SRA01/04, representerar en kategori av cellinjer som, även om de är lätta att hantera och hållbara, ofta uppvisar genetiska och fenotypiska förändringar på grund av deras kontinuerliga replikation och långvariga odlingsförhållanden. Detta kan leda till betydande skillnader från funktionen hos de ursprungliga LEC:erna, vilket minskar autenticiteten i deras svar. Omvänt speglar primära LEC, direkt isolerade från levande vävnad från patienter eller försöksdjur, mer exakt den naturliga cellulära miljön och linsens inneboende respons in vivo. Trots den ökade komplexiteten i deras extraktion och odling är de ofta att föredra i studier som kräver hög fysiologisk relevans, eftersom de ger mer exakta och tillförlitliga resultat.
Vissa viktiga punkter måste beaktas när du följer detta protokoll. Unga C57BL/6J-möss, vanligtvis under 2 veckors ålder, användes i dessa studier. Vi observerade att LEC skördade från dessa unga möss visade kraftigare tillväxt jämfört med LEC från möss som var 2 månader eller äldre. Detta tyder på en negativ korrelation mellan mössens ålder och celltillväxt.
Dissektionen av linsen från ett musöga är en känslig uppgift, vilket kräver noggrann användning av dissekeringsverktyg för att bevara linsens och dess kapsels integritet. Proceduren som beskrivs i protokollavsnitt 1 säkerställer att linsen framgångsrikt extraheras med minimal skada. Även om det är en utmaning att upprätthålla linskapselns hälsa och integritet, kan dess betydelse inte underskattas eftersom eventuella skador potentiellt kan påverka kvaliteten och kvantiteten av isolerade LEC:er. Det är anmärkningsvärt att majoriteten av celldelningarna vanligtvis sker i den grova zonen nära ekvatorialregionen i linsen, ett område som inte är lättillgängligt för odling. Enligt Zetterberg et al., även om den centrala delen av linsepitelet uppvisar minimal mitotisk aktivitet under normala omständigheter, har experiment som använder tritierad tymidin (3H-Tdr) märkning markerat dessa centralt placerade linsepitelceller som potentiella stamceller17,22. Stamceller uppvisar distinkta egenskaper, såsom obegränsad spridningskapacitet trots att de har en låg spridningshastighet under standardförhållanden. Som sådan kan den centrala delen av linsepitelet ge en bättre representation av LEC:s proliferativa kapacitet än den groende zonen.
Isoleringen av LEC, som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet, utgör ett avgörande steg i detta experimentella förfarande. Integrerade åtgärder inklusive avlägsnande av linskapseln, enzymatisk matsmältning och vävnadsfragmentering utförs noggrant för att separera enskilda epitelceller från kapseln. En av de kritiska delarna i denna process är varaktigheten av trypsinnedbrytningen. Det rekommenderas att matsmältningsperioden ställs in mellan 8 och 10 minuter. Om denna period förkortas till mindre än 5 minuter kan det leda till ofullständig cellseparation. Omvänt kan en överförlängning av denna tidsram avsevärt äventyra cellernas livskraft. Det strategiska valet att använda trypsin-EDTA som ett celldissociationsreagens, i kombination med ett DMEM-odlingsmedium kompletterat med 20 % FBS och 10 μg/ml gentamicin, optimerar cellfrisättningen och efterföljande proliferation samtidigt som potentiella kontamineringsrisker minimeras.
Antibiotika används ofta för att förhindra bakteriell kontaminering under primära LEC-odlingar. Valet av antibiotika bör dock göras med omsorg. Vanligt förekommande antibiotika som penicillin och streptomycin, såväl som svampdödande medel, har potential att påverka livskraften hos LEC. Som ett alternativ rekommenderas att använda en gentamicinlösning i en koncentration av 10 μg/ml för optimal LEC-tillväxt.
Att upprätthålla en hög celltäthet är dessutom en annan avgörande faktor för framgångsrik primär LEC-odling. Till skillnad från etablerade cellinjer behöver primära LEC en högre celltäthet för optimal tillväxt. Detta beror främst på att de är beroende av effektiv intercellulär kommunikation, som underlättas av direktkontakt eller parakrin signalering, vilket hjälper till att upprätthålla deras differentieringsstatus och funktion. Hög celltäthet mildrar också de negativa effekterna av "kulturchock", ett tillstånd som upplevs av primära celler när de isoleras och placeras i en in vitro-miljö som skiljer sig avsevärt från deras ursprung in vivo 23. Genom att efterlikna en mer in vivo-liknande miljö ökar en hög celltäthet överlevnaden. Dessutom hjälper denna densitet till att etablera en koncentrationsgradient av tillväxtfaktorer och cytokiner som stöder celltillväxt och funktion. Med tanke på att många primära celler är förankringsberoende och kräver ytfäste för proliferation, erbjuder en hög celltäthet ett tillräckligt antal närliggande celler för vidhäftning, vilket främjar en sund tillväxt. Följaktligen är regleringen av celltäthet en avgörande faktor vid odling av primära celler på grund av dess betydande inverkan på cellkommunikation, överlevnad och spridning. Att välja mindre odlingsskålar, såsom tallrikar med 24 eller 6 brunnar, rekommenderas för att skapa en idealisk miljö för LEC. Att följa detta protokoll resulterar vanligtvis i att LEC når ett sammanflytande tillstånd ~10-14 dagar efter odling. Vi rekommenderar att du använder LEC vid ett lågt antal passager, helst mellan P0 och P6, för att säkerställa det mest naturliga beteendet i experiment. Bortom 7-10 passager kan LEC uppvisa minskad tillväxt och kanske inte reagerar på experimentella förhållanden på samma sätt som celler i lägre passager.
Serumkoncentrationen är direkt relaterad till celltillväxthastigheten. Lägre nivåer av FBS är mer benägna att inducera långsammare tillväxt, vilket liknar egenskaperna hos det centrala epitelet. Däremot efterliknar högre FBS-nivåer förhållandena i den proliferativa zonen. Om celltillväxten är långsam, vilket kan inträffa när LEC behöver isoleras från äldre eller genetiskt modifierade djur, kan det vara fördelaktigt att öka FBS till 20 % eller lägga till ett tillväxttillskott som EpiCGS-a (5 ml, se materialförteckning) till odlingsmediet. Denna anrikning av serum och kosttillskott kan förbättra cellproliferationen och främja optimal tillväxt av epitelceller.
Lagrings- och transportprotokollet (protokollavsnitt 5) tar hänsyn till de utmaningar som är förknippade med bevarande och transport av levande celler. Valet av frysmedium är avgörande för LEC:s överlevnad under lagring och transport. Vi har experimenterat med olika frysmedier, inklusive 70 % komplett odlingsmedium + 20 % FBS + 10 % DMSO; 90 % FBS + 10 % DMSO; och DMSO- och serumfritt frysmedium. Bevis från våra experiment tyder på att en lösning som består av 10 % DMSO och 90 % FBS uppvisar överlägsen prestanda när det gäller att bevara cellviabiliteten. Genom att använda denna specifika formulering har vi framgångsrikt behållit primära LEC i lager vid -80 °C i varaktigheter som överstiger 10 år, vilket visar robustheten i detta tillvägagångssätt och dess förmåga att underlätta cellåterupplivning efter lagring.
αA-kristallin och γ-kristallin användes som markörer för LEC. PROX1 användes som markör för linsfiberceller. Ytterligare markörer som PAX6, FOXE3 och E-cadherin kan också användas för att karakterisera LEC-fenotypen. Om forskare är intresserade av att utforska EMT bör αSMA användas som markör. Det är viktigt att justera inkubationstiderna och spädningarna i enlighet med de specifika kraven för försöket och de rekommendationer som ges för respektive antikroppar som används.
Även om denna studie presenterar en robust metod för att odla primära LEC:er, är det viktigt att erkänna dess begränsningar. Även om de celler som isoleras initialt är primära LEC, kommer alla subkultur-, trypsiniserings- och återupplivningsprocedurer att leda till förändringar i deras status. Protokollet vi har designat använder i första hand muslins som källa till LEC; LEC kan dock också odlas från andra resurser, inklusive prover från gråstarrspatienter, ögonbanksögon eller patienter med olika ögonsjukdomar inklusive glaukom och diabetisk retinopati17,24. LEC skördas från äldre individer eller de med specifika okulära tillstånd kanske inte följer protokollet lika effektivt som celler från yngre, friskare motsvarigheter. Odling av LEC från äldre eller genetiskt modifierade individer eller djur kan kräva optimering av odlingsmediet, eventuellt genom att öka FBS till 20 % eller införliva ytterligare tillväxtfaktorer. Dessutom har tidigare studier av Menko et al., utförda på primära embryonala kycklinglinsepitelcellkulturer, visat spontan differentiering som inträffar efter den andra odlingsdagen25. Därför bör forskare vara försiktiga och överväga skillnaderna i metoder, särskilt om studier av differentiering är deras huvudsakliga forskningsmål.
Olika metoder kan användas för att odla primära LEC:er. Till exempel, metoder som utvecklats av Ibaraki et al., Sundelin et al., och Andjelic et al., involverar odling av primära LEC direkt på petriskålen med hjälp av den främre delen av linskapseln som samlats in under kataraktkirurgi 16,17,19,20. Detta tillvägagångssätt upprätthåller naturliga cell-till-cell-kontakter och den extracellulära matrisen, vilket ger hög fysiologisk relevans som är avgörande för tillstånd som PCO. Alternativt bevarar linsexplantationsmetoden, såsom den beskrivs av Zelenka et al., den inhemska vävnadsarkitekturen, vilket möjliggör studier som är mer fysiologiskt relevanta, särskilt fördelaktiga för att utforska den terminala differentieringen av LEC, cellulära interaktioner och linsutvecklingsprocesser, vilket ger en detaljerad förståelse för sekventiella cellulära och molekylära händelser under differentiering26.
Däremot ger trypsiniseringsmetoden som beskrivs i detta protokoll en enhetlig encellssuspension, vilket förenklar enhetlig sådd och exakt cellräkning, vilket är fördelaktigt för vissa experiment såsom cellviabilitet och proliferationsanalyser, läkemedelsscreening och analys av cellsignalvägar. Det är dock viktigt att erkänna att även om denna metod underlättar kontrollerade och exakta studier på grund av dess enhetliga cellpopulation, kan den förändra cellulärt beteende och äventyra den fysiologiska relevansen som ses i explanterings- och direktodlingsmetoderna på grund av enzymatisk bearbetning. För forskare som uteslutande fokuserar på att studera epitelceller visar sig denna metod vara mycket användbar och bekväm, och erbjuder pålitliga insikter om dessa cellers egenskaper och beteenden. Men för dem vars vetenskapliga undersökningar sträcker sig till cellulär differentiering blir det viktigt att överväga alternativa metoder som explantationstekniker, eller anpassa och optimera den nuvarande för att omfatta dessa aspekter.
Sammantaget är detta protokoll utformat med noggrann hänsyn till LEC:s specifika behov och krav. Varje steg, från dissektion till validering, är genomtänkt utformat för att bibehålla cellernas livskraft och funktionalitet. Som ett resultat kan den vara en värdefull guide för forskare som studerar LEC och deras roll i okulär fysiologi och patologi. Framtida studier kan anpassa och modifiera detta protokoll för att utforska olika aspekter av LEC-biologi, vilket ger en plattform för ytterligare framsteg i förståelsen av linsrelaterade sjukdomar och utvecklingen av nya terapeutiska strategier för förebyggande av grå starr och PCO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NEI R21EY033941 (till Hongli Wu); Försvarsdepartementets W81XWH2010896 (till Hongli Wu); R15GM123463-02 (till Kayla Green och Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
- Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
- Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
- Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
- Lou, M. F.
- Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
- Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).
- Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
- Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).
- Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).
- Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
- Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001 (2022).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
- Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
- Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
- Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
- Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).
- Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
- Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
- Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
- Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).
