Summary
Ce travail décrit l’utilisation d’une méthode de flottation pour identifier Toxocara canis et Ancylostoma spp. détectés dans des échantillons fécaux prélevés sur des chiens au Mexique de 2017 à 2021 dans des conditions de terrain.
Abstract
Le diagnostic des parasites canins à potentiel zoonotique tels que Toxocara canis et Ancylostoma caninum sur le terrain est généralement difficile en raison de l’accès limité à un laboratoire dans les zones rurales et suburbaines du Mexique. Cette étude visait à détecter T. canis et Ancylostoma spp. dans des échantillons fécaux prélevés sur des chiens au Mexique de 2017 à 2021 dans des conditions de terrain. Le calcul de la taille de l’échantillon a abouti à un recrutement cible de 534 chiens à travers le pays.
Les échantillons ont été prélevés directement dans le rectum ou le sol après la défécation. Les échantillons ont été stockés dans des sacs en plastique individuels hermétiquement fermés à 4 °C. Une solution saturée de chlorure de sodium (densité [SpG] 1,20) a été préparée sur le terrain et en laboratoire. Dans les 3 jours suivant la collecte, 2 à 4 g de matières fécales ont été testés pour détecter les parasites à l’aide d’une méthode de flottation en suspendant chaque échantillon fécal dans une solution saline. Les matières fécales ont été mélangées à la solution de flottation et écrasées à l’aide d’une cuillère en métal.
Une fois la consistance uniforme obtenue, l’échantillon fécal a été versé dans un nouveau gobelet en plastique à l’aide d’un tamis et laissé reposer pendant 10 à 15 minutes. Trois gouttes du haut du mélange ont été prélevées à l’aide d’une boucle d’inoculation stérilisée. Les lames ont été placées sur le microscope et les parasites ont été identifiés par des parasitologues qualifiés. Des échantillons fécaux de 1 055 chiens ont été examinés au microscope. Le nombre d’échantillons positifs pour Ancylostoma spp. était de 833 (fréquence de 78,95 %) et de 222 (21,04 %) pour T. canis. Ces résultats illustrent l’importance d’identifier les géohelminthes zoonotiques chez les chiens vivant dans les zones urbaines et rurales du Mexique en utilisant une technique coproparasitoscopique en laboratoire et sur le terrain.
Introduction
Les parasites gastro-intestinaux sont l’un des problèmes de santé les plus courants qui affectent les chiens1. Les estimations suggèrent qu’il y a ~700 millions de chiens domestiques dans le monde, et environ 175 millions peuvent être classés comme en liberté2. Plus de 60 espèces de parasites sont partagées entre les chiens et les humains, ce qui suggère que les chiens pourraient être une source d’infection pour les humains par ces parasites3. Toxocara canis et Ancylostoma caninum sont deux espèces parasites qui infectent les chiens et, accidentellement, les hôtes humains. Actuellement, il existe plusieurs études sur les endroits où ces helminthes sont capables de survivre et de se reproduire au Mexique. La prévalence de Toxocara chez les chiens varie de 0 % à plus de 87 % aux États-Unis, au Mexique, en Amérique centrale et dans les Caraïbes4. Toxocara canis et Ancylostoma spp., ainsi que d’autres espèces parasites chez les chiens, ont déjà été signalés au Mexique 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (tableau 1).
| Espèces parasites | Région | Prévalence (%) | Référence |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Le Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Oocystes coccidiens | Le Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocephalides | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Le Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Le Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Le Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Ténias | Basse-Californie | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Le Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Le Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Le Yucatán | 9.8 – 34 |
Tableau 1 : Prévalence régionale (%) des parasites canins au Mexique de 2001 à 2020. Les résultats d’enquêtes antérieures menées de 2001 à 2020 ont permis d’identifier la distribution des parasites canins dans plusieurs milieux urbains et ruraux au Mexique. Ces études permettent de comprendre en profondeur les éléments épidémiologiques propices à la persistance des parasites canins dans différents écosystèmes, contribuant ainsi à une évaluation complète de l’impact zoonotique de certaines espèces parasitaires.
Les stades du cycle de vie des parasites intestinaux, tels que les œufs, les kystes, les oocystes ou les larves, peuvent être trouvés dans les échantillons de selles. Ainsi, l’examen des matières fécales fournit des informations précieuses sur les parasites d’un animal. Le besoin d’une méthode pour détecter les œufs d’Ancylostomidae dans les excréments humains a conduit à l’utilisation du simple frottis fécal en 1878, qui a été utilisé pendant de nombreuses années pour détecter les parasites gastro-intestinaux mais était considéré comme peu sensible. Ainsi, le besoin s’est fait sentir de développer de meilleures méthodes copromicroscopiques14. Plus de 100 ans se sont écoulés depuis que la technique de flottation pour récupérer et compter les œufs de parasites dans les échantillons fécaux a été décrite pour la première fois15. Depuis lors, plusieurs méthodes et variantes de la technique de flottation ont été considérées comme un standard pour la détection de certains parasites chez leurs hôtes.
Par exemple, Lane a décrit en 1924 une méthode impliquant la technique de flottation centrifuge directe, qui intègre la centrifugation suivie de la flottaison du sédiment dans une solution saturée de chlorure de sodium avec SpG 1,2 dans 1 g (Lane) ou 10 g (modification de Stoll). La technique de flottation a ensuite été modifiée en utilisant des solutions avec différents SpG14. En 1939, Gordon et Whitlock ont signalé les inconvénients de la technique de Stoll en raison de l’interférence des détritus dans la visualisation des œufs de parasites et ont développé la méthode quantitative connue sous le nom de McMaster16. En 1979, O’Grady et Slocombe ont démontré que la densité de la solution, le moment et la taille des mailles des crépines affectent la précision de la détection des œufs à l’aide de la technique de flottation17. Au cours des dernières décennies, plusieurs modifications ayant été apportées à la technique de flottation, il est urgent de normaliser les méthodes de flottation. Actuellement, la détection des helminthes canins dans le cadre de la prévention des parasites zoonotiques est nécessaire pour appliquer des traitements anthelminthiques appropriés afin de limiter la contamination de l’environnement par les stades infectieux des nématodes zoonotiques18.
Parmi les méthodes qualitatives, la technique de flottation fécale est largement utilisée et acceptée car elle ne nécessite pas beaucoup d’équipement, est simple, peu coûteuse et reproductible ; Pourtant, il présente un inconvénient majeur en ce sens qu’il manque de sensibilité lorsque l’intensité de l’infection est faible19. La capacité à révéler la présence d’un plus grand nombre d’éléments parasites tels que des œufs, des oocystes, des kystes ou des larves de nématodes est généralement déterminée par la densité de la solution20.
Des rapports antérieurs ont comparé les techniques coproparasitologiques pour la détection des œufs de nématodes canins. En ce qui concerne la détection des protozoaires mobiles, des frottis fécaux directs sont utilisés ; tandis que les méthodes de sédimentation sont utiles pour diagnostiquer les œufs lourds de parasites tels que les trématodes21. L’un des tests de diagnostic sur le terrain les plus utilisés est la méthode du frottis fécal. Cependant, le faible niveau de sensibilité de cette technique peut être attribué au fait qu’elle contient des débris qui interfèrent avec la détection des œufs de parasites. En incorporant une étape de tamisage avec des solutions qui fournissent la bonne SpG, la méthode de flottation offre une observation plus claire et moins encombrée des œufs d’ascarides et d’ankylostomes. Cela conduit à un processus plus précis et plus efficace pour le criblage microscopique22. De même, les techniques simples de flottation et de flottation centrifuge directe sont très couramment utilisées pour récupérer les œufs et les oocystes de parasites14. Les méthodes de flottation classiques peuvent être considérées comme qualitatives ou quantitatives selon l’utilisation d’une chambre de comptage telle que la méthode McMaster15. Néanmoins, comme la technique de flottation a une faible sensibilité et se concentre sur la détection des parasites pendant la période du brevet, les résultats négatifs ne doivent pas être considérés comme concluants. Cependant, la précision ne dépend pas seulement de la procédure de conservation des échantillons fécaux ou de la SpG des solutions de flottation, mais aussi de la compétence technique et de l’expérience de l’utilisateur dans la réalisation d’examens fécaux.
Par conséquent, d’autres méthodes ont été explorées pour la détection des parasites canins dans les matières fécales. Il est généralement reconnu que l’une des approches les plus utilisées pour le diagnostic des helminthes intestinaux chez le chien est la technique FLOTAC, une méthode polyvalente, sensible et précise qui donne des résultats précis et fiables pour le diagnostic d’A. caninum chez le chien par rapport à un protocole de flottaison en tube et à la technique McMaster19, 23. Les méthodes de sédimentation sont utiles pour récupérer les œufs de douve, les œufs de nématodes embryonnés et la plupart des œufs de ténia, qui ne peuvent pas être récupérés à la surface d’une solution de flottation car ces structures ne flottent pas24. Une méthode qui s’est avérée supérieure aux techniques de flottation/sédimentation est la méthode de flottation double centrifuge modifiée, car elle permet de détecter les œufs de cestodes dans les matières fécales, prend moins de temps, sépare les œufs d’Anoplocephala des débris fécaux et diminue la cristallisation25. De plus, cette technique a été utilisée avec succès pour détecter les œufs d’ascarides avec une grande sensibilité26. Pourtant, certaines de ces techniques et méthodes centrifuges telles que l’Ovassay, par opposition au protocole de flottation que nous proposons dans cette étude, nécessitent la conservation des échantillons dans des réactifs tels que le formol, des kits commerciaux, le traitement des échantillons dans des conditions de laboratoire et l’utilisation de réactifs tels que le sulfate de zinc27 qui sont coûteux et nécessitent des procédures d’élimination spéciales pour éviter la toxicité environnementale.
L’utilisation de techniques qui augmentent la sensibilité de la méthode de flottation en ajoutant des solutions à forte SpG a été favorisée récemment. Cependant, il faut considérer que l’inconvénient de ces solutions est l’augmentation des débris dans la préparation finale et donc la détection imprécise des œufs de parasites. De plus, la disponibilité commerciale des matériaux, des réactifs, le coût, les problèmes d’impact environnemental et la difficulté d’utilisation des méthodes centrifuges affectent le choix d’une technique de flottation14, qui peut être difficile dans des conditions de terrain contrairement au protocole que nous présentons dans ce travail. La préparation des solutions de flottation avec du sel de table est avantageuse par rapport à l’utilisation du sucre car, dans des conditions de terrain, le sucre attire les insectes tels que les guêpes et les abeilles et les préparations deviennent collantes. De plus, des solutions telles que le phénol, qui est ajouté aux solutions sucrées pour éviter l’adhérence, ou le ZnSO4sont complexes à éliminer correctement conformément aux directives de protection de l’environnement et ne peuvent pas être éliminées sur le terrain ; contrairement à une solution de sel de table.
L’objectif de ce manuscrit est de démontrer les étapes de détection des œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp. dans des échantillons fécaux en utilisant une adaptation de la technique de flottation simple dans des conditions de terrain et de laboratoire. En suivant le protocole décrit ci-dessous et en utilisant un microscope avec une batterie de secours, le diagnostic de ces parasites zoonotiques canins dans les zones rurales et périurbaines est possible lorsqu’aucun équipement et infrastructure de laboratoire n’est disponible. La méthode de flottation simple décrite dans ce travail peut fournir des résultats rapides et constitue une technique non invasive et rentable pour le dépistage de routine.
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Protocol
L’utilisation et les soins des chiens ont été approuvés par l’Université nationale et autonome du Mexique.
1. Prélèvement d’échantillons fécaux
REMARQUE : Manipulez le chien avec l’aide d’un vétérinaire ou du propriétaire de l’animal.
- Dans le cas de chiens sauvages (figure 1A) ou d’animaux nerveux, prélevez des échantillons au sol juste après la défécation ou pas plus de 10 minutes plus tard.
- Lubrifiez les gants chirurgicaux ou les sacs en polyéthylène à paroi mince avec de l’eau ou de la vaseline. Pour prélever des échantillons fécaux dans le rectum, portez des gants chirurgicaux ou des sacs en polyéthylène à paroi mince.
- Prélevez au moins 2 g d’excréments de chaque chien (figure 1B).
- Identifiez les échantillons fécaux individuels comme suit : date, emplacement (coordonnées GPS à l’aide de Google Maps), attribution d’un numéro d’identification pour chaque animal, âge approximatif du chien, sexe du chien, race, chien d’intérieur ou d’extérieur (sauvage).
- Fermez les sacs contenant l’échantillon fécal avec un nœud serré. Conserver les sacs au réfrigérateur (4-8 °C) si les échantillons de selles ne sont pas analysés dans les 3-4 heures suivant le prélèvement.
2. Préparation d’une solution saline saturée pour le diagnostic sur le terrain
REMARQUE : Si l’accès à une balance, à du matériel de mesure, à des cuisinières ou à du gaz pour faire bouillir de l’eau est absent ou limité, la solution saline saturée peut être facilement préparée avec de l’eau, du sel de table ordinaire, une tasse en plastique de 12 oz (355 ml) et une bouteille vide en plastique de soda de 1 L.
- Lavez soigneusement une bouteille de soda vide de 1 L. Remplissez la bouteille avec 1 L d’eau.
- Remplissez un gobelet en plastique de 12 oz avec du sel de table ordinaire.
- Transférez le sel dans la bouteille de soda.
- Fermez hermétiquement la bouteille de soda avec le bouchon à vis. Agitez vigoureusement la solution jusqu’à ce que le sel ne se dissolve plus.
REMARQUE : Agiter la solution dans la bouteille de soda jusqu’à dissolution complète du sel peut prendre jusqu’à 90 minutes.
3. Préparation d’une solution saline saturée pour le diagnostic en laboratoire
- Pesez 420 g de sel de table ordinaire.
- Dissoudre 420 g de sel dans 1 L d’eau.
- Faire bouillir la solution jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sel.
- Filtrer la solution pour jeter le sel non dissous.
- Vérifier la concentration de la solution à l’aide d’un densitomètre ou d’un densitomètre à fluide lourd.
REMARQUE : La concentration idéale a un SpG de 1,20 pour obtenir de meilleurs résultats (Figure 2A). La capacité de flottaison d’un œuf est influencée par son interaction avec la solution, ce qui contribue à la capacité variable des œufs à flotter dans des solutions ayant la même densité spécifique. Par conséquent, pour obtenir une récupération optimale des œufs, il est essentiel de prendre en compte la plage supérieure de densité dans la solution de flottation, en veillant à ce qu’elle dépasse celle des éléments parasitaires ciblés6.
4. Méthode de flottation
REMARQUE : Si les échantillons fécaux sont trop secs ou durs, faites-les macérer dans un mortier.
- À l’aide d’une cuillère, placez environ 3 g d’excréments dans un gobelet en plastique (~8,5 cm de hauteur et ~5,5 cm de diamètre).
- Ajouter 1 mL de solution saline saturée jusqu’à l’obtention d’une pâte.
- Remuer pendant 1 min et ajouter 100 mL de solution saline saturée.
- Passez cette suspension dans une passoire en plastique dans un deuxième gobelet en plastique pour éviter les grosses particules (Figure 2B).
- Laissez la suspension reposer pendant 15-20 min.
- Placez une anse d’inoculation dans une flamme pendant 1 s pour vous assurer qu’elle est exempte d’œufs, de kystes ou d’oocystes (figure 2C).
- Attendez 5 s pour que la boucle d’inoculation refroidisse (figure 2D).
- Prélevez trois gouttes de la surface de la suspension avec la boucle d’inoculation. Placez chacune des trois gouttes séparément sur une lame de verre (figure 2E-G)
REMARQUE : assurez-vous que les gouttes ne sont pas en contact les unes avec les autres (Figure 2H). - Observez au microscope avec un objectif 10x (Figure 2I). Placez une lamelle si le grossissement est augmenté à 40x.
- Lorsqu’un résultat positif est observé dans la gouttelette, attribuez une croix (+) dans le journal de laboratoire pour enregistrer la présence de parasites pendant la période de brevet dans des sites aléatoires de la surface de suspension fécale.
5. Interprétation de la méthode de flottation
REMARQUE : Les résultats négatifs ne sont pas concluants.
- Effectuez une série de trois tests avec des échantillons de 3 jours consécutifs pour augmenter la sensibilité du test.
REMARQUE : Des résultats positifs indiquent la présence de parasites pendant la période du brevet.
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Representative Results
Dans ce travail, les procédures de collecte et de coproparasitoscopique pour l’identification de T. canis et d’Ancylostoma spp. sont décrites. La raison de l’adaptation de la méthode simple de flottation fécale pour détecter les œufs d’helminthes canins est que cette technique est rentable car les solutions, l’équipement et les matériaux sont peu coûteux. Par conséquent, la méthode a une grande capacité de manipulation des échantillons car plusieurs échantillons peuvent être traités en peu de temps. De plus, la méthode simple de flottation fécale est facile à réaliser et relativement sensible.
La taille de l’échantillon et le choix des animaux ont été faits par commodité, déterminés principalement par la volonté du propriétaire des animaux et la sécurité des chiens sauvages qui approchent. Dans le présent travail, la méthode de flottation a été utilisée pour évaluer les occurrences et les fréquences d’Ancylostoma spp. et de T. canis chez les chiens Canis lupus familiaris au Mexique pendant 4 ans à partir de 2017. Des échantillons fécaux de 1 638 chiens ont été prélevés et examinés au microscope. Au total, 1 235 chiens étaient positifs pour T. canis et Ancylostoma spp. L’un des objectifs de l’utilisation de la méthode de flottation était de démontrer son efficacité pour évaluer l’occurrence de Toxocara ou d’Ancylostoma, mais nous avons également cherché à mener un examen plus approfondi des facteurs qui pourraient avoir un impact sur leur prévalence. En conséquence, 185 animaux atteints d’infections mixtes ont été rejetés. Le nombre d’échantillons positifs pour Ancylostoma spp. était de 833 (fréquence de 78,95 %) et de 222 (21,04 %) pour T. canis. Sur les 1 050 échantillons, 75,5 % (793 échantillons) ont été traités et lus sur le terrain en préparant la solution de flottation avec une bouteille de soda et en utilisant un microscope avec 3 piles AA rechargeables de 1,2 V pour 4 h de fonctionnement continu. Les 257 échantillons fécaux restants ont été examinés en laboratoire.
L’un des objectifs de cette étude était d’utiliser une solution de flottation et une méthode sur le terrain pour accélérer et faciliter le diagnostic de deux helminthes parasites de chiens dans des zones où aucune infrastructure ou équipement de laboratoire n’est disponible. L’application sur le terrain de la méthode de flottation nous a permis de communiquer les résultats à 400 propriétaires immédiatement après chaque lecture microscopique afin de fournir des recommandations concernant les traitements anthelminthiques et les mesures préventives et ainsi, d’éviter la propagation du parasite chez l’homme ou les animaux de compagnie. De même, la technique de flottaison sur le terrain a permis d’examiner les chiens sauvages et de leur fournir un traitement anthelminthique à l’aide de friandises ou de nourriture. Les figures 3A et 3B montrent des œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp., respectivement, observés après l’application de la solution et de la technique de flottation sur le terrain. Lorsque des échantillons de selles fraîches ont été soumis à la méthode de flottation sur le terrain, la solution préparée dans une bouteille de soda était capable de mettre en flottation des œufs d’helminthes. La production de cristaux de sel et de bulles d’air a été comparée aux échantillons lus en laboratoire et aucune différence n’a été détectée par l’opérateur. Cette observation est encourageante et remet en question la connaissance selon laquelle la concentration des échantillons fécaux garantit une lecture microscopique plus précise.
Lorsque la solution de flottation et les échantillons de selles ont été traités en laboratoire, aucune différence n’a été perçue en ce qui concerne la morphologie et la clarté des lectures au microscope, car la même quantité de débris flottait simultanément dans la détection copromicroscopique des parasites sur le terrain et en laboratoire. Les figures 3A, B montrent les œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp., respectivement, récupérés sur les 257 échantillons qui ont été traités dans un laboratoire entièrement équipé après le transport des échantillons des zones urbaines, suburbaines et rurales. Ces œufs de parasites ne différaient pas morphologiquement de ceux observés sur le terrain (figure 3C).
Ce protocole a généré un nombre suffisant de résultats pour évaluer l’influence de l’emplacement, de la saison de l’année, du sexe, de la race, de l’âge et des conditions extérieures ou intérieures sur la prévalence de T. canis et d’Ancylostoma spp. Les données de prévalence ont été comparées à l’aide du test ANOVA avec une valeur de signification de 0,05. Le tableau 2 montre que T. canis présentait une fréquence de distribution significativement plus élevée dans les climats tempérés et secs que dans les États caractérisés par des climats chauds, alors qu’il n’y avait pas de variation notable dans la prévalence d’Ancylostoma spp. dans les régions à prédominance de climats chauds, tempérés ou secs. De même, Ancylostoma spp. et T. canis sont le plus souvent détectés en été. Il a été constaté que 60,86 % des hommes étaient positifs pour l’ancylostomiase et 37,38 % pour la toxocarose. De plus, T. canis a été plus fréquemment détecté chez les chiots de moins de 6 mois ; tandis qu’Ancylostoma spp. a été plus diagnostiqué chez les chiens adultes. Il est intéressant de noter qu’aucune différence n’a été trouvée entre les races de chiens. L’ankylostome du chien a infecté 65,54 % des chiens d’extérieur ; cependant, T. canis a également été détecté chez les chiens ayant un statut extérieur ou intérieur.
Figure 1 : Prélèvement d’échantillons de selles chez les chiens. (A) Il faut faire preuve de prudence lors du prélèvement d’échantillons de selles de chiens sauvages. Dans la mesure du possible, les matières fécales fraîches doivent être recueillies et conservées dans un sac en plastique pour soumission et analyse coproparasitoscopique en laboratoire. Les échantillons doivent être réfrigérés à 4 °C et placés dans des boîtes en polystyrène ou des enveloppes métalliques isolées dans les 24 heures suivant le prélèvement. (B) Trois grammes d’excréments sont recommandés comme norme ; par conséquent, 2 à 5 g est raisonnable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation d’une solution saline saturée et traitement de la suspension fécale pour la microscopie. (A) La densité idéale d’une solution saturée à base de sel doit être supérieure à 1,20. Il est fortement recommandé de vérifier qu’il n’y a pas de cristaux au fond et que la solution est transparente. (B) Le passage de la suspension fécale à travers une crépine en plastique élimine les grosses particules. (C) L’anse d’inoculation doit être exposée à une flamme (un brûleur de laboratoire ou un briquet portatif ordinaire) pour s’assurer qu’elle est exempte de contamination. (D) Laisser refroidir la boucle d’inoculation et prélever trois gouttes de différents sites à la surface de la suspension. (E) Après avoir placé la première gouttelette sur la lame de verre, évitez de déplacer la lame pour réduire le déversement de la gouttelette. La lame de verre fournit une plate-forme fine et transparente qui permet l’observation des échantillons. (F) Placez la deuxième gouttelette au milieu de la lame de verre. Prendre une deuxième goutte de la surface de la suspension fécale augmente la probabilité de trouver des œufs dans une suspension où les structures parasites peuvent avoir été inégalement réparties. (G) Placez la troisième gouttelette sur la lame de verre. Une troisième goutte de la surface de la suspension fécale permettra d’observer une autre zone où les œufs flottants ont pu se concentrer. (H) Les trois gouttes sont observées séparément sur la lame de verre pour détecter les œufs de nématodes à différentes zones de la surface de la suspension fécale. (I) Observez l’échantillon au microscope à l’aide de l’objectif 10x. Si l’objectif est changé à 40x, placez une lamelle sur les gouttelettes de suspension fécale. Lorsqu’un résultat positif est observé dans la gouttelette, attribuer une croix (+) pour marquer la présence de parasites pendant la période de brevet dans des sites aléatoires de la surface de suspension fécale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Œufs de Toxocara canis et d’Ancylostoma spp. détectés par microscopie optique avec un grossissement de 40x. (A) Œufs de Toxocara canis détectés par microscopie optique avec un grossissement de 40x. La méthode de flottation a permis de visualiser des champs microscopiques propres exempts de matériaux grossiers (collectés sur le terrain). Quelle que soit la méthode de préparation de la solution de flottation, les œufs étaient visibles et principalement observés sans altérations morphologiques. (B) Œufs d’Ancylostoma spp. détectés par microscopie optique avec un grossissement de 40x. Même si aucune concentration de matières fécales n’a été effectuée (sur le terrain), la méthode de flottaison simple a permis de remédier aux lacunes de la détection morphologique des œufs dans les matières fécales lorsque la procédure a été effectuée selon la présente méthode. (C) Œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp. détectés par microscopie optique à l’aide d’un grossissement de 40x. Les caractéristiques morphologiques de ces œufs (prélevés en laboratoire) étaient claires même si aucune concentration d’échantillons de selles n’a été effectuée et ne différaient pas des ovules prélevés sur le terrain. Barres d’échelle = 75 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Climat | Climat chaud | 38,66a | 22,52a |
| Climat sec | 29.41a | 36.03a | |
| Climat tempéré | 31,93a | 41,44b | |
| Source | 23,76a | 19.81a | |
| Été | 49,81b | 50,00b | |
| Automne | 17.52a | 20.27a | |
| Hiver | 8,88°C | 9,90°C | |
| Genre | Mâle | 60,86A | 62.61a |
| Femelle | 39,13b | 37,38milliards | |
| Âge | 0-3 mois | 18,72a | 51,80A |
| 3-6 mois | 15.48a | 32,43b | |
| > 6 mois | 22.44a | 10,36°C | |
| > 1 an | 43,33b | 5,40°C | |
| Race | Mâtiné | 52,78a | 55,86a |
| De race | 47.22a | 44.14a | |
| Statut du logement | Intérieur | 34.45a | 52.25a |
| Extérieur | 65.54a | 47,74b |
Tableau 2 : Prévalence (%) d’Ancylostoma spp. et de Toxocara canis chez les chiens au Mexique pendant 4 ans selon le climat, la saison, le sexe, l’âge, la race et le statut de logement. Les indications des données révèlent qu’il n’y a pas de variation significative dans la prévalence d’Ancylostoma spp. dans les régions caractérisées par des climats chauds, tempérés ou secs. En revanche, T. canis présente une prévalence nettement plus élevée dans les climats tempérés et secs que dans les climats chauds. De plus, Ancylostoma spp. et T. canis sont le plus souvent identifiés pendant la saison estivale. L’analyse des données démontre en outre que 60,86 % des chiens mâles ont été testés positifs pour l’ancylostomiase, tandis que 37,38 % ont été testés positifs pour la toxocarose. De plus, T. canis est plus fréquemment détecté chez les chiots âgés de moins de 6 mois, tandis qu’Ancylostoma spp. est plus répandu chez les chiens adultes. Il est intéressant de noter qu’aucune différence perceptible n’a été observée entre les différentes races de chiens. Les résultats indiquent que 65,54 % des chiens d’extérieur sont infectés par l’ankylostome du chien, tandis que T. canis est également répandu chez les chiens d’intérieur et d’extérieur. *Les valeurs moyennes dans une colonne du facteur (climat, saison, sexe, âge, race et logement) suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes à P < 0,05 selon le test ANOVA.
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Discussion
Les nématodes tels que T. canis et Ancylostoma spp. peuvent habiter l’intestin grêle des chiens et peuvent être transmis aux humains. Les signes cliniques causés par T. canis sont graves chez les jeunes chiens, se manifestant par une mauvaise croissance, des problèmes respiratoires ou des lésions du tube digestif28. Chez les chiens adultes, l’infection a généralement tendance à être bénigne. Le diagnostic repose sur l’identification d’œufs caractéristiques dans un échantillon fécal. Cette affection est une cause fréquente de prescription d’un traitement anthelminthique aux chiens29. Pour comprendre l’épidémiologie de Toxocara, il est essentiel de reconnaître que le parasite peut se transmettre de la mère au chiot à la fois par le placenta avant la naissance et par l’allaitement sous forme d’infection galactogène peu après la mise bas. Les humains peuvent contracter T. canis lors de l’ingestion d’œufs infectieux, ce qui peut se produire par divers moyens tels que le sol contaminé ou la fourrure d’un chien infecté. Dans ce cas, les humains servent d’hôtes paraténiques, et bien qu’il n’y ait pas de reproduction parasitaire, les larves libérées par les œufs peuvent potentiellement causer des dommages, en particulier dans le cas des enfants30.
L’infection par l’ankylostome Ancylostoma spp. chez le chien se produit lorsque les animaux ingèrent les larves ou lorsque les larves pénètrent dans la peau. Les chiots peuvent contracter l’infection en consommant un hôte paraténique ou par la voie lactogénique31. Les ankylostomes matures se nourrissent de sang, ce qui peut entraîner une anémie sévère et des symptômes gastro-intestinaux, en particulier chez les jeunes chiens. Les infections qui surviennent à travers la peau entraînent une dermatite, qui se résout généralement environ une semaine après le début de l’infection. Divers médicaments anthelminthiques ont été utilisés, accompagnés d’un traitement de soutien. Cependant, des cas de résistance aux anthelminthiques ont été signalés. L’ancylostome a le potentiel d’être pathogène pour l’homme. La transmission transcutanée des larves L3 peut entraîner une affection connue sous le nom de larva migrans cutanée. Ces lésions disparaissent généralement sans traitement en quelques mois. Dans de rares cas, les ankylostomes canins peuvent migrer dans le tractus gastro-intestinal humain, induisant une entérite éosinophile30.
Le diagnostic précis, économique et rapide de la parasitose chez le chien est essentiel pour accroître nos connaissances épidémiologiques sur les helminthiases canines. Pour cette raison, nous avons adapté un protocole de la technique de flottaison simple à utiliser sur le terrain pour détecter T. canis et Ancylostoma spp. Un problème pertinent rencontré dans le protocole actuel était la collecte d’échantillons de chiens sauvages, car ces animaux sont généralement difficiles à manipuler. Par conséquent, l’échantillonnage a été effectué en observant et en suivant les chiens jusqu’à ce qu’ils défèquent, ce qui rend la méthode d’échantillonnage longue, difficile et en quelque sorte dangereuse. D’après notre expérience, nous recommandons fortement d’évaluer les études parasitologiques chez les chiens de refuge.
En ce qui concerne le prélèvement d’œufs d’helminthes zoonotiques, la coproscopie qualitative continue d’être la méthodologie couramment utilisée dans le laboratoire de parasitologie à des fins de diagnostic1. Des études antérieures ont montré que la technique de flottation utilisant une solution saline saturée est plus fiable que la microscopie directe. Par exemple, Dryden et ses collaborateurs ont déterminé une sensibilité de 95,15 % pour les œufs d’Ancylostoma spp. dans 206 échantillons fécaux traités par la technique de flottation et de 27,18 % par microscopie directe32. Il est admis que la densité de la solution de flottation est un facteur critique pour la méthode de flottation 14,20,23. Dans les solutions qui n’atteignent pas cette densité, les formes parasites mettent plus de temps à flotter ou ne flottent jamais. Lorsqu’une solution de flottation est sursaturée, elle cristallise en quelques minutes et même plus tôt si une lamelle est placée20.
Le choix de la solution de flottation dans ce protocole a été basé sur la facilité de préparation, la commodité, le coût et l’impact environnemental. Même si la solution sucrée prend plus de temps à cristalliser, du formol ou du phénol doit être ajouté comme conservateur et diminuer la sensation collante ou collante ; ce qui est un inconvénient dans les conditions de terrain qui prévalaient dans cette étude. De plus, l’élimination des réactifs chimiques est une question complexe en raison des réglementations environnementales. Les données de cette étude ont démontré que la solution saturée préparée avec du sel de table commun dans des conditions de terrain en utilisant une bouteille de soda en raison du manque d’équipement de laboratoire pour préparer et faire bouillir une solution de flottation, était aussi efficace que celle préparée en laboratoire. La seule différence perceptible est le temps qu’il faut pour secouer la bouteille de soda jusqu’à ce qu’une solution transparente soit visible. Les observations microscopiques étaient également propres pour l’échantillon préparé à l’aide des deux méthodes pour préparer la solution saturée. Il est important d’effectuer plus d’études à l’avenir avec un plus grand nombre d’échantillons pour confirmer l’affirmation susmentionnée. Pourtant, cela prend du temps et nécessite l’effort physique de secouer la solution à l’intérieur du flacon pendant des heures. Une autre étape critique du protocole consiste à laisser reposer la suspension fécale pendant au moins 15 minutes pour permettre aux œufs de flotter et de se concentrer à la surface. Cependant, plus le temps de repos est long, plus les débris flotteront et après quelques heures, les œufs se déformeront ou se casseront. Considérant que la sensibilité et la spécificité des méthodes coproparasitoscopiques sont faibles et que la précision de ces méthodes en tant que tests de diagnostic dépend des compétences de l’utilisateur, dans la présente étude, des parasitologues formés et expérimentés ont effectué la technique de flottation et identifié les parasites.
Cette étude, à notre connaissance, est la première à estimer la prévalence d’Ancylostoma spp. et de T. canis chez les chiens au Mexique en utilisant des échantillons fécaux examinés avec la méthode de flottation simple sur le terrain. Il a été démontré que la technique de flottation que nous avons utilisée, malgré les décennies où elle est utilisée, est toujours un test de diagnostic très efficace, économique et rapide14. Malgré cela, il existe des techniques coproparasitoscopiques avec une sensibilité et une spécificité plus élevées que celle que nous avons utilisée pour le diagnostic des helminthes canins ; comme la concentration de sédimentation, comme c’est le cas de la technique de Faust. De plus, il est important de noter que Faust, qui est une méthode de concentration, s’est également avérée plus efficace dans la détection de protozoaires tels que Giardia33. Néanmoins, la méthode coproparasitoscopique que nous avons choisie pour cette étude présentait plusieurs avantages tels que le coût. La technique de Faust est plus coûteuse que la flottation avec une solution saturée de solution saline car elle nécessite un équipement supplémentaire et coûteux tel qu’une centrifugeuse. D’autres méthodes de concentration telles que celles utilisant des réactifs tels que le sulfate de zinc sont plus coûteuses que le sel ordinaire et nécessitent plus de temps en raison du nombre de lavages requis dans la centrifugeuse. Par conséquent, la technique de Faust est limitée pour son utilisation dans le travail sur le terrain où aucun accès à une centrifugeuse n’est courant.
Plus important encore, une limite de la technique de flottaison simple est qu’elle n’est pas assez sensible pour détecter les oocystes de Cryptosporidium , les kystes de Giardia ou les œufs de Trichuris . Des techniques utilisant des procédures de centrifugation pour concentrer les formes parasitaires doivent donc être utilisées si le diagnostic de ces espèces est prévu. Il est important de souligner que les taux de positivité des genres rapportés dans cette étude ne doivent pas être considérés comme concluants car une méthode de commodité a été utilisée comme stratégie d’échantillonnage. Il est important de noter qu’il peut y avoir des situations, comme dans les refuges où la gestion des animaux est difficile, où il devient crucial d’identifier les parasites helminthes chez les chiens. Par conséquent, ce protocole pourrait devoir être modifié à l’avenir pour permettre la collecte d’échantillons combinés.
Comme point faible, il convient de noter que la méthode de flottation simple et la préparation de la solution saturée de NaCl ont été développées dans un but spécifique - examiner les excréments de chien dans des conditions principalement sur le terrain - mais la sensibilité de la procédure de flottation simple a généralement été considérée comme faible. Par conséquent, pour détecter les kystes ou les œufs d’espèces parasitaires plus lourdes, l’utilisation d’une technique de concentration est fortement suggérée. Compte tenu de la faible sensibilité de la méthode de flottation simple, qu’elle soit pratiquée sur le terrain ou en laboratoire, il était raisonnable de douter que cette technique soit utile comme méthode de choix pour les études épidémiologiques des helminthes canins. Néanmoins, la forte prévalence d’Ancylostoma spp. chez les chiens dans cette étude et la détection d’œufs de T. canis indiquent que la méthode de flottaison simple, qu’elle soit effectuée sur le terrain ou en laboratoire, est utile pour fournir des preuves qui pourraient soutenir d’autres études épidémiologiques et proposer des mesures de contrôle et de prévention pour réduire l’infection des chiens et des humains par ces nématodes.
En utilisant la méthode de flottation simple, nous avons analysé les facteurs affectant la récupération des œufs de T. canis et d’Ancylostoma spp. dans les excréments canins. Les résultats de T. canis étaient en accord avec les dernières recherches qui indiquent que les parasites sont nettement plus répandus dans les régions tempérées et tropicales. Cela correspond à des études antérieures qui ont examiné comment les facteurs environnementaux, en particulier la température et les précipitations, influencent l’aire de répartition écologique des espèces parasitaires 34,35,36. Les résultats actuels ont montré que les deux helminthes infectent les mâles dans une proportion significativement plus élevée. Il est raisonnable de supposer que cette découverte est due au fait que les hommes sont immunologiquement moins réactifs aux infections37,38. L’âge influence la prévalence de T. canis car les chiots étaient plus touchés par ce parasite. Cette découverte s’aligne sur des recherches antérieures indiquant que ce parasite a tendance à avoir un impact plus important sur les chiots, tandis que les adultes développent une résistance accrue, ce qui réduit la probabilité d’infection 6,39. Les chiens croisés et de race pure ont montré des prévalences comparables de Toxocara canis et d’Ancylostoma spp. Cependant, les chiens sauvages présentaient une prévalence plus élevée d’Ancylostoma spp. par rapport aux chiens résidant en milieu domestique. Cette constatation est en désaccord avec les rapports précédents qui n’ont pas détecté de différences entre les races de chiens6. On peut conclure que les applications futures de la préparation de la solution saline saturée et de la méthode de flottation simple utilisée dans ce protocole peuvent être effectuées pour des examens fécaux de routine sur le terrain ou en laboratoire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de l’Universidad Nacional Autónoma de México d’avoir fourni les ressources financières par le biais de la subvention PAPIIT IN218720 et le Dr Claudia Mendoza d’avoir accordé la prolongation demandée. Cette œuvre est dédiée à ma charmante Nicole, décédée en 2019. Tu vivras toujours dans mon cœur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
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