Summary
Este trabalho descreve o uso de um método de flutuação para identificar Toxocara canis e Ancylostoma spp., detectados em amostras fecais coletadas de cães no México de 2017 a 2021 em condições de campo.
Abstract
O diagnóstico de parasitas caninos com potencial zoonótico como Toxocara canis e Ancylostoma caninum em condições de campo é geralmente difícil devido ao acesso limitado a um laboratório em áreas rurais e suburbanas no México. Este estudo teve como objetivo detectar T. canis e Ancylostoma spp em amostras fecais coletadas de cães no México de 2017 a 2021 em condições de campo. O cálculo do tamanho da amostra resultou em uma meta de inscrição de 534 cães em todo o país.
As amostras foram coletadas diretamente do reto ou do solo após a defecação. As amostras foram armazenadas em sacos plásticos individuais, hermeticamente fechados, a 4 °C. Uma solução saturada de cloreto de sódio (gravidade específica [SpG] 1,20) foi preparada em condições de campo e laboratório. Dentro de 3 dias após a coleta, 2-4 g de fezes foram testadas para parasitas usando um método de flutuação, suspendendo cada amostra fecal em uma solução salina. As fezes foram misturadas com a solução de flutuação e trituradas com uma colher de metal.
Uma vez obtida uma consistência uniforme, a amostra fecal foi vertida em um novo copo plástico usando uma peneira e deixada descansar por 10-15 min. Três gotas do topo da mistura foram coletadas usando uma alça de inoculação esterilizada. As lâminas foram colocadas no microscópio e os parasitos foram identificados por parasitologistas treinados. Amostras fecais de 1.055 cães foram triadas microscopicamente. O número de amostras positivas para Ancylostoma spp foi de 833 (78,95% de frequência) e 222 (21,04%) para T. canis. Estes resultados ilustram a importância da identificação de helmintos zoonóticos em cães que vivem em áreas urbanas e rurais no México usando uma técnica coproparasitoscópica em laboratório e em condições de campo.
Introduction
As parasitoses gastrintestinais são um dos problemas de saúde mais comuns que acometem cães1. Estimativas sugerem que existem ~700 milhões de cães domésticos em todo o mundo, e aproximadamente 175 milhões podem ser categorizados como free-roaming2. Mais de 60 espécies de parasitas são compartilhadas entre cães e humanos, sugerindo que os cães podem ser uma fonte de infecção para humanos com esses parasitas3. Toxocara canis e Ancylostoma caninum são duas espécies parasitas que infectam cães e, acidentalmente, hospedeiros humanos. Atualmente, existem vários estudos sobre os locais onde esses helmintos são capazes de sobreviver e se reproduzir no México. A prevalência de Toxocara em cães varia de 0% a mais de 87% nos Estados Unidos, México, América Central e Caribe4. Toxocara canis e Ancylostoma spp., assim como outras espécies parasitárias em cães, foram previamente relatadas no México 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabela 1).
| Espécies parasitárias | Região | Prevalência (%) | Referência |
| Ancilostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Oocistos coccidianos | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocefalias | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Tapeworms | Baixa Califórnia | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabela 1: Prevalência regional (%) de parasitas de cães no México de 2001 a 2020. Os resultados de investigações anteriores conduzidas de 2001 a 2020 permitiram a identificação da distribuição de parasitas caninos em vários ambientes urbanos e rurais no México. Estes estudos fornecem uma compreensão profunda dos elementos epidemiológicos favoráveis à persistência de parasitas caninos em diferentes ecossistemas, contribuindo para uma avaliação abrangente do impacto zoonótico de algumas espécies de parasitos.
Estágios do ciclo de vida de parasitas intestinais, como ovos, cistos, oocistos ou larvas podem ser encontrados em amostras de fezes. Assim, o exame do material fecal fornece informações valiosas sobre os parasitas de um animal. A necessidade de um método para detectar ovos de Ancylostomidae em fezes humanas levou ao uso do esfregaço fecal simples em 1878, que foi usado por muitos anos para detectar parasitas gastrintestinais, mas foi considerado pouco sensível. Assim, surgiu a necessidade de desenvolver melhores métodos copromicroscópicos14. Mais de 100 anos se passaram desde que a técnica de flotação para recuperação e contagem de ovos de parasitas em amostras fecais foi descrita pela primeira vez15. Desde então, vários métodos e variantes da técnica de flotação têm sido considerados um padrão para a detecção de alguns parasitas em seus hospedeiros.
Por exemplo, Lane descreveu um método em 1924 envolvendo a técnica de flotação centrífuga direta, que integra centrifugação seguida de flutuação do sedimento em uma solução saturada de cloreto de sódio com SpG 1,2 em 1 g (Lane) ou 10 g (modificação de Stoll). A técnica de flotação foi posteriormente modificada utilizando-se soluções com diferentes SpG14. Em 1939, Gordon e Whitlock relataram as desvantagens da técnica de Stoll devido à interferência de detritos na visualização de ovos de parasitas e desenvolveram o método quantitativo conhecido como McMaster16. Em 1979, O'Grady e Slocombe demonstraram que a gravidade específica da solução, o tempo e as malhas dos filtros afetam a precisão da detecção de ovos pela técnica de flotação17. Durante as últimas décadas, devido a várias modificações que foram feitas na técnica de flotação, há uma necessidade urgente de padronização dos métodos de flotação. Atualmente, a detecção de helmintos caninos no contexto da prevenção de parasitas zoonóticos é necessária para a aplicação de tratamentos anti-helmínticos apropriados para limitar a contaminação ambiental com estágios infecciosos de nematoides zoonóticos18.
Dentre os métodos qualitativos, a técnica de flutuação fecal é amplamente utilizada e aceita por não necessitar de muitos equipamentos, ser simples, barata e reprodutível; no entanto, tem uma grande desvantagem na falta de sensibilidade quando a intensidade da infecção é baixa19. A capacidade de revelar a presença de um maior número de elementos parasitários, como ovos, oocistos, cistos ou larvas de nematoides, é geralmente determinada pela densidade da solução20.
Relatos prévios compararam técnicas coproparasitológicas para a detecção de ovos de nematoides caninos. Com relação à detecção de protozoários móveis, são utilizados esfregaços fecais diretos; enquanto os métodos de sedimentação são úteis para diagnosticar ovos pesados de parasitas como trematódeos21. Um dos testes diagnósticos de campo mais utilizados é o esfregaço fecal. No entanto, o baixo nível de sensibilidade dessa técnica pode ser atribuído ao fato de conter detritos que interferem na detecção de ovos do parasita. Ao incorporar uma etapa de peneiramento juntamente com soluções que fornecem a SpG adequada, o método de flotação oferece uma observação mais clara e menos desordenada dos ovos de ascarida e ancilostomíase. Isso leva a um processo mais preciso e eficiente para o rastreamento microscópico22. Da mesma forma, técnicas de flotação simples e centrífuga direta são muito comumente utilizadas para recuperar ovos e oocistos doparasita14. Os métodos clássicos de flotação podem ser considerados qualitativos ou quantitativos dependendo do uso de uma câmara de contagem como o método de McMaster15. No entanto, como a técnica de flotação tem baixa sensibilidade e se concentra na detecção de parasitas no período de patente, resultados negativos não devem ser considerados conclusivos. No entanto, a precisão não depende apenas do procedimento de preservação de amostras fecais ou do SpG das soluções de flotação, mas também depende da proficiência técnica e experiência na realização de exames fecais do usuário.
Consequentemente, outros métodos têm sido explorados para a detecção de parasitas caninos nas fezes. Tem sido geralmente reconhecido que uma das abordagens mais utilizadas para o diagnóstico de helmintos intestinais em cães é a técnica FLOTAC, um método multivalente, sensível e acurado que produz resultados precisos e confiáveis para o diagnóstico de A. caninum em cães quando comparado a um protocolo de flutuação em tubo e à técnica de McMaster19, 23º. Os métodos de sedimentação são úteis para a recuperação de ovos de fluke, ovos embrionados de nematoides e a maioria dos ovos de tênia, que não podem ser recuperados na superfície de uma solução de flutuação porque essas estruturas não flutuam24. Um método que tem se mostrado superior às técnicas de flotação/sedimentação é o método de Flotação Centrífuga Dupla Modificada, pois permite a detecção de ovos de cestoide nas fezes, é menos demorado, separa ovos de Anoplocephala de detritos fecais e diminui a cristalização25. Além disso, essa técnica tem sido utilizada com sucesso para detectar ovos de ascarid com altasensibilidade26. No entanto, algumas dessas técnicas e métodos centrífugos mencionados, como o Ovassay, ao contrário do protocolo de flotação que propomos neste estudo, requerem a preservação da amostra em reagentes como formalina, kits comerciais, processamento de amostras em condições de laboratório e o uso de reagentes como o sulfato de zinco27, que são caros e requerem procedimentos especiais de descarte para evitar toxicidade ambiental.
O uso de técnicas que aumentem a sensibilidade do método de flotação pela adição de soluções com alta SpG tem sido favorecido recentemente. No entanto, deve-se considerar que a desvantagem dessas soluções é o aumento de detritos no preparo final e, consequentemente, a detecção imprecisa de ovos do parasita. Além disso, a disponibilidade comercial de materiais, reagentes, custo, questões de impacto ambiental e dificuldade de uso de métodos centrífugos afetam a seleção de uma técnica de flotação14, o que pode ser desafiador em condições de campo em contraste com o protocolo que apresentamos neste trabalho. O preparo das soluções de flotação com sal de cozinha é vantajoso em relação à utilização do açúcar, pois, em condições de campo, o açúcar atrai insetos como vespas e abelhas e as preparações tornam-se pegajosas. Além disso, soluções como fenol, que é adicionado a soluções de açúcar para evitar aderência, ou ZnSO4são complexas de descartar corretamente de acordo com as diretrizes de proteção ambiental e não podem ser descartadas no campo; ao contrário de uma solução de sal de cozinha.
O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos para a detecção de ovos de T. canis e Ancylostoma spp., em amostras fecais, utilizando uma adaptação da técnica de flutuação simples em condições de campo e laboratório. Seguindo o protocolo aqui descrito e utilizando um microscópio com bateria reserva, o diagnóstico desses parasitas zoonóticos caninos em áreas rurais e suburbanas é possível quando não há equipamentos e infraestrutura laboratorial disponíveis. O método de flutuação simples descrito neste trabalho pode fornecer resultados rápidos e é uma técnica não invasiva e custo-efetiva para triagem de rotina.
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Protocol
O uso e cuidado de cães foi aprovado pela Universidade Nacional e Autônoma do México.
1. Coleta de amostras fecais
OBS: Manuseie o cão com a ajuda de um veterinário ou do dono do animal.
- No caso de cães selvagens (Figura 1A) ou animais nervosos, coletar amostras do solo logo após a defecação ou no máximo 10 minutos depois.
- Lubrifique luvas cirúrgicas ou bolsas de polietileno de paredes finas com água ou vaselina. Para coletar amostras fecais do reto, use luvas cirúrgicas ou bolsas de polietileno de paredes finas.
- Coletar pelo menos 2 g de fezes de cada cão (Figura 1B).
- Identifique amostras fecais individuais da seguinte forma: data, local (coordenadas do Sistema de Posicionamento Global [GPS] usando o Google Maps), atribua um número de identificação para cada animal, idade aproximada do cão, sexo do cão, raça, cão interno ou externo (feral).
- Feche os sacos contendo a amostra fecal com um nó apertado. Manter os sacos refrigerados (4-8 °C) se as amostras de fezes não forem analisadas dentro de 3-4 h após a coleta.
2. Preparação de uma solução salina saturada para diagnóstico de campo
NOTA: Se o acesso a uma balança, material de medição, fogões ou gás para ferver água estiver ausente ou limitado, a solução salina saturada pode ser facilmente preparada usando água, sal de cozinha comum, um copo plástico de 12 oz (355 mL) e uma garrafa vazia de plástico de refrigerante de 1 L.
- Lave bem uma garrafa vazia de refrigerante de 1 L. Encha a garrafa com 1 L de água.
- Encha um copo plástico de 12 oz com sal de cozinha comum.
- Transfira o sal para a garrafa de refrigerante.
- Feche bem o frasco de refrigerante com a tampa de rosca. Agite a solução vigorosamente até que o sal já não se dissolva.
NOTA: Agitar a solução no frasco de refrigerante até a dissolução completa do sal pode levar até 90 min.
3. Preparação de uma solução salina saturada para diagnóstico laboratorial
- Pesar 420 g de sal de cozinha comum.
- Dissolva 420 g de sal em 1 L de água.
- Ferva a solução até que não se dissolva mais sal.
- Filtrar a solução para eliminar o sal não dissolvido.
- Verifique a concentração da solução usando um hidrômetro de fluido pesado ou densitômetro.
OBS: A concentração ideal tem SpG de 1,20 para obtenção de melhores resultados (Figura 2A). A capacidade de flutuação de um ovo é influenciada pela sua interação com a solução, contribuindo para a capacidade variável dos ovos de flutuar em soluções com a mesma gravidade específica. Assim, para alcançar a recuperação ótima dos ovos, é essencial considerar a faixa superior de gravidade específica na solução de flotação, garantindo que ela supere a dos elementos parasitas alvo6.
4. Método de flotação
NOTA: Se as amostras fecais estiverem muito secas ou duras, macerá-las em uma argamassa.
- Usando uma colher, coloque aproximadamente 3 g de fezes em um copo plástico (~8,5 cm de altura e ~5,5 cm de diâmetro).
- Adicionar 1 mL da solução salina saturada até obter uma pasta.
- Mexa por 1 min e adicione 100 mL de solução saturada de sal.
- Passe esta suspensão através de um filtro de plástico para um segundo copo plástico para evitar partículas grosseiras (Figura 2B).
- Deixe a suspensão descansar por 15-20 min.
- Coloque uma alça de inoculação em uma chama por 1 s para garantir que ela esteja livre de ovos, cistos ou oocistos (Figura 2C).
- Aguarde 5 s para que a alça de inoculação esfrie (Figura 2D).
- Tire três gotas da superfície da suspensão com o ciclo de inoculação. Coloque cada uma das três gotas separadamente em uma lâmina de vidro (Figura 2E-G)
NOTA: Certifique-se de que as gotas não estejam em contato umas com as outras (Figura 2H). - Observar ao microscópio com objetiva de 10x (Figura 2I). Coloque uma lamínula se a ampliação for aumentada para 40x.
- Quando um resultado positivo for observado na gota, atribuir uma cruz (+) no diário de bordo do laboratório para registrar a presença de parasitas no período de patente em locais aleatórios da superfície de suspensão fecal.
5. Interpretação do método de flotação
NOTA: Os resultados negativos são inconclusivos.
- Realizar uma série de três testes com amostras de 3 dias consecutivos para aumentar a sensibilidade do teste.
NOTA: Resultados positivos indicam a presença de parasitas no período de patente.
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Representative Results
Neste trabalho, são descritos procedimentos de coleta e coproparasitoscopia para identificação de T. canis e Ancylostoma spp. A lógica por trás da adaptação do método simples de flutuação fecal para detectar ovos de helmintos caninos é que essa técnica é custo-efetiva, pois as soluções, equipamentos e materiais são baratos. Assim, o método tem uma alta capacidade de manipulação de amostras, pois múltiplas amostras podem ser processadas em um curto período. Além disso, o método simples de flutuação fecal é fácil de realizar e relativamente sensível.
O tamanho da amostra e a escolha dos animais foram feitos por conveniência determinada principalmente pela disposição do proprietário dos animais e pela segurança da aproximação dos cães selvagens. No presente trabalho, o método de flotação foi utilizado para avaliar ocorrências e frequências de Ancylostoma spp e T. canis em cães Canis lupus familiaris no México durante 4 anos a partir de 2017. Amostras fecais de 1.638 cães foram coletadas e triadas microscopicamente. Um total de 1.235 cães foram positivos para T. canis e Ancylostoma spp. Um dos objetivos do emprego do método de flotação foi demonstrar sua eficácia na aferição da ocorrência de Toxocara ou Ancilostoma, mas também procurou-se aprofundar o exame dos fatores que poderiam interferir em sua prevalência. Consequentemente, 185 animais com infecções mistas foram descartados. O número de amostras positivas para Ancylostoma spp foi de 833 (78,95% de frequência) e 222 (21,04%) para T. canis. Das 1.050 amostras, 75,5% (793 amostras) foram processadas e lidas em campo, preparando-se a solução de flotação com um frasco de refrigerante e usando um microscópio com baterias recarregáveis 3 x 1,2 V AA para 4 h de operação contínua. As 257 amostras fecais restantes foram examinadas em laboratório.
O objetivo deste estudo foi utilizar uma solução de flotação e um método em campo para acelerar e facilitar o diagnóstico de dois helmintos parasitos de cães em áreas onde não há infraestrutura ou equipamento laboratorial disponível. A aplicação em campo do método de flotação permitiu comunicar os achados a 400 proprietários imediatamente após cada leitura microscópica para fornecer recomendações sobre tratamentos anti-helmínticos e medidas preventivas e, assim, evitar a disseminação do parasita em humanos ou animais de companhia. Da mesma forma, a técnica de flutuação no ambiente de campo possibilitou examinar cães selvagens e fornecer-lhes um tratamento anti-helmíntico usando guloseimas ou alimentos. A Figura 3A e a Figura 3B mostram ovos de T. canis e Ancylostoma spp., respectivamente, observados após a solução de flutuação e a técnica de flutuação em ambiente de campo. Quando amostras frescas de fezes foram submetidas ao método de flotação em um ambiente de campo, a solução preparada em um frasco de refrigerante foi capaz de trazer ovos de helmintos para flutuação. A produção de cristais de sal e bolhas de ar foi comparada com as amostras lidas em laboratório e nenhuma diferença foi detectada pelo operador. Essa observação é encorajadora e desafia o conhecimento de que a concentração de amostras fecais garante uma leitura microscópica mais precisa.
Quando a solução de flotação e as amostras de fezes foram processadas em laboratório, nenhuma diferença foi percebida quanto à morfologia e clareza das leituras ao microscópio, pois a mesma quantidade de detritos flutuou simultaneamente na detecção copromicroscópica de parasitas em campo e laboratório. A Figura 3A,B mostra ovos de T. canis e Ancylostoma spp., respectivamente, recuperados das 257 amostras que foram processadas em um ambiente de laboratório totalmente equipado após o transporte de amostras de áreas urbanas, suburbanas e rurais. Esses ovos do parasito não diferiram morfologicamente daqueles observados em condições de campo (Figura 3C).
Este protocolo gerou um número suficiente de achados para avaliar a influência da localização, estação do ano, sexo, raça, idade e condições externas ou internas na prevalência de T. canis e Ancylostoma spp. Os dados de prevalência foram comparados utilizando-se o Teste ANOVA com valor de significância de 0,05. A Tabela 2 mostra que T. canis exibiu uma frequência significativamente maior de distribuição em climas temperados e secos em comparação com estados caracterizados por climas quentes, enquanto não houve variação notável na prevalência de Ancylostoma spp. Da mesma forma, Ancylostoma spp e T. canis são mais comumente detectados no verão. Verificou-se que 60,86% dos homens foram positivos para ancilostomíase e 37,38% para toxocaríase. Além disso, T. canis foi mais frequentemente detectado em filhotes com menos de 6 meses de idade; enquanto Ancylostoma spp foi mais diagnosticado em cães adultos. Curiosamente, nenhuma diferença foi encontrada entre as raças de cães. A ancilostomíase infectou 65,54% dos cães ao ar livre; no entanto, T. canis foi igualmente detectado em cães com status externo ou interno.
Figura 1: Coleta de amostras de fezes de cães. (A) Deve-se ter cautela ao coletar amostras de fezes de cães selvagens. Quando possível, fezes frescas devem ser coletadas e mantidas em saco plástico para submissão e análise coproparasitoscópica em laboratório. As amostras devem ser refrigeradas a 4 °C e colocadas em caixas de isopor ou envelopes metálicos isolados dentro de 24 h após a coleta. (B) Três gramas de fezes são recomendadas como padrão; portanto, 2-5 g é razoável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparo de uma solução saturada de sal e processamento da suspensão fecal para microscopia. (A) A densidade ideal de uma solução saturada feita com sal deve ser superior a 1,20. É altamente recomendável verificar se não há cristais no fundo e se a solução é transparente. (B) A passagem da suspensão fecal através de um filtro plástico remove partículas grosseiras. (C) O circuito de inoculação deve ser exposto a uma chama (um queimador de laboratório ou um isqueiro portátil comum) para se certificar de que está livre de contaminação. (D) Deixar arrefecer o ciclo de inoculação e retirar três gotas de locais diferentes na superfície da suspensão. (E) Após colocar a primeira gota na lâmina de vidro, evite movimentá-la para reduzir o derramamento da gota. A lâmina de vidro fornece uma plataforma fina e transparente que permite a observação das amostras. (F) Coloque a segunda gota no meio da lâmina de vidro. Tomar uma segunda gota da superfície da suspensão fecal aumenta a probabilidade de encontrar ovos em uma suspensão onde as estruturas parasitárias podem ter sido distribuídas de forma desigual. (G) Coloque a terceira gota sobre a lâmina de vidro. Uma terceira gota da superfície da suspensão fecal permitirá a observação de outra área onde os ovos flutuantes podem ter se concentrado. (H) As três gotas são observadas separadamente na lâmina de vidro para detectar ovos de nematoides de diferentes áreas da superfície da suspensão fecal. (I) Observar a amostra ao microscópio utilizando a objetiva de 10x. Se a objetiva for alterada para 40x, coloque uma tampa nas gotículas de suspensão fecal. Quando um resultado positivo for observado na gota, atribuir uma cruz (+) para marcar a presença de parasitas no período de patente em locais aleatórios da superfície de suspensão fecal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ovos de Toxocara canis e Ancylostoma spp., detectados por microscopia óptica com aumento de 40x. (A) Ovos de Toxocara canis detectados por microscopia óptica com aumento de 40x. O método de flotação permitiu a visualização de campos microscópicos limpos, livres de materiais grosseiros (coletados em campo). Independentemente do modo de preparo da solução de flotação, os ovos foram visíveis e observados principalmente sem alterações morfológicas. (B) Ovos de Ancylostoma spp., detectados por microscopia óptica com aumento de 40x. Embora nenhuma concentração de fezes tenha sido realizada (em um ambiente de campo), o método de flutuação simples abordou as deficiências da detecção morfológica de ovos nas fezes quando o procedimento foi feito de acordo com o presente método. (C) Ovos de T. canis e Ancylostoma spp., detectados por microscopia óptica com aumento de 40x. As características morfológicas desses ovos (recuperados em laboratório) foram claras, embora nenhuma concentração de amostras de fezes tenha sido feita e não diferiram dos ovos recuperados em ambiente de campo. Barras de escala = 75 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ancilostoma spp. | Toxocara canis | | ||
| Clima | Clima quente | 38,66a | 22,52a |
| Clima seco | 29,41a | 36,03a | |
| Clima temperado | 31,93a | 41,44b | |
| Primavera | 23,76a | 19,81a | |
| Verão | 49,81b | 50,00b | |
| Outono | 17,52a | 20,27a | |
| Inverno | 8,88°C | 9,90°C | |
| Gênero | Macho | 60,86a | 62,61a |
| Fêmea | 39,13b | 37,38b | |
| Idade | 0-3 meses | 18,72a | 51,80a |
| 3-6 meses | 15,48a | 32,43b | |
| > 6 meses | 22,44a | 10.36c | |
| > 1 ano | 43,33b | 5,40°C | |
| Raça | Mestiços | 52,78a | 55,86a |
| Raça pura | 47,22a | 44,14a | |
| Situação da habitação | Interior | 34,45a | 52,25a |
| Ao ar livre | 65,54a | 47,74b |
Tabela 2: Prevalência (%) de Ancylostoma spp e Toxocara canis em cães no México durante 4 anos de acordo com clima, estação, sexo, idade, raça e situação de moradia. As indicações dos dados revelam que não há variação significativa na prevalência de Ancylostoma spp em áreas caracterizadas por climas quentes, temperados ou secos. Em contraste, T. canis exibe uma prevalência notavelmente maior em climas temperados e secos em comparação com climas quentes. Além disso, tanto Ancylostoma spp quanto T. canis são mais frequentemente identificados durante a estação de verão. A análise dos dados demonstra ainda que 60,86% dos cães machos apresentaram positividade para ancilostomíase, enquanto 37,38% foram positivos para toxocaríase. Além disso, T. canis é mais comumente detectado em filhotes com menos de 6 meses de idade, enquanto Ancylostoma spp é mais prevalente em cães adultos. Curiosamente, não foram observadas diferenças discerníveis entre as várias raças de cães. Os resultados indicam que 65,54% dos cães ao ar livre estão infectados com ancilostomíase, enquanto T. canis é igualmente prevalente entre cães internos e externos. *Os valores médios dentro de uma coluna do fator (Clima, Estação, Sexo, Idade, Raça e Alojamento) seguidos das mesmas letras não são significativamente diferentes em P < 0,05 de acordo com o Teste ANOVA.
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Discussion
Nematoides como T. canis e Ancylostoma spp podem habitar o intestino delgado de cães e têm potencial para serem transmitidos ao homem. Os sinais clínicos causados pelo T. canis são graves em cães jovens, manifestando-se como baixo crescimento, problemas respiratórios ou lesões do trato digestivo28. Em cães adultos, a infecção normalmente tende a ser leve. O diagnóstico baseia-se na identificação de ovos característicos em uma amostra fecal. Essa condição é causa frequente de prescrição de tratamento anti-helmíntico em cães29. Para entender a epidemiologia do Toxocara, é essencial reconhecer que o parasita pode se transferir da mãe para o filhote tanto através da placenta antes do nascimento quanto através da sucção como uma infecção galactogênica logo após a pandemia. Os seres humanos podem contrair T. canis ao ingerir ovos infectantes, o que pode ocorrer por vários meios, como solo contaminado ou a pele de um cão infectado. Nesse caso, os seres humanos servem como hospedeiros paratênicos e, embora não haja reprodução parasitária, as larvas liberadas dos ovos podem potencialmente causar danos, particularmente no caso de crianças30.
A infecção pela ancilostomíase Ancylostoma spp., em cães, ocorre quando os animais ingerem as larvas ou quando as larvas penetram na pele. Filhotes podem contrair a infecção pelo consumo de um hospedeiro paratênico ou pela via lactogênica31. Ancilostomídeos maduros alimentam-se de sangue, potencialmente levando a anemia grave e sintomas gastrointestinais, particularmente em cães jovens. As infecções que ocorrem através da pele resultam em dermatite, que normalmente se resolve cerca de uma semana após o início da infecção. Vários medicamentos anti-helmínticos têm sido empregados, acompanhados de terapia de suporte. No entanto, há relatos de resistência anti-helmíntica. O ancilostoma tem o potencial de ser patogênico para o homem. A transmissão transcutânea de larvas L3 pode levar a uma condição conhecida como larva migrans cutânea. Essas lesões geralmente se resolvem sem tratamento ao longo de alguns meses. Em casos raros, a ancilostomíase canina pode migrar para o trato gastrointestinal humano, induzindo enterite eosinofílica30.
O diagnóstico preciso, econômico e rápido de parasitoses em cães é essencial para aumentar nosso conhecimento epidemiológico sobre helmintíases caninas. Por esta razão, adaptamos um protocolo da técnica de flutuação simples para ser usado em um ambiente de campo para detectar T. canis e Ancylostoma spp. Uma questão relevante enfrentada no protocolo atual foi a coleta de amostras de cães selvagens, pois esses animais geralmente são de difícil manuseio. Portanto, a amostragem foi feita observando e acompanhando os cães até que eles defecassem, tornando o método de amostragem demorado, desafiador e, de certa forma, perigoso. De acordo com nossa experiência, recomendamos fortemente a avaliação de estudos parasitológicos em cães de abrigo.
Em relação à recuperação de ovos de helmintos zoonóticos, a coproscopia qualitativa continua sendo a metodologia comumente utilizada no laboratório de parasitologia para finsdiagnósticos 1. Estudos anteriores descobriram que a técnica de flotação usando uma solução saturada de sal é mais confiável do que a microscopia direta. Por exemplo, Dryden e colaboradores determinaram sensibilidade de 95,15% para ovos de Ancylostoma spp em 206 amostras fecais processadas pela técnica de flotação e 27,18% por microscopia direta32. Aceita-se que a densidade da solução de flotação é um fator crítico para o método de flotação 14,20,23. Em soluções que não atingem essa densidade, as formas parasitárias demoram mais para flutuar ou nunca flutuam. Quando uma solução de flotação está supersaturada, ela cristaliza em alguns minutos e até mais cedo se uma lamínula for colocada20.
A escolha da solução de flotação neste protocolo foi baseada na facilidade de preparação, conveniência, custo e impacto ambiental. Mesmo que a solução de açúcar demore mais para cristalizar, formalina ou fenol devem ser adicionados como conservante e diminuir a sensação pegajosa ou grudenta; o que é um inconveniente nas condições de campo que prevaleceram neste estudo. Além disso, o descarte de reagentes químicos é uma questão complexa devido às regulamentações ambientais. Os dados deste estudo demonstraram que a solução saturada preparada com sal de cozinha comum em condições de campo usando um frasco de refrigerante, devido à falta de disponibilidade de equipamentos laboratoriais para preparar e ferver uma solução de flotação, foi tão eficaz quanto a preparada em laboratório. A única diferença perceptível é o maior tempo que leva para agitar a garrafa de refrigerante até que uma solução transparente possa ser vista. As observações microscópicas foram igualmente limpas para a amostra preparada usando ambos os métodos para preparar a solução saturada. É importante a realização de mais estudos no futuro com maior número de amostras para confirmar a afirmação supracitada. No entanto, é demorado e precisa do esforço físico de agitar a solução dentro da garrafa por horas. Outra etapa crítica do protocolo consiste em deixar a suspensão fecal repousar por pelo menos 15 min para permitir que os ovos flutuem e se concentrem na superfície. No entanto, quanto maior o tempo de descanso, mais detritos flutuarão e, após algumas horas, os ovos se deformarão ou quebrarão. Considerando que a sensibilidade e a especificidade dos métodos coproparasitoscópicos são baixas e que a acurácia desses métodos como testes diagnósticos depende da habilidade do usuário, no presente estudo, parasitologistas treinados e experientes realizaram a técnica de flutuação e identificaram os parasitas.
Este estudo, até onde sabemos, é o primeiro a estimar a prevalência de Ancylostoma spp e T. canis em cães no México usando amostras fecais examinadas com o método de flutuação simples em um ambiente de campo. Demonstrou-se aqui que a técnica de flotação por nós utilizada, apesar das décadas de uso, ainda é um teste diagnóstico rápido, econômico e altamenteeficaz14. Mesmo assim, existem técnicas coproparasitoscópicas com maior sensibilidade e especificidade do que a que utilizamos para o diagnóstico de helmintos caninos; como a concentração de sedimentação, como é o caso da técnica de Fausto. Além disso, é importante notar que o Fausto, que é um método de concentração, também tem se mostrado mais eficaz na detecção de protozoários como a Giardia33. No entanto, o método coproparasitoscópico escolhido para este estudo apresentou várias vantagens, como o custo. A técnica de Fausto é mais cara do que a flotação com solução saturada com soro fisiológico, pois requer equipamentos adicionais e caros, como uma centrífuga. Outros métodos de concentração, como os que utilizam reagentes como o sulfato de zinco, são mais caros que o sal comum e necessitam de mais tempo devido ao número de lavagens necessárias na centrífuga. Portanto, a técnica de Fausto é limitada para seu uso em trabalhos de campo onde não é comum o acesso a uma centrífuga.
Mais importante, uma limitação da técnica de flutuação simples é que ela não é sensível o suficiente para detectar oocistos de Cryptosporidium , cistos de Giardia ou ovos de Trichiris . Técnicas que utilizam procedimentos de centrifugação para concentrar formas parasitárias devem, portanto, ser usadas se o diagnóstico dessas espécies for pretendido. É importante ressaltar que as taxas de positividade dos gêneros relatados neste estudo não devem ser consideradas conclusivas, pois foi utilizado um método de conveniência como estratégia de amostragem. É importante notar que pode haver situações, como em abrigos com manejo animal desafiador, onde se torna crucial identificar helmintos parasitas em cães. Como resultado, esse protocolo pode precisar de ajustes no futuro para acomodar a coleta de amostras combinadas.
Como ponto fraco, deve-se notar que o método de flotação simples e a preparação da solução saturada de NaCl foram desenvolvidos para um propósito específico - examinar fezes de cães em condições de campo - mas a sensibilidade do procedimento de flotação simples tem sido geralmente considerada baixa. Portanto, para detectar cistos ou ovos de espécies de parasitas mais pesadas, sugere-se fortemente o uso de uma técnica de concentração. Dada a baixa sensibilidade do método de flutuação simples, independentemente de ser realizado em campo ou laboratório, era razoável duvidar que esta técnica seria útil como método de escolha para estudos epidemiológicos de helmintos caninos. No entanto, a alta prevalência de Ancylostoma spp em cães neste estudo e a detecção de ovos de T. canis indicam que o método de flutuação simples, seja realizado em campo ou laboratório, é útil para fornecer evidências que possam subsidiar novos estudos epidemiológicos e propor medidas de controle e prevenção para reduzir a infecção de cães e humanos por esses nematoides.
Usando o método de flutuação simples, analisamos os fatores que afetam a recuperação de ovos de T. canis e Ancylostoma spp. Os achados do T. canis estão de acordo com as últimas pesquisas que indicam que os parasitas são notavelmente mais prevalentes em regiões temperadas e tropicais. Isso se alinha a estudos anteriores que investigaram como fatores ambientais, particularmente temperatura e precipitação, influenciam a distribuição ecológica de espécies de parasitos 34,35,36. Os presentes resultados mostraram que ambos os helmintos infectam machos em uma proporção significativamente maior. É razoável especular que esse achado tenha ocorrido porque o sexo masculino é imunologicamente menos reativo a infecções37,38. A idade influencia a prevalência de T. canis, uma vez que os filhotes foram mais afetados por este parasito. Esse achado está alinhado com pesquisas anteriores que indicam que esse parasita tende a impactar mais os filhotes, enquanto os adultos desenvolvem maior resistência, resultando em menor probabilidade deinfecção6,39. Tanto cães mestiços quanto puros apresentaram prevalências comparáveis de Toxocara canis e Ancylostoma spp. No entanto, cães selvagens exibiram uma maior prevalência de Ancylostoma spp., em comparação com cães residentes em ambientes domésticos. Esse achado está em desacordo com relatos anteriores que não detectaram diferenças entre as raças de cães6. Pode-se concluir que futuras aplicações do preparo da solução salina saturada e do método de flotação simples utilizado neste protocolo podem ser realizadas para exames fecais de rotina em condições de campo ou laboratório.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Dirección General de Asuntos del Personal Académico da Universidad Nacional Autónoma de México por fornecer os recursos financeiros através da subvenção PAPIIT IN218720 e à Dra. Claudia Mendoza pela concessão da extensão solicitada. Este trabalho é dedicado à minha querida Nicole, que faleceu em 2019. Você sempre viverá em Meu coração.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
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