Summary
この研究では、2017年から2021年にかけてメキシコの犬から採取された糞便サンプルから検出された Toxocara canis と Ancylostoma 属菌を野外条件下で同定するための浮遊選鉱法の使用について説明します。
Abstract
Toxocara canisやAncylostoma caninumなどの人獣共通感染症の可能性のある犬の寄生虫を野外条件下で診断することは、メキシコの農村部や郊外では検査室へのアクセスが限られているため、通常困難です。本研究は、2017年から2021年にかけてメキシコのイヌから採取した糞便サンプルから、野外条件下でT. canisとAncylostoma spp.を検出することを目的としたものです。サンプルサイズを計算した結果、全国で534匹の犬が登録されました。
サンプルは、排便後に直腸または地面から直接採取されました。サンプルは、4°Cで個別に密封されたビニール袋に入れて保存しました。 塩化ナトリウムの飽和溶液(比重[SpG]1.20)を野外および実験室条件下で調製した。採取から3日以内に、2〜4gの糞便を、各糞便サンプルを生理食塩水に懸濁させることによる浮遊法を用いて寄生虫について検査した。糞便を浮遊選鉱溶液と混合し、金属製のスプーンを用いて粉砕した。
均一な粘稠度が得られたら、糞便サンプルをふるいを使用して新しいプラスチックカップに注ぎ、10〜15分間放置しました。混合物の上部から3滴を、滅菌した接種ループを用いて回収した。スライドを顕微鏡に置き、訓練を受けた寄生虫学者によって寄生虫を同定しました。1,055匹の犬の糞便サンプルを顕微鏡でスクリーニングしました。 Ancylostoma spp.の陽性サンプル数は833(78.95%頻度)、 T. canisの陽性サンプル数は222(21.04%)でした。これらの知見は、メキシコの都市部と農村部に生息するイヌの人獣共通感染症蠕虫を、実験室および野外条件下で共寄生虫鏡技術を用いて同定することの重要性を示している。
Introduction
胃腸寄生虫は、犬に影響を与える最も一般的な健康問題の1つです1。推定によると、世界には~7億匹の飼い犬がおり、約1億7,500万匹が放し飼いに分類されます2。60種以上の寄生虫が犬と人間の間で共有されており、犬がこれらの寄生虫を持つ人間の感染源である可能性があることを示唆しています3。Toxocara canisとAncylostoma caninumは、犬に感染し、偶発的に人間の宿主に感染する2つの寄生種です。現在、これらの蠕虫がメキシコで生き残り、繁殖できる場所についていくつかの研究があります。犬のトキソカラの有病率は、米国、メキシコ、中央アメリカ、カリブ海諸国で0%から87%以上までさまざまです4。Toxocara canisとAncylostoma spp.、およびイヌの他の寄生種は、メキシコで以前に報告されています5,6,7,8,9,10,11,12,13(表1)。
| 寄生種 | 地域 | 有病率(%) | 参考 |
| Ancylostomaのcaninum | ケレタロ | 42.90 | 5 |
| タバスコ | 15.90 | 6 | |
| カンペチェ州 | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| ユカタン州 | 73.8 | 8 | |
| バベシア | モレロス州 | 13.60 | 9 |
| ベラクルス州 | 10.00 | ||
| コクシジウムオーシスト | ユカタン州 | 2.30 | 8 |
| クテノセファリド | モレロス州 | 30.3 | 10 |
| ジピリジウム・カニナム | ユカタン州 | 2.30 | 8 |
| ディロフィラリア | ユカタン州 | 7.0 – 8.3 | 11 |
| ジアルジア | タバスコ | 3.00 | 6 |
| ユカタン州 | 18.8 | 8 | |
| リーシュマニア | チアパス 州 | 19.00 | 12 |
| サナダムシ | バハカリフォルニア | 6.79 | 13 |
| トキソカラ・イヌ | ケレタロ | 22.10 | 5 |
| ユカタン州 | 6.20 | 8 | |
| トリチュリス・バルピス | ユカタン州 | 25.40 | 8 |
| トリパノソーマ | ハリスコ州 | 8.10 | 9 |
| カンペチェ州 | 7.60 | ||
| チアパス 州 | 4.5 – 42.8 | ||
| キンタナ・ロー州 | 20.1 – 21.3 | ||
| トルカ | 17.50 | ||
| ユカタン州 | 9.8 – 34 |
表1:2001年から2020年までのメキシコにおける犬の寄生虫の地域的有病率(%)。 2001年から2020年にかけて実施された以前の調査の結果により、メキシコのいくつかの都市部と農村部におけるイヌ寄生虫の分布を特定することができました。これらの研究は、さまざまな生態系におけるイヌ寄生虫の存続を助長する疫学的要素の深い理解を提供し、一部の寄生虫種の人獣共通感染の影響の包括的な評価に貢献します。
卵、嚢胞、オーシスト、幼虫などの腸内寄生虫のライフサイクル段階は、糞便サンプルで見つけることができます。したがって、糞便物質の検査は、動物の寄生虫に関する貴重な情報を提供します。ヒトの糞便中のAncylostomidae卵を検出する方法の必要性から、1878年に単純な糞便塗抹標本が使用され、胃腸寄生虫を検出するために長年使用されていましたが、あまり感度が低いと考えられていました。したがって、より優れた共顕微鏡法を開発する必要性が生じた14。糞便サンプル中の寄生虫の卵を回収して数えるための浮遊選鉱技術が最初に報告されてから100年以上が経過しました15。それ以来、浮遊選鉱技術のいくつかの方法と変種は、宿主内のいくつかの寄生虫を検出するための標準と見なされてきました。
例えば、レーンは1924年に、遠心分離とそれに続く沈殿物を1g(レーン)または10g(ストールの修正)でSpG1.2の飽和塩化ナトリウム溶液に浮遊させる直接遠心浮遊選鉱法を含む方法を説明しました。その後、浮遊選鉱技術は、異なるSpG14の溶液を使用して変更されました。1939年、ゴードンとウィットロックは、寄生虫の卵を視覚化する際のデトリタスからの干渉によるストールの手法の欠点を報告し、マクマスター16として知られる定量的方法を開発しました。1979年、O'GradyとSlocombeは、溶液の比重、タイミング、およびストレーナーのメッシュサイズが、浮遊選鉱技術を使用した卵検出の精度に影響を与えることを実証しました17。過去数十年の間に、浮選技術にいくつかの変更が加えられたため、浮選方法の標準化が急務となっています。現在、人獣共通感染症の寄生虫の予防の文脈での犬の蠕虫感染の検出は、人獣共通線虫の感染段階による環境汚染を制限するために適切な駆虫治療を適用するために必要です18。
定性的な方法の中で、糞便浮遊選鉱法は、多くの機器を必要とせず、単純で安価で再現性があるため、広く使用され、受け入れられています。しかし、感染の強度が低いと感度が低下するという大きな欠点があります19。卵、オーシスト、嚢胞、または線虫幼虫などのより多くの寄生要素の存在を明らかにする能力は、通常、溶液20の密度によって決定される。
これまでの報告では、イヌ線虫の卵を検出するための共寄生学的手法が比較されています。運動性原虫の検出に関しては、直接糞便塗抹標本が使用されます。一方、沈降法は、吸虫などの寄生虫の重い卵を診断するのに有用です21。最も広く使用されているフィールドベースの診断検査の1つは、糞便塗抹標本法です。しかし、この技術の感度が低いのは、寄生虫の卵の検出を妨げる破片が含まれているという事実に起因している可能性があります。ふるい分けステップと適切なSpGを提供する溶液を組み込むことにより、浮遊選鉱法は、回虫や鉤虫の卵をより明確で雑然とした観察を提供します。これは、顕微鏡スクリーニングのためのより正確で効率的なプロセス22をもたらす。同様に、寄生虫の卵やオーシストを回収するために、単純な浮遊選鉱と直接遠心浮選技術が非常に一般的に利用されています14。古典的な浮選法は、McMaster法15などの計数室の使用に応じて、定性的または定量的と見なすことができます。それにもかかわらず、浮遊選鉱法は感度が低く、特許期間中の寄生虫の検出に焦点を当てているため、否定的な結果は決定的であると見なされるべきではありません。ただし、精度は、糞便サンプルの保存手順や浮遊選鉱溶液のSpGに依存するだけでなく、ユーザーの糞便検査を実施する際の技術的習熟度と経験にも依存します。
その結果、糞便中の犬の寄生虫を検出するための他の方法が検討されています。犬の腸管蠕虫感染症の診断に最も広く使用されているアプローチの1つは、チューブ内の浮遊選鉱プロトコルやマクマスター法と比較した場合、犬の A.caninum の診断に正確で信頼性の高い結果をもたらす多価で高感度かつ正確な方法であるFLOTAC法であると一般的に認識されています19。23。沈降法は、吸虫卵、胚化線虫卵、およびほとんどのサナダムシの卵を回収するのに有用であり、これらの構造は浮遊しないため、浮遊選鉱溶液の表面では回収できません24。浮遊選鉱/沈殿技術よりも優れていることが証明されている方法の1つは、糞便中の条虫卵の検出を可能にし、時間がかからず、糞便破片から アノプロケファラ の卵を分離し、結晶化を減少させるため、修正二重遠心浮遊法です25。さらに、この技術は、回虫卵を高感度で検出するために成功裏に使用されています26。しかし、これらの前述の技術やOvassayなどの遠心分離法の中には、この研究で提案する浮選プロトコルとは対照的に、ホルマリンなどの試薬、市販のキット、実験室条件下でのサンプル処理、および硫酸亜鉛27などの試薬の使用が必要であり、これらは高価で環境毒性を回避するために特別な廃棄手順を必要とします。
最近では、高SpGの溶液を添加することにより浮選法の感度を高める技術の使用が好まれています。しかし、これらの溶液の欠点は、最終準備における破片の増加であり、したがって、寄生虫の卵の不正確な検出であることを考慮する必要があります。さらに、材料、試薬、コスト、環境影響問題、および遠心分離法の使用の難しさは、浮遊選鉱技術14の選択に影響を与え、これは、本研究で提示するプロトコルとは対照的に、フィールド条件において困難であり得る。食卓塩による浮選溶液の調製は、圃場条件下では砂糖がスズメバチやミツバチなどの昆虫を引き付け、調製物が粘着性になるため、砂糖の利用よりも有利です。さらに、べたつきを避けるために糖溶液に添加されるフェノールやZnSO4などの溶液は、環境保護ガイドラインに従って適切に廃棄するのが複雑であり、現場で廃棄することはできません。食卓塩溶液とは異なります。
この原稿の目的は、野外および実験室条件下での単純な浮遊選鉱技術の適応を使用して、糞便サンプル中の T.canis および Ancylostoma 属の卵を検出する手順を示すことです。本書に記載されているプロトコルに従い、バックアップバッテリーを備えた顕微鏡を使用すると、実験装置やインフラストラクチャが利用できない場合に、農村部および郊外地域でのこれらの犬の人獣共通寄生虫の診断が可能です。この研究で説明した単純な浮遊選鉱法は、迅速な結果を得ることができ、ルーチンスクリーニングのための非侵襲的で費用対効果の高い技術です。
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Protocol
犬の使用と世話は、メキシコ国立自治大学によって承認されました。
1.糞便サンプルの収集
注:獣医師または動物の所有者の助けを借りて犬を扱ってください。
- 野良犬(図1A)や神経質な動物の場合は、排便直後または10分以内に地面からサンプルを採取してください。
- 手術用手袋または薄肉のポリエチレンバッグに水またはワセリンを注油します。直腸から糞便サンプルを採取するには、手術用手袋または薄肉のポリエチレンバッグを着用してください。
- 各犬から少なくとも2gの糞便を採取します(図1B)。
- 日付、場所(Googleマップを使用した全地球測位システム[GPS]座標)、各動物の識別番号の割り当て、犬のおおよその年齢、犬の性別、犬種、屋内または屋外(野良犬)として個々の糞便サンプルを特定します。
- 糞便サンプルの入った袋をしっかりと結び目で閉じます。採取後4〜8時間以内に糞便サンプルが分析されない場合は、バッグを冷蔵(4〜4°C)してください。
2. フィールド診断のための飽和塩溶液の調製
注意: 天びん、測定材料、ストーブ、またはお湯を沸かすためのガスへのアクセスが不足または制限されている場合は、水、食卓塩、プラスチック製の12オンス(355 mL)カップ、および1Lのソーダプラスチック空ボトルを使用して、飽和生理食塩水を簡単に調製できます。
- 空の1Lソーダボトルを完全に洗います。ボトルに1Lの水を入れます。
- 12オンスのプラスチックカップに一般的な食卓塩を入れます。
- 塩をソーダボトルに移します。
- ソーダボトルをスクリューキャップでしっかりと閉じます。塩が溶けなくなるまで溶液を激しく振る。
注意: 塩が完全に溶けるまでソーダボトル内の溶液を振ると、最大90分かかる場合があります。
3.検査診断のための飽和塩溶液の調製
- 一般的な食卓塩420gの重さを量ります。
- 420gの塩を1Lの水に溶かします。
- 塩が溶けなくなるまで溶液を沸騰させます。
- 溶液をろ過して、未溶解の塩を廃棄します。
- 重流体比重計または濃度計を使用して溶液の濃度を確認します。
注:理想的な濃度は、より良い結果を得るために SpG が 1.20 です(図 2A)。卵の浮遊能力は溶液との相互作用の影響を受け、同じ比重の溶液中で卵が浮遊する能力に変化をもたらします。したがって、最適な卵の回収を達成するためには、浮遊選鉱溶液中の比重の上限を考慮し、標的とする寄生虫要素の比重を上回っていることを確認することが不可欠である6。
4.浮遊選鉱法
注:糞便サンプルが乾燥しすぎたり硬すぎたりする場合は、乳鉢で浸軟してください。
- スプーンを使用して、約3gの糞便を1つのプラスチックカップ(高さ~8.5cm、直径~5.5cm)に入れます。
- ペーストが得られるまで1mLの飽和塩溶液を加えます。
- 1分間攪拌し、100mLの飽和塩溶液を加えます。
- この懸濁液をプラスチックストレーナーを通して2つ目のプラスチックカップに通し、粗い粒子を避けます(図2B)。
- サスペンションを15〜20分間放置します。
- 接種ループを炎の中に1秒間置き、卵、嚢胞、またはオーシストがないことを確認します(図2C)。
- 接種ループが冷えるまで5秒間待ちます(図2D)。
- 接種ループで懸濁液の表面から3滴を取ります。3つの滴をそれぞれ1枚のスライドガラスに別々に置きます(図2E-G)
メモ:液滴が互いに接触していないことを確認します(図2H)。 - 10倍の対物レンズで顕微鏡で観察します(図2I)。倍率を40倍にする場合はカバーガラスを配置します。
- 液滴に陽性の結果が観察された場合は、実験室のログブックに十字(+)を割り当てて、糞便懸濁液表面のランダムな部位に特許期間中の寄生虫の存在を記録します。
5.浮遊選鉱法の解釈
注:陰性の結果は決定的ではありません。
- 3日間連続して採取したサンプルで3つのテストを行い、テストの感度を上げます。
注:肯定的な結果は、特許期間中に寄生虫が存在することを示しています。
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Representative Results
この研究では、 T. canis と Ancylostoma spp. の同定のための収集と共寄生虫鏡検査手順について説明します。犬の蠕虫の卵を検出するための単純な糞便浮遊法を採用した理論的根拠は、この技術がソリューション、機器、および材料が安価であるため、費用対効果が高いことです。そのため、短時間で複数のサンプルを処理できるため、サンプル処理能力が高いのが特徴です。さらに、単純な糞便浮遊選鉱法は実行が容易で、比較的敏感です。
サンプルサイズと動物の選択は、主に動物の飼い主の意欲と近づく野良犬の安全性によって決定される利便性によって行われました。本研究では、2017年から4年間、メキシコのイヌCanis lupus familiarisにおけるAncylostoma spp.およびT. canisの発生と頻度を評価するために浮遊選鉱法を使用しました。1,638匹の犬から糞便サンプルを採取し、顕微鏡でスクリーニングしました。合計1,235匹の犬がT.canisとAncylostoma属菌に陽性でした。浮遊選鉱法を採用する目的の一つは、トキソカラやアンシロストーマの発生を測る上での有効性を実証することであったが、その有病率に影響を与える可能性のある要因をより深く検討することも目的とした。その結果、混合感染の185匹が廃棄されました。Ancylostoma spp.の陽性サンプル数は833(78.95%頻度)、T. canisの陽性サンプル数は222(21.04%)でした。1,050サンプルのうち、75.5%(793サンプル)を、ソーダボトルで浮遊選鉱溶液を調製し、単三電池3本と顕微鏡を使用して4時間の連続運転を行うことにより、現場で処理および読み取られました。残りの257個の糞便サンプルは実験室で検査されました。
この研究の目的は、浮遊選鉱液と野外での方法を使用して、実験室のインフラストラクチャや機器が利用できない地域での犬の2つの蠕虫寄生虫の診断を迅速化および促進することでした。浮遊選鉱法の現場適用により、顕微鏡測定の直後に400人の飼い主に調査結果を伝え、駆虫治療と予防策に関する推奨事項を提供し、人間やコンパニオンアニマルへの寄生虫の拡散を防ぐことができました。同様に、野外での浮遊選鉱技術により、野良犬を診察し、おやつや餌を使った駆虫治療を行うことが可能になりました。 図3A および 図3B は、 それぞれT. canis および Ancylostoma spp.の卵を、浮遊選鉱溶液および技術を野外設定で行った後に観察した。新鮮な糞便サンプルを野外で浮遊選鉱法にかけたところ、ソーダボトルで調製した溶液は、蠕虫の卵を浮遊選鉱させることができました。塩の結晶と気泡の生成を実験室で読み取ったサンプルと比較したところ、オペレーターは違いを検出しませんでした。この観察は心強いものであり、糞便サンプルの濃度がより正確な顕微鏡測定を保証するという知識に挑戦します。
浮遊選鉱溶液と糞便サンプルを実験室で処理した場合、寄生虫の野外検出と実験室の共顕微鏡検出の両方で同じ量の破片が同時に浮遊したため、顕微鏡下での測定値の形態と明瞭さに関して違いは認識されませんでした。 図3A、B は、都市部、郊外、農村部からサンプルを輸送した後、設備の整った実験室で処理された257個のサンプルから回収された T.canis と Ancylostoma 属の卵をそれぞれ示しています。これらの寄生虫の卵は、野外条件下で観察されたものと形態学的に違いはありませんでした(図3C)。
このプロトコルは、場所、季節、性別、品種、年齢、および T.canis および Ancylostoma 属菌の有病率における屋外または屋内条件の影響を評価するのに十分な数の調査結果を生成しました。有病率データは、有意値0.05のANOVA検定を使用して比較されました。 表 2は、温暖な気候を特徴とする州と比較して、温帯および乾燥した気候でT . canis の分布頻度が有意に高いことを示しているが、温暖、温帯、または乾燥した気候が優勢な地域間では 、Ancylostoma 属菌の有病率に顕著な変動はなかった。同様に、 Ancylostoma spp.と T. canis は夏に最もよく検出されます。男性の60.86%がアンシロストミア症、37.38%が毒舌虫症に陽性であることがわかりました。さらに、 T. canis は生後6ヶ月未満の子犬でより頻繁に検出されました。一方、 Ancylostoma spp.は成犬でより多く診断されました。興味深いことに、犬種間で違いは見られませんでした。犬の鉤虫は屋外の犬の65.54%に感染しました。しかし、 T. canis は、屋外または屋内の状態にある犬でも同様に検出されました。
図1:イヌの糞便サンプル採取。 (A)野良犬から糞便サンプルを採取する際には注意が必要です。可能であれば、新鮮な糞便を収集し、実験室での提出と共寄生虫鏡分析のためにビニール袋に保管する必要があります。サンプルは4°Cで冷蔵し、採取後24時間以内に発泡スチロールの箱または断熱金属製の封筒に入れる必要があります。(B)3グラムの糞便が標準として推奨されます。したがって、2〜5gが妥当です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:飽和塩溶液の調製と顕微鏡用の糞便懸濁液の処理。 (A)塩で作られた飽和溶液の理想的な密度は1.20以上である必要があります。底に結晶がなく、溶液が透明であることを確認することを強くお勧めします。(B)糞便懸濁液をプラスチックストレーナーに通すと、粗い粒子が除去されます。(C)接種ループは、汚染がないことを確認するために、炎(実験室用バーナーまたは一般的な携帯用ライター)にさらす必要があります。(D)接種ループを冷まし、懸濁液表面の異なる部位から3滴を滴下します。(E)最初の液滴をスライドガラスに置いた後は、液滴のこぼれを減らすためにスライドを動かさないでください。スライドガラスは、サンプルの観察を可能にする薄くて透明なプラットフォームを提供します。(F)スライドガラスの中央に2つ目の液滴を置きます。糞便懸濁液の表面から2滴目を滴下すると、寄生構造が不均一に分布している可能性のある懸濁液で卵を見つける可能性が高くなります。(G)スライドガラスの上に3つ目の液滴を置きます。糞便懸濁液の表面から3回目の落下により、浮遊卵が集中した可能性のある別の領域を観察できます。(H)3つの液滴をスライドガラス上で別々に観察し、糞便懸濁液表面の異なる領域から線虫の卵を検出した。(I)10倍対物レンズを使用して顕微鏡でサンプルを観察します。対物レンズを40倍に変更した場合は、糞便懸濁液滴にカバースリップを置きます。液滴に陽性の結果が観察された場合は、糞便懸濁表面のランダムな部位に特許期間中の寄生虫の存在を示すために十字(+)を割り当てます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3: トキソカラ・カニス と アンシロストーマ 属菌の卵を40倍の倍率の光学顕微鏡で検出 。(A)40倍倍の倍率を用いた光学顕微鏡で検出された トキソカラの卵 。浮遊選鉱法により、粗い物質(現場で収集された)を含まないクリーンな微細な場を可視化することができました。浮遊選鉱溶液の調製方法にかかわらず、卵は目に見えるものであり、形態学的変化なしに主に観察された。(B)40倍倍の光学顕微鏡で検出された Ancylostoma 属菌の卵。糞便の濃縮は(野外で)行われなかったが、単純な浮遊選鉱法は、現在の方法に従って手順を行った場合、糞便中の卵の形態学的検出の欠点に対処した。(C) T. canis と Ancylostoma spp.の卵を40倍の倍率で光学顕微鏡で検出した。これらの卵の形態学的特徴(実験室で回収された卵)は、糞便サンプルの濃度が測定されていなくても明らかであり、野外で回収された卵と変わらなかった。スケールバー = 75 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| Ancylostoma spp.(アンシロストーマ属) | トキソカラ・イヌ | ||
| 気候 | 温暖な気候 | 38.66A | 22.52A |
| 乾燥した気候 | 29.41A | 36.03A | |
| 温暖な気候 | 31.93A | 41.44のb | |
| 春 | 23.76A | 19.81A | |
| 夏 | 49.81のb | 50.00bの | |
| 秋 | 17.52A | 20.27A | |
| 冬 | 8.88°C | 9.90°C | |
| ジェンダー | 男性 | 60.86A | 62.61A |
| 女性 | 39.13イ | 37.38bの | |
| 年齢 | 0-3ヶ月 | 18.72A | 51.80A |
| 3-6ヶ月 | 15.48A | 32.43のb | |
| > 6ヶ月 | 22.44A | 10.36°C | |
| > 1年 | 43.33bの | 5.40°C | |
| 繁殖 | 交雑 | 52.78A | 55.86A |
| 純血 種 | 47.22A | 44.14A | |
| 住宅状況 | 屋内 | 34.45A | 52.25A |
| アウトドア | 65.54A | 47.74bの |
表2:メキシコの4年間のイヌにおける Ancylostoma spp.および Toxocara canis の有病率(%)を、気候、季節、性別、年齢、品種、および住宅状況別に。 データからの兆候は、温暖、温帯、または乾燥した気候を特徴とする地域全体で Ancylostoma spp.の有病率に有意な変動がないことを明らかにしています。対照的に、 T. canis は、温暖な気候と比較して、温暖で乾燥した気候で顕著に高い有病率を示します。さらに、 Ancylostoma spp.と T. canis はどちらも夏季に最も頻繁に確認されています。さらに、データの分析では、雄犬の60.86%がアンシロストミア症の陽性反応を示し、37.38%が中毒症の陽性反応を示しました。さらに、 T. canis は生後 6 か月未満の子犬でより一般的に検出されますが、 Ancylostoma spp. は成犬でより一般的です。興味深いことに、さまざまな犬種間で識別可能な違いは観察されませんでした。調査結果は、屋外犬の65.54%が犬の鉤虫に感染していることを示していますが、 T.canis は屋内犬と屋外犬の間で等しく蔓延しています。*因子(気候、季節、性別、年齢、品種、住居)の列内の平均値とそれに続く同じ文字は、ANOVA検定によると、P<0.05で有意差はありません。
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Discussion
T. canisやAncylostoma spp.などの線虫は、犬の小腸に生息し、ヒトに感染する可能性があります。T. canisによって引き起こされる臨床徴候は、若い犬では深刻であり、発育不良、呼吸器系の問題、または消化管病変として現れます28。成犬の場合、感染は通常軽度である傾向があります。診断は、糞便サンプル中の特徴的な卵の特定に依存しています。この状態は、犬に駆虫治療を処方する頻繁な原因です29。トキソカラの疫学を理解するためには、寄生虫が母犬から子犬に、出生前の胎盤と、哺乳直後のガラクトゲン感染症の両方を介して、母犬から子犬に感染する可能性があることを認識することが不可欠です。人間は、汚染された土壌や感染した犬の毛皮など、さまざまな手段で感染卵を摂取すると、T.canisに感染する可能性があります。この場合、人間は寄生虫の宿主として機能し、寄生生殖はありませんが、卵から放出された幼虫は、特に子供の場合、害を及ぼす可能性があります30。
犬の鉤虫 Ancylostoma spp.の感染は、動物が幼虫を摂取したとき、または幼虫が皮膚に侵入したときに発生します。子犬は、パラテン宿主を摂取するか、乳酸経路を介して感染する可能性があります31。成熟した鉤虫は血液を吸血するため、特に若い犬では重度の貧血や胃腸症状を引き起こす可能性があります。皮膚を介して発生する感染症は皮膚炎を引き起こし、通常、感染の発症から約1週間後に解消します。支持療法を伴うさまざまな駆虫薬が採用されています。しかし、駆虫薬耐性の報告があります。 ancylostoma は、ヒトに病原性がある可能性があります。L3幼虫の経皮的伝播は、皮膚幼虫移動として知られる状態につながる可能性があります。これらの病変は、通常、数か月にわたって治療なしで解消します。まれに、イヌの鉤虫がヒトの消化管に移動し、好酸球性腸炎を誘発することがある30。
犬の寄生虫症の正確で経済的かつ迅速な診断は、犬の寄生虫症に関する疫学的知識を増やすために不可欠です。このため、T . canis と Ancylostoma spp を検出するためのフィールド設定で使用される単純な浮遊選鉱法のプロトコルを適応させました。現在のプロトコルで直面している関連する問題は、野良犬は通常扱いが難しいため、野良犬からのサンプルの収集でした。そのため、犬が排泄するまで観察し、追いかけることでサンプリングを行うため、サンプリング方法は時間がかかり、困難で、どこか危険でした。私たちの経験から、保護犬の寄生虫学的研究を評価することを強くお勧めします。
人獣共通感染症の蠕虫の卵の回収に関しては、定性的コプロスコープは、診断目的で寄生虫学研究室で一般的に使用される方法論であり続けています1。以前の研究では、飽和塩溶液を使用した浮遊選鉱技術が直接顕微鏡法よりも信頼性が高いことがわかっています。例えば、Drydenらは、浮遊選鉱法で処理した206個の糞便サンプル中のAncylostoma属菌の卵について95.15%、直接顕微鏡法で27.18%の感度を決定した32。浮選溶液の密度は、浮選方法14,20,23にとって重要な要素であることが認められている。その密度に達しない溶液では、寄生形態が浮遊するのに時間がかかるか、浮遊しません。浮遊選鉱溶液が過飽和状態になると、数分で結晶化し、カバーガラスが置かれている場合はさらに早く結晶化します20。
このプロトコルにおける浮選ソリューションの選択は、調製の容易さ、利便性、コスト、および環境への影響に基づいて行われました。砂糖溶液の結晶化には時間がかかりますが、ホルマリンまたはフェノールを防腐剤として添加し、べたつきや粘着性の感覚を減らす必要があります。これは、この研究で優勢だったフィールド条件の下では不便です。さらに、化学試薬の廃棄は、環境規制のために複雑な問題です。この研究のデータは、浮選溶液を調製して沸騰させるための実験装置が利用できないため、ソーダボトルを使用して野外条件下で一般的な食卓塩で調製された飽和溶液が、実験室で調製されたものと同じくらい効果的であることを示しました。唯一の違いは、透明な溶液が見えるまでソーダボトルを振るのにかかる時間が長いことです。顕微鏡観察は、飽和溶液を調製するために両方の方法を使用して調製したサンプルに対して同等にクリーンでした。前述の声明を確認するために、将来、より多くのサンプルでより多くの研究を行うことが重要です。しかし、それは時間がかかり、ボトル内の溶液を何時間も振るという肉体的な努力が必要です。プロトコルのもう一つの重要なステップは、糞便懸濁液を少なくとも15分間放置して、卵を浮かせて表面に集中させることです。ただし、休息時間が長ければ長いほど、より多くの破片が浮遊し、数時間後に卵が変形または壊れます。共寄生虫鏡法は感度と特異度が低く、診断テストとしてのこれらの方法の精度はユーザーのスキルに依存することを考慮して、現在の研究では、訓練を受けた経験豊富な寄生虫学者が浮遊選鉱技術を実行し、寄生虫を特定しました。
この研究は、私たちの知る限り、メキシコの犬の Ancylostoma spp.および T.canis の有病率を、野外での簡単な浮遊法で調べた糞便サンプルを使用して推定した最初の研究です。ここで実証されたのは、何十年にもわたって使用されているにもかかわらず、私たちが使用した浮遊選鉱技術が、依然として非常に効果的で経済的で迅速な診断テストであるということです14。それでも、犬の蠕虫の診断に使用したものよりも感度と特異性が高い共寄生虫鏡技術があります。ファウスト技法の場合のように、沈降濃度など。さらに、濃縮法であるファウストも、 ジアルジア33などの原生動物の検出に有効であることが示されていることに注意することが重要です。しかし、本研究で選択した共寄生虫鏡下法には、コスト面などいくつかの利点がありました。ファウスト法は、遠心分離機などの追加の高価な機器を必要とするため、生理食塩水飽和溶液を使用した浮選よりも高価です。硫酸亜鉛などの試薬を使用する濃縮法など、他の濃縮法は、一般的な塩よりも高価であり、遠心分離機での洗浄回数が多いため、より多くの時間を必要とします。したがって、ファウストの手法は、遠心分離機へのアクセスが一般的ではないフィールドワークでの使用に限定されています。
最も重要なことは、単純な浮遊選鉱法の限界は、 クリプトスポリジウム オーシスト、 ジアルジア 嚢胞、または トリチュリス の卵を検出するのに十分な感度がないことです。したがって、これらの種の診断を意図する場合は、遠心分離手順を使用して寄生虫の形態を濃縮する技術を使用する必要があります。この研究で報告された属の陽性率は、サンプリング戦略として便宜的な方法が使用されたため、決定的と見なされるべきではないことを強調することは重要です。動物の管理が困難なシェルターなど、犬の寄生虫を特定することが重要になる状況があることに注意することが重要です。その結果、このプロトコルは、組み合わせたサンプルの収集に対応するために、将来的に調整が必要になる可能性があります。
弱点として、単純な浮選法とNaClの飽和溶液の調製は、主に野外条件下で犬の糞便を検査するという特定の目的のために開発されたが、単純な浮選手順の感度は一般的に低いと考えられてきたことに注意する必要があります。したがって、より重い寄生虫種の嚢胞または卵を検出するには、濃縮技術の使用を強くお勧めします。単純な浮遊選鉱法の感度が低いことを考えると、野外で実施するか実験室で実施するかにかかわらず、この手法が犬の蠕虫寄生虫の疫学研究に最適な方法として有用かどうか疑問に思うのは妥当でした。それにもかかわらず、この研究におけるイヌにおける 高いAncylostoma spp.有病率と T. canis の卵の検出は、野外または実験室の設定で実施されたかどうかにかかわらず、単純な浮遊法が、さらなる疫学研究を支持する可能性のある証拠を提供し、これらの線虫によるイヌとヒトの感染を減らすための制御および予防策を提案するのに有用であることを示しています。
簡易浮遊選鉱法を用いて、イヌの糞便からのT.canisおよびAncylostoma属の卵子回収に影響を与える要因を分析した。T. canisの発見は、寄生虫が温帯および熱帯地域で顕著に多く発生していることを示す最新の研究と一致していました。これは、環境要因、特に気温と降雨量が寄生虫種の生態学的範囲にどのように影響するかを調査した先行研究と一致しています34,35,36。今回の結果は、どちらの蠕虫も雄に感染する割合が有意に高いことを示した。この発見は、男性が免疫学的に感染症に反応しにくいためであると推測するのが妥当です37,38。子犬はこの寄生虫の影響をより受けていたため、年齢はT.canisの有病率に影響を与えます。この発見は、この寄生虫が子犬に大きな影響を与える傾向がある一方で、成虫は抵抗力が高まり、感染の可能性が低くなることを示す以前の研究と一致しています6,39。交雑種と純血種の両方の犬は、Toxocara canisとAncylostoma属の有病率が同等であることを示しました。しかし、野良犬は、家庭に生息する犬と比較して、アンシロストーマ属菌の有病率が高かった。この発見は、犬種間の違いを検出しなかった以前の報告と一致しません6。飽和生理食塩水の調製およびこのプロトコルで使用される単純な浮選法の将来の応用は、野外または実験室条件下での日常的な糞便検査のために実施することができると結論付けることができる。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、メキシコ国立自治大学のDirección General de Asuntos del Personal AcadémicoがPAPIIT IN218720助成金を通じて財源を提供してくれたこと、および要求された延長を許可してくれたクラウディア・メンドーサ博士に感謝しています。この作品は、2019年に亡くなった私の素敵なニコールに捧げられています。あなたはいつも私の心の中で生き続けます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
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