Summary
В данной работе описывается использование флотационного метода для идентификации Toxocara canis и Ancylostoma spp., обнаруженных в образцах фекалий, взятых у собак в Мексике в период с 2017 по 2021 год в полевых условиях.
Abstract
Диагностика собачьих паразитов с зоонозным потенциалом, таких как Toxocara canis и Ancylostoma caninum, в полевых условиях, как правило, затруднена из-за ограниченного доступа к лабораториям в сельских и пригородных районах Мексики. Это исследование было направлено на обнаружение T. canis и Ancylostoma spp. в образцах фекалий, собранных у собак в Мексике с 2017 по 2021 год в полевых условиях. Расчет размера выборки привел к целевому набору 534 собак по всей стране.
Образцы собирали непосредственно из прямой кишки или земли после дефекации. Образцы хранили в индивидуальных, плотно закрытых, полиэтиленовых пакетах при температуре 4 °С. Насыщенный раствор хлорида натрия (удельный вес [SpG] 1,20) готовили как в полевых, так и в лабораторных условиях. В течение 3 суток после сбора 2-4 г кала исследовали на паразитов флотационным методом путем суспендирования каждого образца фекалий в физиологическом растворе. Фекалии смешивали со флотационным раствором и измельчали с помощью металлической ложки.
После достижения однородной консистенции образец кала пересыпали в новый пластиковый стаканчик с помощью сита и оставляли на 10-15 минут. Три капли с верхней части смеси собирали с помощью стерилизованной инокуляционной петли. Предметные стекла помещали на микроскоп, а паразитов идентифицировали обученные паразитологи. Образцы фекалий 1055 собак были исследованы под микроскопом. Количество положительных проб для Ancylostoma spp. составило 833 (78,95% частоты) и 222 (21,04%) для T. canis. Эти результаты иллюстрируют важность выявления зоонозных гельминтов у собак, живущих в городских и сельских районах Мексики, с использованием копропаразитоскопического метода в лаборатории и в полевых условиях.
Introduction
Желудочно-кишечные паразиты являются одной из наиболее распространенных проблем со здоровьем, которые поражают собак1. По оценкам, во всем мире насчитывается ~700 миллионов домашних собак, и примерно 175 миллионов из них могут быть отнесены к категории свободногуляющих. Более 60 видов паразитов являются общими для собак и людей, что позволяет предположить, что собаки могут быть источником инфекции для людей этимипаразитами. Toxocara canis и Ancylostoma caninum — два паразитических вида, которые заражают собак и, случайно, людей-хозяев. В настоящее время существует несколько исследований о местах, где эти гельминты способны выживать и размножаться в Мексике. Распространенность токсокары у собак колеблется от 0% до более чем 87% в США, Мексике, Центральной Америке и странах Карибского бассейна4. Toxocara canis и Ancylostoma spp., а также другие виды паразитов у собак ранее были зарегистрированы в Мексике 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (табл. 1).
| Паразитические виды | Область | Распространенность (%) | Ссылка |
| Анкилостома собачья (Ancylostoma caninum) | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Табаско | 15.90 | 6 | |
| Кампече | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Юкатан | 73.8 | 8 | |
| Бабезия | Морелос | 13.60 | 9 |
| Веракрус | 10.00 | ||
| Кокцидиальные ооцисты | Юкатан | 2.30 | 8 |
| Гребневики | Морелос | 30.3 | 10 |
| Дипилидиум (Dipylidium caninum) | Юкатан | 2.30 | 8 |
| Дирофилярия | Юкатан | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Лямблии | Табаско | 3.00 | 6 |
| Юкатан | 18.8 | 8 | |
| Лейшмания | Чьяпас | 19.00 | 12 |
| Цепней | Нижняя Калифорния | 6.79 | 13 |
| Токсокара собачья (Toxocara canis) | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Юкатан | 6.20 | 8 | |
| Трихурис вульпис (Trichuris vulpis) | Юкатан | 25.40 | 8 |
| Трипаносома | Халиско | 8.10 | 9 |
| Кампече | 7.60 | ||
| Чьяпас | 4.5 – 42.8 | ||
| Кинтана-Роо | 20.1 – 21.3 | ||
| Толука | 17.50 | ||
| Юкатан | 9.8 – 34 |
Таблица 1: Региональная распространенность (%) паразитов собак в Мексике с 2001 по 2020 гг. Результаты предыдущих исследований, проведенных с 2001 по 2020 год, позволили выявить распространение собачьих паразитов в нескольких городских и сельских районах Мексики. Эти исследования обеспечивают глубокое понимание эпидемиологических элементов, способствующих персистенции собачьих паразитов в различных экосистемах, способствуя комплексной оценке зоонозного воздействия некоторых видов паразитов.
Стадии жизненного цикла кишечных паразитов, таких как яйца, цисты, ооцисты или личинки, могут быть обнаружены в образцах стула. Таким образом, исследование фекального материала дает ценную информацию о паразитах животного. Потребность в методе обнаружения яиц Ancylostomidae в фекалиях человека привела к тому, что в 1878 году был использован простой мазок кала, который в течение многих лет использовался для обнаружения желудочно-кишечных паразитов, но считался не очень чувствительным. Таким образом, возникла необходимость в разработке более совершенных копромикроскопических методов14. Прошло более 100 лет с тех пор, как была впервые описана флотационная методика извлечения и подсчета яиц паразитов в образцах фекалий15. С тех пор несколько методов и вариантов флотационной техники считаются стандартными для обнаружения некоторых паразитов в их хозяевах.
Например, в 1924 году Лейн описал метод, включающий метод прямой центробежной флотации, который включает центрифугирование с последующим всплытием осадка в насыщенном растворе хлорида натрия с SpG 1,2 в 1 г (Лейн) или 10 г (модификация Столла). Впоследствии метод флотации был модифицирован за счет использования растворов с различными SpG14. В 1939 году Гордон и Уитлок сообщили о недостатках метода Столла из-за помех от детрита при визуализации яиц паразитов и разработали количественный метод, известный как McMaster16. В 1979 г. О'Грэйди и Слокомб продемонстрировали, что удельный вес раствора, время и размеры ячеек сетчатых фильтров влияют на точность обнаружения яиц с помощью метода флотации17. В последние десятилетия в связи с тем, что в технику флотации был внесен ряд изменений, возникла острая необходимость в стандартизации методов флотации. В настоящее время выявление гельминтозов собак в контексте профилактики зоонозных паразитов требует применения соответствующих антигельминтных препаратов для ограничения загрязнения окружающей среды инфекционными стадиями зоонозных нематод18.
Среди качественных методов широко используется и принимается метод фекальной флотации, поскольку он не требует большого количества оборудования, прост, недорог и воспроизводим; Тем не менее, у него есть существенный недостаток, заключающийся в том, что ему не хватает чувствительности при низкой интенсивности инфекции19. Способность выявлять наличие большего числа паразитарных элементов, таких как яйца, ооцисты, цисты или личинки нематод, обычно определяется плотностью раствора20.
В предыдущих отчетах сравнивались копропаразитологические методы обнаружения яиц собачьей нематоды. Что касается выявления подвижных простейших, то используют прямые мазки кала; В то время как методы седиментации полезны для диагностики тяжелых яиц паразитов, таких как трематоды21. Одним из наиболее широко используемых полевых диагностических тестов является метод мазка кала. Однако низкий уровень чувствительности этого метода можно объяснить тем, что он содержит мусор, который мешает обнаружению яиц паразитов. Благодаря включению этапа просеивания вместе с растворами, обеспечивающими надлежащий SpG, метод флотации обеспечивает более четкое и менее загроможденное наблюдение за яйцами аскарид и анкилостомоз. Это приводит к более точному и эффективному процессу микроскопического скрининга22. Кроме того, для извлечения яиц паразитов и ооцист очень часто используются методы простой флотации и прямой центробежной флотации14. Классические методы флотации можно считать качественными или количественными в зависимости от использования счетной камеры, такой как метод Макмастера15. Тем не менее, поскольку метод флотации имеет низкую чувствительность и ориентирован на обнаружение паразитов в период действия патента, отрицательные результаты не следует считать окончательными. Однако точность зависит не только от процедуры консервации образцов фекалий или SpG флотационных растворов, но и от технической квалификации и опыта проведения фекальных исследований пользователя.
Следовательно, были изучены другие методы обнаружения собачьих паразитов в фекалиях. Общепризнано, что одним из наиболее широко используемых подходов к диагностике кишечных гельминтозов у собак является метод FLOTAC, поливалентный, чувствительный и точный метод, который дает точные и надежные результаты для диагностики A. caninum у собак по сравнению с протоколом флотации в пробирке и методом Макмастера19. 23. См. Методы седиментации полезны для извлечения яиц сосальщиков, эмбриональных яиц нематод и большинства яиц ленточных червей, которые не могут быть извлечены на поверхности флотационного раствора, поскольку эти структуры не всплывают24. Одним из методов, который, как было доказано, превосходит методы флотации/седиментации, является модифицированный метод двойной центробежной флотации, поскольку он позволяет обнаруживать цестодные яйца в фекалиях, занимает меньше времени, отделяет яйца Anoplocephala от фекальных остатков и снижает кристаллизацию25. Более того, эта методика успешно используется для обнаружения яиц аскарид с высокой чувствительностью26. Тем не менее, некоторые из этих вышеупомянутых методов и центробежных методов, таких как Ovassay, в отличие от протокола флотации, который мы предлагаем в этом исследовании, требуют консервации образцов в реагентах, таких как формалин, коммерческие наборы, обработки образцов в лабораторных условиях и использования реагентов, таких как сульфат цинка27, которые являются дорогостоящими и требуют специальных процедур утилизации, чтобы избежать токсичности для окружающей среды.
В последнее время предпочтение отдается методам, повышающим чувствительность флотационного метода путем добавления растворов с высоким SpG. Однако необходимо учитывать, что недостатком этих растворов является увеличение мусора в конечном приготовлении и, следовательно, неточное обнаружение яиц паразитов. Кроме того, коммерческая доступность материалов, реагентов, стоимость, вопросы воздействия на окружающую среду и сложность использования центробежных методов влияют на выбор метода флотации14, который может быть сложным в полевых условиях в отличие от протокола, который мы представляем в этой работе. Приготовление флотационных растворов с поваренной солью имеет преимущество перед утилизацией сахара, так как в полевых условиях сахар привлекает насекомых, таких как осы и пчелы, и препараты становятся липкими. Кроме того, такие растворы, как фенол, который добавляется в растворы сахара, чтобы избежать липкости, или ZnSO4, сложно правильно утилизировать в соответствии с рекомендациями по охране окружающей среды, и их нельзя утилизировать в полевых условиях; В отличие от раствора поваренной соли.
Целью данной статьи является демонстрация этапов обнаружения яиц T. canis и Ancylostoma spp. в образцах фекалий с использованием адаптации простого флотационного метода в полевых и лабораторных условиях. В соответствии с описанным протоколом и с использованием микроскопа с резервным аккумулятором диагностика этих зоонозных паразитов собак в сельской и пригородной местности возможна при отсутствии лабораторного оборудования и инфраструктуры. Простой метод флотации, описанный в этой работе, может обеспечить быстрые результаты и является неинвазивным и экономически эффективным методом рутинного скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование и уход за собаками были одобрены Национальным и автономным университетом Мексики.
1. Забор образцов кала
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте собаку с помощью ветеринара или владельца животного.
- В случае одичавших собак (рис. 1А) или нервных животных образцы с земли следует брать сразу после дефекации или не более чем через 10 минут.
- Смажьте хирургические перчатки или тонкостенные полиэтиленовые пакеты водой или вазелином. Для забора образцов кала из прямой кишки надевайте хирургические перчатки или тонкостенные полиэтиленовые пакеты.
- Соберите не менее 2 г фекалий с каждой собаки (рисунок 1Б).
- Определите отдельные образцы фекалий следующим образом: дата, местоположение (координаты глобальной системы позиционирования [GPS] с помощью Google Maps), присвойте идентификационный номер для каждого животного, приблизительный возраст собаки, пол собаки, породу, домашнюю или уличную (дикую) собаку.
- Закройте пакеты, содержащие образец кала, тугим узлом. Храните пакеты в холодильнике (4-8 °C), если образцы кала не были проанализированы в течение 3-4 ч после сбора.
2. Приготовление насыщенного солевого раствора для полевой диагностики
ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступ к весам, измерительному материалу, плите или газу для кипячения воды отсутствует или ограничен, насыщенный солевой раствор можно легко приготовить, используя воду, обычную поваренную соль, пластиковую чашку на 12 унций (355 мл) и пластиковую пустую бутылку из-под газировки объемом 1 л.
- Тщательно вымойте пустую бутылку из-под газировки объемом 1 л. Наполните бутылку 1 л воды.
- Наполните пластиковый стаканчик на 12 унций обычной поваренной солью.
- Переложите соль в бутылку с газировкой.
- Плотно закройте бутылку с газировкой завинчивающейся крышкой. Энергично встряхивайте раствор до тех пор, пока соль не перестанет растворяться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание раствора в бутылке с газировкой до полного растворения соли может занять до 90 минут.
3. Приготовление раствора насыщенной соли для лабораторной диагностики
- Взвесьте 420 г поваренной соли.
- Растворите 420 г соли в 1 л воды.
- Кипятите раствор до тех пор, пока соль не перестанет растворяться.
- Отфильтруйте раствор, чтобы избавиться от нерастворенной соли.
- Проверьте концентрацию раствора с помощью ареометра тяжелой жидкости или денситометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная концентрация имеет SpG 1,20 для достижения лучших результатов (Рисунок 2A). На способность яйца плавать влияет его взаимодействие с раствором, что обуславливает различную способность яиц плавать в растворах с одинаковым удельным весом. Следовательно, для достижения оптимального извлечения яиц важно учитывать верхний диапазон удельного веса во флотационном растворе, гарантируя, что он превосходит удельный вес целевых паразитарных элементов6.
4. Флотационный метод
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы фекалий слишком сухие или твердые, измельчите их в ступке.
- С помощью ложки поместите примерно 3 г кала в один пластиковый стаканчик (~8,5 см в высоту и ~5,5 см в диаметре).
- Добавьте 1 мл насыщенного раствора соли до получения пасты.
- Помешиваем в течение 1 минуты и добавляем 100 мл насыщенного солевого раствора.
- Пропустите эту суспензию через пластиковый фильтр во второй пластиковый стаканчик, чтобы избежать крупных частиц (Рисунок 2B).
- Дать суспензии постоять 15-20 минут.
- Поместите инокуляционную петлю в пламя на 1 с, чтобы убедиться, что в ней нет яиц, цист или ооцист (рис. 2C).
- Подождите 5 с, пока петля посева остынет (рис. 2D).
- Возьмите три капли с поверхности суспензии с помощью инокуляционной петли. Поместите каждую из трех капель отдельно на одно предметное стекло (Рисунок 2E-G)
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что капли не соприкасаются друг с другом (Рисунок 2H). - Наблюдение под микроскопом с помощью 10-кратного объектива (рис. 2I). Разместите покровное стекло, если увеличение увеличено до 40x.
- При наблюдении положительного результата в капле ставят крестик (+) в лабораторном журнале для фиксации наличия паразитов в патентный период в случайных участках поверхности фекальной суспензии.
5. Интерпретация метода флотации
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные результаты не являются окончательными.
- Выполните серию из трех тестов с образцами в течение 3 дней подряд, чтобы повысить чувствительность теста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные результаты свидетельствуют о наличии паразитов в патентном периоде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данной работе описаны коллекционные и копаразитоскопические процедуры для идентификации T. canis и Ancylostoma spp. Обоснование адаптации простого метода фекальной флотации для обнаружения яиц собачьих гельминтов заключается в том, что этот метод является экономически эффективным, поскольку растворы, оборудование и материалы недороги. Таким образом, метод обладает высокой производительностью по обработке образцов, поскольку несколько образцов могут быть обработаны за короткий период времени. Кроме того, простой метод фекальной флотации прост в исполнении и относительно чувствителен.
Размер выборки и выбор животных производились по удобству, определяемому в основном желанием владельца животных и безопасностью приближения одичавших собак. В настоящей работе методом флотации была проведена оценка встречаемости и частоты встречаемости и частоты встречаемости Ancylostoma spp. и T. canis у собак Canis lupus familiaris в Мексике в течение 4 лет, начиная с 2017 года. Образцы фекалий 1638 собак были собраны и подвергнуты микроскопическому скринингу. В общей сложности 1235 собак были инфицированы T. canis и Ancylostoma spp. Одной из целей использования флотационного метода была демонстрация его эффективности в оценке распространенности токсокары или анкилостомы, но мы также стремились провести более глубокое изучение факторов, которые могут повлиять на их распространенность. В результате было выбраковано 185 животных со смешанными инфекциями. Количество положительных проб для Ancylostoma spp. составило 833 (78,95% частоты) и 222 (21,04%) для T. canis. Из 1050 образцов 75,5% (793 пробы) были обработаны и считаны в полевых условиях путем приготовления флотационного раствора с помощью бутылки из-под соды и использования микроскопа с 3 аккумуляторными батареями типа АА 1,2 В в течение 4 часов непрерывной работы. Остальные 257 образцов фекалий были исследованы в лаборатории.
Целью данного исследования было использование флотационного раствора и метода в полевых условиях для ускорения и облегчения диагностики двух гельминтных паразитов собак в районах, где отсутствует лабораторная инфраструктура или оборудование. Применение флотационного метода в полевых условиях позволило нам сообщать результаты 400 владельцам сразу после каждого микроскопического измерения, чтобы дать рекомендации по антигельминтной обработке и профилактическим мерам и, таким образом, избежать распространения паразитов среди людей или животных-компаньонов. Кроме того, метод флотации в полевых условиях позволил обследовать одичавших собак и оказать им антигельминтную обработку с использованием лакомств или корма. На рисунках 3A и 3B показаны яйца T. canis и Ancylostoma spp., соответственно, наблюдаемые после того, как флотационный раствор и техника были проведены в полевых условиях. Когда свежие образцы кала подвергали флотационному методу в полевых условиях, раствор, приготовленный в бутылке из-под газировки, был способен вводить яйца гельминтов во флотацию. Производство кристаллов соли и пузырьков воздуха сравнивали с образцами, прочитанными в лабораторных условиях, и оператор не обнаружил никаких различий. Это наблюдение обнадеживает и ставит под сомнение знание о том, что концентрация образцов фекалий гарантирует более точные микроскопические показания.
Когда флотационный раствор и образцы кала обрабатывались в лабораторных условиях, не было обнаружено никакой разницы в морфологии и четкости показаний под микроскопом, поскольку одинаковое количество мусора плавало одновременно как в полевой, так и в лабораторной копромикроскопической детекции паразитов. На рисунке 3A, B показаны яйца T. canis и Ancylostoma spp., соответственно, извлеченные из 257 образцов, которые были обработаны в полностью оборудованных лабораторных условиях после транспортировки образцов из городских, пригородных и сельских районов. Эти яйца паразитов морфологически не отличались от наблюдаемых в полевых условиях (рис. 3В).
Этот протокол позволил получить достаточное количество данных для оценки влияния местоположения, времени года, пола, породы, возраста, а также условий на открытом воздухе или в помещении у T. canis и Ancylostoma spp. Данные о распространенности сравнивали с помощью критерия ANOVA со значением значимости 0,05. Таблица 2 показывает, что T. canis демонстрировал значительно более высокую частоту распространения в умеренном и сухом климате по сравнению со штатами, характеризующимися теплым климатом, в то время как не было заметных различий в распространенности Ancylostoma spp. в регионах с преобладающим теплым, умеренным или сухим климатом. Кроме того, Ancylostoma spp. и T. canis чаще всего обнаруживаются летом. Установлено, что 60,86% мужчин были положительными на анкилостомоз и 37,38% на токсокароз. Кроме того, T. canis чаще выявляли у щенков в возрасте до 6 месяцев; в то время как Ancylostoma spp. чаще диагностировалась у взрослых собак. Интересно, что никакой разницы между породами собак обнаружено не было. Анкилостомоз заразил 65,54% уличных собак; Тем не менее, T. canis был одинаково обнаружен у собак как на улице, так и в помещении.
Рисунок 1: Забор образцов кала у собак. (А) Необходимо соблюдать осторожность при сборе образцов кала одичавших собак. По возможности свежие фекалии необходимо собирать и хранить в полиэтиленовом пакете для сдачи и копропаразитоскопического анализа в лаборатории. Образцы должны быть охлаждены при температуре 4 °C и помещены в коробки из пенополистирола или изолированные металлические конверты в течение 24 часов после сбора. (Б) В качестве стандарта рекомендуется употреблять три грамма кала; Следовательно, 2-5 г является разумным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Приготовление насыщенного раствора соли и обработка фекальной суспензии для микроскопии. (А) Идеальная плотность насыщенного раствора, приготовленного с солью, должна быть более 1,20. Настоятельно рекомендуется проверить, чтобы на дне не было кристаллов и раствор был прозрачным. (B) Пропускание фекальной суспензии через пластиковое ситечко удаляет крупные частицы. (C) Петля для инокуляции должна быть подвергнута воздействию пламени (лабораторной горелки или обычной портативной зажигалки), чтобы убедиться, что она не загрязнена. (D) Дайте контуру инокуляции остыть и возьмите три капли из разных мест на поверхности суспензии. (E) После того, как первая капля попала на предметное стекло, не перемещайте предметное стекло, чтобы уменьшить просыпание капли. Предметное стекло представляет собой тонкую и прозрачную платформу, позволяющую наблюдать за образцами. (F) Поместите вторую каплю в середину предметного стекла. Взятие второй капли с поверхности фекальной суспензии увеличивает вероятность обнаружения яиц в суспензии, где паразитические структуры могли быть распределены неравномерно. (G) Поместите третью каплю на предметное стекло. Третья капля с поверхности фекальной суспензии позволит наблюдать еще одну область, где могли сконцентрироваться плавающие яйца. (H) Три капли наблюдаются отдельно на предметном стекле для обнаружения яиц нематод из разных областей поверхности фекальной суспензии. (I) Наблюдайте за образцом под микроскопом с помощью 10-кратного объектива. Если цель изменена на 40x, поместите крышку на капли фекальной суспензии. При наблюдении положительного результата в капле назначьте крестик (+) для обозначения наличия паразитов в патентном периоде в случайных участках поверхности фекальной суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Яйца Toxocara canis и Ancylostoma spp., обнаруженные с помощью световой микроскопии с 40-кратным увеличением. (A) Яйца Toxocara canis , обнаруженные с помощью световой микроскопии с 40-кратным увеличением. Метод флотации позволил визуализировать чистые микроскопические поля, свободные от грубых материалов (собранных в полевых условиях). Независимо от способа приготовления флотационного раствора, яйца были видны и в основном наблюдались без морфологических изменений. (B) Яйца Ancylostoma spp., обнаруженные с помощью световой микроскопии с 40-кратным увеличением. Несмотря на то, что концентрирование фекалий не проводилось (в полевых условиях), простой флотационный метод позволил устранить недостатки морфологического обнаружения яиц в фекалиях, когда процедура проводилась по данному методу. (C) Яйца T. canis и Ancylostoma spp., обнаруженные с помощью световой микроскопии с 40-кратным увеличением. Морфологические особенности этих яиц (извлеченных в лабораторных условиях) были ясны, несмотря на то, что концентрация образцов кала не проводилась, и не отличались от яиц, извлеченных в полевых условиях. Масштабные линейки = 75 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Ancylostoma spp. | Токсокара собачья (Toxocara canis) | ||
| Климат | Теплый климат | 38,66А | 22,52А |
| Сухой климат | 29,41А | 36,03А | |
| Умеренный климат | 31,93А | 41.44млрд | |
| Весна | 23,76А | 19,81А | |
| Лето | 49.81млрд | 50.00млрд | |
| Осень | 17,52А | 20,27А | |
| Зима | 8.88С | 9.90С | |
| Род | Мужской | 60,86А | 62,61А |
| Женский | 39.13млрд | 37.38млрд | |
| Возраст | 0-3 месяца | 18,72А | 51,80А |
| 3-6 месяцев | 15,48А | 32.43млрд | |
| > 6 месяцев | 22,44А | 10.36С | |
| > 1 год | 43.33млрд | 5.40С | |
| Порода | Гибрид | 52,78А | 55,86А |
| Чистокровный | 47,22А | 44,14А | |
| Жилищный статус | Комнатный | 34,45А | 52,25А |
| На открытом воздухе | 65,54А | 47.74млрд |
Таблица 2: Распространенность (%) Ancylostoma spp. и Toxocara canis у собак в Мексике в течение 4 лет в зависимости от климата, сезона, пола, возраста, породы и жилищного положения. Данные, полученные из данных, показывают, что нет существенных различий в распространенности Ancylostoma spp. в районах, характеризующихся теплым, умеренным или сухим климатом. Напротив, T. canis демонстрирует значительно более высокую распространенность в умеренном и сухом климате по сравнению с теплым климатом. Кроме того, Ancylostoma spp. и T. canis чаще всего выявляются в летний сезон. Анализ данных также показывает, что 60,86% кобелей дали положительный результат на анкилостомоз, в то время как 37,38% дали положительный результат на токсокароз. Кроме того, T. canis чаще обнаруживается у щенков в возрасте до 6 месяцев, в то время как Ancylostoma spp. чаще встречается у взрослых собак. Интересно, что никаких заметных различий между различными породами собак не наблюдалось. Результаты показывают, что 65,54% собак, живущих на улице, инфицированы анкилостомозом, в то время как T. canis одинаково распространен среди домашних и уличных собак. * Средние значения в столбце фактора (Климат, Сезон, Пол, Возраст, Порода и Условия проживания), за которыми следуют те же буквы, существенно не отличаются при P < 0,05 по тесту ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нематоды, такие как T. canis и Ancylostoma spp., могут обитать в тонком кишечнике собак и потенциально передаваться человеку. Клинические признаки, вызванные T. canis , являются серьезными у молодых собак, проявляясь в виде замедленного роста, проблем с дыханием или поражений пищеварительного тракта28. У взрослых собак инфекция обычно протекает в легкой форме. Диагностика основывается на выявлении характерных яиц в образце фекалий. Это состояние является частой причиной назначения антигельминтного лечения собакам29. Чтобы понять эпидемиологию токсокары, важно признать, что паразит может передаваться от матери к щенку как через плаценту до рождения, так и через сосание в виде галактогенной инфекции вскоре после щенения. Люди могут заразиться T. canis при проглатывании инфекционных яиц, что может произойти различными путями, такими как зараженная почва или шерсть инфицированной собаки. В этом случае люди выступают в качестве паратенических хозяев, и хотя паразитического размножения не происходит, высвобождающиеся личинки из яиц потенциально могут причинить вред, особенно в случае детей30 лет.
Заражение анкилостомой Ancylostoma spp. у собак происходит при проглатывании личинок животными или при проникновении личинок в кожу. Щенки могут заразиться инфекцией при употреблении паратенического хозяина или через лактогенный путь31. Половозрелые анкилостомы питаются кровью, что может привести к тяжелой анемии и желудочно-кишечным симптомам, особенно у молодых собак. Инфекции, происходящие через кожу, приводят к дерматиту, который обычно проходит примерно через неделю после начала инфекции. Применялись различные антигельминтные препараты в сочетании с поддерживающей терапией. Тем не менее, имеются сообщения об устойчивости к антигельминтным препаратам. Анкилостома потенциально может быть патогенной для человека. Чрескожная передача личинок L3 может привести к состоянию, известному как кожная мигрирующая личинка. Эти поражения обычно проходят без лечения в течение нескольких месяцев. В редких случаях собачьи анкилостомы могут мигрировать в желудочно-кишечный тракт человека, вызывая эозинофильный энтерит30.
Точная, экономичная и быстрая диагностика паразитоза у собак имеет важное значение для расширения наших эпидемиологических знаний о гельминтозах собак. По этой причине мы адаптировали протокол простой флотационной техники для использования в полевых условиях для обнаружения T. canis и Ancylostoma spp. Актуальной проблемой, с которой столкнулся нынешний протокол, был сбор образцов у одичавших собак, так как с этими животными обычно трудно обращаться. Таким образом, отбор проб проводился путем наблюдения и наблюдения за собаками до тех пор, пока они не испражнялись, что делало метод отбора проб трудоемким, сложным и в некотором роде опасным. Исходя из нашего опыта, мы настоятельно рекомендуем проводить паразитологические исследования на собаках из приютов.
Что касается извлечения яиц зоонозных гельминтов, то качественная копроскопия по-прежнему остается методом, широко используемым в паразитологической лаборатории в диагностических целях1. Предыдущие исследования показали, что метод флотации с использованием насыщенного солевого раствора более надежен, чем прямая микроскопия. Например, Драйден и его коллеги определили чувствительность 95,15% для яиц Ancylostoma spp. в 206 образцах фекалий, обработанных методом флотации, и 27,18% с помощью прямой микроскопии32. Принято, что плотность флотационного раствора является критическим фактором для флотационного метода 14,20,23. В растворах, которые не достигают этой плотности, паразитным формам требуется больше времени, чтобы всплыть, или они никогда не всплывают. При перенасыщении флотационного раствора он кристаллизуется за пару минут и даже раньше, если покровный слой помещен20.
Выбор флотационного решения в этом протоколе был основан на простоте приготовления, удобстве, стоимости и воздействии на окружающую среду. Несмотря на то, что сахарному раствору требуется больше времени для кристаллизации, следует добавить формалин или фенол в качестве консерванта и уменьшить ощущение липкости или клейкости; что является неудобством в полевых условиях, которые преобладали в данном исследовании. Кроме того, утилизация химических реагентов является сложным вопросом из-за экологических норм. Данные этого исследования показали, что насыщенный раствор, приготовленный из поваренной соли в полевых условиях с использованием бутылки из-под газировки из-за отсутствия лабораторного оборудования для приготовления и кипячения флотационного раствора, был столь же эффективен, как и раствор, приготовленный в лабораторных условиях. Единственное заметное отличие заключается в том, что больше времени требуется для встряхивания бутылки с газировкой до тех пор, пока не станет виден прозрачный раствор. Микроскопические наблюдения были одинаково чистыми для образца, приготовленного с использованием обоих методов для приготовления насыщенного раствора. Важно в будущем провести больше исследований с большим количеством образцов, чтобы подтвердить вышеупомянутое утверждение. Тем не менее, это отнимает много времени и требует физических усилий для встряхивания раствора внутри бутылки в течение нескольких часов. Еще один важный этап протокола состоит в том, чтобы дать фекальной суспензии постоять не менее 15 минут, чтобы яйца могли всплыть и сконцентрироваться на поверхности. Однако, чем дольше время отдыха, тем больше мусора будет плавать и через несколько часов яйца деформируются или разбиваются. Учитывая, что чувствительность и специфичность копропаразитоскопических методов низкие, а точность этих методов как диагностических тестов зависит от навыков пользователя, в настоящем исследовании обученные и опытные паразитологи выполняли флотационную технику и идентифицировали паразитов.
Это исследование, насколько нам известно, является первым, в котором оценивается распространенность Ancylostoma spp. и T. canis у собак в Мексике с использованием образцов фекалий, исследованных методом простой флотации в полевых условиях. Здесь было продемонстрировано, что применяемый нами метод флотации, несмотря на десятилетия его использования, по-прежнему является высокоэффективным, экономичным и быстрым диагностическим тестом14. Тем не менее, существуют копропаразитоскопические методы с более высокой чувствительностью и специфичностью, чем те, которые мы использовали для диагностики гельминтов собак; например, концентрация осадка, как в случае с техникой Фауста. Кроме того, важно отметить, что метод Фауста, который является методом концентрации, также показал себя более эффективным в обнаружении простейших, таких как лямблии33. Тем не менее, копропаразитоскопический метод, который мы выбрали для этого исследования, имел ряд преимуществ, таких как стоимость. Метод Фауста дороже, чем флотация раствором, насыщенным солевым раствором, потому что он требует дополнительного и дорогостоящего оборудования, такого как центрифуга. Другие методы концентрирования, например, с использованием реагентов, таких как сульфат цинка, дороже, чем обычная соль, и требуют больше времени из-за количества необходимых промывок в центрифуге. Таким образом, метод Фауста ограничен для использования в полевых работах, где нет доступа к центрифуге.
Самое главное, что ограничением простого метода флотации является то, что он недостаточно чувствителен для обнаружения ооцист криптоспоридий , цист лямблий или яиц трихуриса . Поэтому при намерении диагностировать эти виды следует использовать методы, использующие процедуры центрифугирования для концентрирования форм паразитов. Важно подчеркнуть, что показатели положительности родов, о которых сообщалось в этом исследовании, не следует рассматривать как окончательные, поскольку в качестве стратегии выборки использовался удобный метод. Важно отметить, что могут возникать ситуации, например, в приютах со сложным содержанием животных, когда выявление гельминтных паразитов у собак становится критически важным. В результате, этот протокол может нуждаться в корректировках в будущем, чтобы приспособиться к сбору комбинированных проб.
В качестве слабого места следует отметить, что простой метод флотации и приготовление насыщенного раствора NaCl были разработаны для конкретной цели - исследовать собачьи фекалии в основном в полевых условиях, - но чувствительность простой процедуры флотации в целом считалась низкой. Поэтому для обнаружения цист или яиц более тяжелых видов паразитов настоятельно рекомендуется использовать метод концентрации. Учитывая низкую чувствительность простого флотационного метода, независимо от того, выполняется ли он в полевых или лабораторных условиях, было разумно усомниться в том, что этот метод будет полезен в качестве метода выбора для эпидемиологических исследований паразитов-гельминтов собак. Тем не менее, высокая распространенность Ancylostoma spp. среди собак в этом исследовании и обнаружение яиц T. canis указывают на то, что простой метод флотации, независимо от того, выполняется ли он в полевых или лабораторных условиях, полезен для получения доказательств, которые могут поддержать дальнейшие эпидемиологические исследования и предложить меры контроля и профилактики для снижения инфицирования собак и людей этими нематодами.
Методом простой флотации мы проанализировали факторы, влияющие на извлечение яиц T. canis и Ancylostoma spp. из собачьих фекалий. Выводы T. canis согласуются с последними исследованиями, которые указывают на то, что паразиты заметно более распространены в умеренных и тропических регионах. Это согласуется с предыдущими исследованиями, в которых изучалось, как факторы окружающей среды, в частности, температура и количество осадков, влияют на экологический ареал видов паразитов 34,35,36. Полученные результаты показали, что оба гельминта поражают самцов в значительно большей пропорции. Разумно предположить, что этот вывод был сделан потому, что мужчины иммунологически менее реактивны на инфекции37,38. Возраст влияет на распространенность T. canis, так как щенки больше поражались этому паразиту. Этот вывод согласуется с более ранними исследованиями, указывающими на то, что этот паразит имеет тенденцию поражать щенков в большей степени, в то время как взрослые особи развивают повышенную резистентность, что приводит к снижению вероятности заражения 6,39. Как помесные, так и чистопородные собаки показали сопоставимую распространенность Toxocara canis и Ancylostoma spp. Тем не менее, одичавшие собаки демонстрировали более высокую распространенность Ancylostoma spp. по сравнению с собаками, проживающими в домашних условиях. Этот вывод противоречит предыдущим отчетам, в которых не было обнаружено различий между породами собак6. Можно сделать вывод, что в будущем применение приготовления насыщенного физиологического раствора и простого флотационного метода, используемого в этом протоколе, может быть проведено для рутинных исследований кала в полевых или лабораторных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность Генеральному директору Асунтос дель Персональная Академия Национального Автономного Университета Мексики за предоставление финансовых ресурсов в виде гранта PAPIIT IN218720 и д-ру Клаудии Мендосе за предоставление запрошенного продления. Эта работа посвящена моей любимой Николь, которая ушла из жизни в 2019 году. Ты всегда будешь жить в моем сердце.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
