Summary
Dette arbeidet beskriver bruken av en flotasjonsmetode for å identifisere Toxocara canis og Ancylostoma spp. oppdaget i fekale prøver samlet inn fra hunder i Mexico fra 2017 til 2021 under feltforhold.
Abstract
Diagnose av hundeparasitter med zoonotisk potensial som Toxocara canis og Ancylostoma caninum under feltforhold er vanligvis vanskelig på grunn av begrenset tilgang til et laboratorium i landlige og forstadsområder i Mexico. Denne studien hadde som mål å oppdage T. canis og Ancylostoma spp. i avføringsprøver samlet inn fra hunder i Mexico fra 2017 til 2021 under feltforhold. Beregning av prøvestørrelse resulterte i en målregistrering av 534 hunder over hele landet.
Prøver ble samlet direkte fra endetarmen eller bakken etter avføring. Prøvene ble oppbevart i individuelle, tett forseglede plastposer ved 4 °C. En mettet løsning av natriumklorid (egenvekt [SpG] 1,20) ble fremstilt både under felt- og laboratorieforhold. Innen 3 dager etter innsamling ble 2-4 g avføring testet for parasitter ved bruk av en flotasjonsmetode ved å suspendere hver fekalprøve i en saltoppløsning. Avføring ble blandet med flotasjonsløsningen og knust ved hjelp av en metallskje.
Når en jevn konsistens ble oppnådd, ble fekalprøven hellet i en ny plastkopp ved hjelp av en sil og tillatt å sitte i 10-15 minutter. Tre dråper fra toppen av blandingen ble samlet ved hjelp av en sterilisert inokuleringssløyfe. Lysbildene ble plassert på mikroskopet og parasitter ble identifisert av trente parasitologer. Fekale prøver fra 1055 hunder ble screenet mikroskopisk. Antall positive prøver for Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % frekvens) og 222 (21,04 %) for T. canis. Disse funnene illustrerer viktigheten av å identifisere zoonotiske helminter hos hunder som bor i urbane og landlige områder i Mexico ved hjelp av en koproparasitoskopisk teknikk i laboratoriet og under feltforhold.
Introduction
Gastrointestinale parasitter er et av de vanligste helseproblemene som påvirker hunder1. Beregninger tyder på at det er ~ 700 millioner husdyr over hele verden, og omtrent 175 millioner kan kategoriseres som frittgående2. Mer enn 60 parasittarter deles mellom hunder og mennesker, noe som tyder på at hunder kan være en kilde til infeksjon for mennesker med disse parasittene3. Toxocara canis og Ancylostoma caninum er to parasittiske arter som infiserer hunder og ved et uhell menneskelige verter. For tiden er det flere studier om stedene der disse helminthene er i stand til å overleve og reprodusere i Mexico. Utbredelsen av Toxocara hos hunder varierer fra 0 % til over 87 % i USA, Mexico, Mellom-Amerika og Karibia4. Toxocara canis og Ancylostoma spp., samt andre parasittiske arter hos hund, er tidligere rapportert i Mexico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (tabell 1).
| Parasittiske arter | Region | Prevalens (%) | Referanse |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Coccidial oocytter | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocephalides | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Tapeworms | Baja California | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabell 1: Regional prevalens (%) av hundeparasitter i Mexico fra 2001 til 2020. Funn fra tidligere undersøkelser utført fra 2001 til 2020 har gjort det mulig å identifisere hundens parasittfordeling over flere urbane og landlige omgivelser i Mexico. Disse studiene gir en dyp forståelse av epidemiologiske elementer som bidrar til persistensen av hundeparasitter i forskjellige økosystemer, og bidrar til en omfattende vurdering av den zoonotiske effekten av noen parasittarter.
Livssyklusstadier av intestinale parasitter, som egg, cyster, oocytter eller larver, finnes i avføringsprøver. Dermed gir undersøkelse av fecal materiale verdifull informasjon om et dyrs parasitter. Behovet for en metode for å oppdage Ancylostomidae-egg i menneskelig avføring førte til bruk av det enkle fekale smøret i 1878, som ble brukt i mange år for å oppdage gastrointestinale parasitter, men ble ansett som ikke veldig følsomme. Dermed oppsto behovet for å utvikle bedre kopromikroskopiske metoder14. Mer enn 100 år har gått siden flotasjonsteknikken for å gjenvinne og telle parasittegg i avføringsprøver først ble beskrevet15. Siden da har flere metoder og varianter av flotasjonsteknikken blitt ansett som en standard for påvisning av noen parasitter i vertene.
For eksempel beskrev Lane en metode i 1924 som involverte den direkte sentrifugalflotasjonsteknikken, som integrerer sentrifugering etterfulgt av flytende sedimentet i en mettet natriumkloridoppløsning med SpG 1.2 i 1 g (Lane) eller 10 g (Stolls modifikasjon). Flotasjonsteknikken ble senere modifisert ved å bruke løsninger med forskjellig SpG14. I 1939 rapporterte Gordon og Whitlock ulempene med Stolls teknikk på grunn av forstyrrelser fra detritus i visualisering av parasittegg og utviklet den kvantitative metoden kjent som McMaster16. I 1979 demonstrerte O'Grady og Slocombe at den spesifikke tyngdekraften til løsningen, timingen og maskestørrelsene til siler påvirker nøyaktigheten av eggdeteksjon ved hjelp av flotasjonsteknikken17. I løpet av de siste tiårene, fordi det er gjort flere modifikasjoner i flotasjonsteknikken, er det et presserende behov for standardisering av flotasjonsmetoder. For tiden er det nødvendig med påvisning av hundehelminthinfeksjoner i sammenheng med forebygging av zoonotiske parasitter for å anvende passende anthelmintiske behandlinger for å begrense miljøforurensning med smittsomme stadier av zoonotiske nematoder18.
Blant kvalitative metoder er fekal flotasjonsteknikken mye brukt og akseptert fordi den ikke krever mye utstyr, er enkel, billig og reproduserbar; Likevel har det en stor ulempe ved at det mangler følsomhet når intensiteten av infeksjonen er lav19. Evnen til å avsløre tilstedeværelsen av et større antall parasittiske elementer som egg, oocytter, cyster eller nematode larver bestemmes vanligvis av tettheten av løsningen20.
Tidligere rapporter har sammenlignet koproparasitologiske teknikker for påvisning av hundens nematodeegg. Med hensyn til påvisning av motile protozoer, brukes direkte fekale smører; Mens sedimenteringsmetoder er nyttige for å diagnostisere tunge egg av parasitter som trematoder21. En av de mest brukte feltbaserte diagnostiske testene er fekal smøremetode. Imidlertid kan det lave følsomhetsnivået til denne teknikken tilskrives det faktum at det inneholder rusk som forstyrrer påvisning av parasittegg. Ved å inkorporere et siktetrinn sammen med løsninger som gir riktig SpG, gir flotasjonsmetoden en klarere og mindre rotete observasjon av askarid og hakeormegg. Dette fører til en mer presis og effektiv prosess for mikroskopisk screening22. På samme måte brukes enkle flotasjons- og direkte sentrifugalflotasjonsteknikker svært ofte for å gjenopprette parasittegg og oocytter14. De klassiske flotasjonsmetodene kan betraktes som kvalitative eller kvantitative avhengig av bruken av et tellekammer som McMaster-metoden15. Likevel, da flotasjonsteknikken har lav følsomhet og fokuserer på påvisning av parasitter i patentperioden, bør negative resultater ikke betraktes som avgjørende. Nøyaktigheten avhenger imidlertid ikke bare av bevaringsprosedyren for fekale prøver eller SpG av flotasjonsløsninger, men avhenger også av teknisk ferdighet og erfaring med å gjennomføre fekale undersøkelser av brukeren.
Følgelig har andre metoder blitt utforsket for påvisning av hundeparasitter i avføring. Det har blitt allment anerkjent at en av de mest brukte tilnærmingene for diagnostisering av tarmhelminthinfeksjoner hos hunder er FLOTAC-teknikken, en multivalent, sensitiv og nøyaktig metode som gir nøyaktige og pålitelige resultater for diagnosen A. caninum hos hunder sammenlignet med en flotasjonsprotokoll i et rør og McMaster-teknikken19, 23. Sedimenteringsmetoder er nyttige for å gjenvinne flukeegg, embryonerte nematodeegg og de fleste bendelormegg, som ikke kan gjenvinnes på overflaten av en flotasjonsløsning fordi disse strukturene ikke flyter24. En metode som har vist seg å være bedre enn flotasjon / sedimenteringsteknikker er Modified Double Centrifugal Flotation-metoden, da den muliggjør påvisning av cestodeegg i avføring, er mindre tidkrevende, skiller Anoplocephala-egg fra fekal rusk og reduserer krystallisering25. Videre har denne teknikken blitt brukt til å oppdage askaride egg med høy følsomhet26. Likevel krever noen av disse nevnte teknikkene og sentrifugalmetodene som Ovassay, i motsetning til flotasjonsprotokollen vi foreslår i denne studien, prøvebevaring i reagenser som formalin, kommersielle sett, prøvebehandling under laboratorieforhold og bruk av reagenser som sinksulfat27 som er dyre og krever spesielle avhendingsprosedyrer for å unngå miljøtoksisitet.
Bruken av teknikker som øker følsomheten til flotasjonsmetoden ved å legge til løsninger med høy SpG har blitt favorisert nylig. Det må imidlertid vurderes at ulempen med disse løsningene er økningen i rusk i den endelige forberedelsen og dermed den unøyaktige påvisningen av parasittegg. I tillegg påvirker kommersiell tilgjengelighet av materialer, reagenser, kostnader, miljøpåvirkningsproblemer og vanskeligheter med bruk av sentrifugalmetoder valget av en flotasjonsteknikk14, noe som kan være utfordrende under feltforhold i motsetning til protokollen som vi presenterer i dette arbeidet. Fremstillingen av flotasjonsløsningene med bordsalt er fordelaktig fremfor utnyttelsen av sukker fordi sukker under feltforhold tiltrekker seg insekter som veps og bier, og preparatene blir klissete. Videre er løsninger som fenol, som tilsettes sukkerløsninger for å unngå klebrighet, eller ZnSO4komplekse for å kaste bort på riktig måte i henhold til miljøvernretningslinjer og kan ikke kastes i feltet; i motsetning til en bordsaltløsning.
Målet med dette manuskriptet er å demonstrere trinnene for å oppdage T. canis og Ancylostoma spp. egg i fekale prøver ved hjelp av en tilpasning av den enkle flotasjonsteknikken under felt- og laboratorieforhold. Etter protokollen som er beskrevet herved og ved hjelp av et mikroskop med et reservebatteri, er diagnosen av disse hundens zoonotiske parasitter i landlige og forstadsområder mulig når laboratorieutstyr og infrastruktur ikke er tilgjengelig. Den enkle flotasjonsmetoden beskrevet i dette arbeidet kan gi raske resultater og er en ikke-invasiv og kostnadseffektiv teknikk for rutinemessig screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk og stell av hunder ble godkjent av National and Autonomous University of Mexico.
1. Innsamling av avføringsprøver
MERK: Håndter hunden ved hjelp av en veterinær eller eieren av dyret.
- Når det gjelder villhunder (figur 1A) eller nervedyr, samle prøver fra bakken rett etter avføring eller ikke mer enn 10 minutter senere.
- Smør kirurgiske hansker eller tynnveggede polyetylenposer med vann eller vaselin. For å samle fekale prøver fra endetarmen, bruk kirurgiske hansker eller tynnveggede polyetylenposer.
- Samle minst 2 g avføring fra hver hund (figur 1B).
- Identifiser individuelle avføringsprøver som følger: dato, sted (GPS-koordinater [Global Positioning System] ved hjelp av Google Maps), tilordne et identifikasjonsnummer for hvert dyr, hundens omtrentlige alder, hundens kjønn, rase, innendørs eller utendørs (feral) hund.
- Lukk posene som inneholder avføringsprøven med en tett knute. Oppbevar posene i kjøleskap (4-8 °C) hvis avføringsprøver ikke analyseres innen 3-4 timer etter oppsamling.
2. Fremstilling av en mettet saltløsning for feltdiagnose
MERK: Hvis tilgang til en balanse, målemateriale, ovner eller gass for å koke vann er fraværende eller begrenset, kan den mettede saltoppløsningen enkelt tilberedes ved hjelp av vann, vanlig bordsalt, en plast 12 oz (355 ml) kopp og en 1 l brus plast tom flaske.
- Vask grundig en tom 1 L brusflaske. Fyll flasken med 1 liter vann.
- Fyll en 12 oz plastkopp med vanlig bordsalt.
- Overfør saltet til brusflasken.
- Lukk brusflasken tett med skrukorken. Rist oppløsningen kraftig til saltet ikke lenger er oppløst.
MERK: Risting av oppløsningen i brusflasken til fullstendig oppløsning av salt kan ta opptil 90 minutter.
3. Fremstilling av en mettet saltløsning for laboratoriediagnose
- Vei 420 g vanlig bordsalt.
- Løs opp 420 g salt i 1 liter vann.
- Kok løsningen til ikke mer salt er oppløst.
- Filtrer oppløsningen for å kaste det uoppløste saltet.
- Kontroller konsentrasjonen av løsningen ved hjelp av et tungt væskehydrometer eller densitometer.
MERK: Den ideelle konsentrasjonen har en SpG på 1,20 for å oppnå bedre resultater (figur 2A). Den flytende evnen til et egg påvirkes av dets interaksjon med løsningen, noe som bidrar til eggets varierende evne til å flyte i løsninger med samme spesifikke tyngdekraft. Derfor, for å oppnå optimal egggjenoppretting, er det viktig å vurdere det øvre området av spesifikk tyngdekraft i flotasjonsløsningen, slik at den overgår den for de målrettede parasittelementene6.
4. Flotasjonsmetode
MERK: Hvis avføringsprøver er for tørre eller harde, macerate dem i en mørtel.
- Bruk en skje, plasser ca. 3 g avføring i en plastkopp (~8,5 cm i høyden og ~5,5 cm i diameter).
- Tilsett 1 ml av den mettede saltoppløsningen til en pasta er oppnådd.
- Rør i 1 min og tilsett 100 ml mettet saltløsning.
- Før denne suspensjonen gjennom en plastsil over i en annen plastkopp for å unngå grove partikler (figur 2B).
- La opphenget stå i 15-20 min.
- Plasser en inokulasjonssløyfe i en flamme i 1 s for å sikre at den er fri for egg, cyster eller oocyster (figur 2C).
- Vent i 5 sekunder til inokulasjonssløyfen er avkjølt (figur 2D).
- Ta tre dråper fra overflaten av suspensjonen med inokulasjonssløyfen. Plasser hver av de tre dråpene separat på ett glassglass (figur 2E-G)
MERK: Forsikre deg om at dråpene ikke er i kontakt med hverandre (figur 2H). - Observer under mikroskopet med et 10x mål (figur 2I). Plasser en følgeseddel hvis forstørrelsen økes til 40x.
- Når et positivt resultat observeres i dråpen, tilordne et kryss (+) i laboratorieloggboken for å registrere tilstedeværelsen av parasitter i patentperioden på tilfeldige steder på fekal suspensjonsoverflaten.
5. Tolkning av flotasjonsmetoden
MERK: Negative resultater er ikke entydige.
- Utfør en serie på tre tester med prøver fra 3 påfølgende dager for å øke testens følsomhet.
MERK: Positive resultater indikerer tilstedeværelsen av parasitter i patentperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet beskrives innsamling og koproparasitoskopiske prosedyrer for identifisering av T. canis og Ancylostoma spp. Begrunnelsen bak tilpasningen av den enkle fekale flotasjonsmetoden for å oppdage hundehelminthegg er at denne teknikken er kostnadseffektiv da løsningene, utstyret og materialene er billige. Metoden har derfor høy prøvehåndteringskapasitet ved at flere prøver kan behandles på kort tid. Dessuten er den enkle fekale flotasjonsmetoden enkel å utføre og relativt følsom.
Prøvestørrelsen og valget av dyr ble gjort av bekvemmelighet bestemt hovedsakelig av villigheten til eieren av dyrene og sikkerheten til nærmer seg villhunder. I dette arbeidet ble flotasjonsmetoden brukt til å vurdere forekomster og frekvenser av Ancylostoma spp. og T. canis hos hunder Canis lupus familiaris i Mexico i løpet av 4 år fra 2017. Fekale prøver fra 1.638 hunder ble samlet inn og screenet mikroskopisk. Totalt 1 235 hunder var positive for T. canis og Ancylostoma spp. Et av målene med å bruke flotasjonsmetoden var å demonstrere effektiviteten i å måle forekomsten av Toxocara eller Ancylostoma, men vi hadde også som mål å gjennomføre en dypere undersøkelse av faktorene som kunne påvirke deres utbredelse. Følgelig ble 185 dyr med blandede infeksjoner kassert. Antall positive prøver for Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % frekvens) og 222 (21,04 %) for T. canis. Av de 1050 prøvene ble 75,5% (793 prøver) behandlet og lest i feltinnstilling ved å forberede flotasjonsløsningen med en brusflaske og bruke et mikroskop med 3 x 1,2 V AA oppladbare batterier for 4 timers kontinuerlig drift. De resterende 257 avføringsprøvene ble undersøkt i laboratoriet.
Et mål med denne studien var å bruke en flotasjonsløsning og en metode i en feltinnstilling for å fremskynde og lette diagnosen av to helminthparasitter av hunder i områder der ingen laboratorieinfrastruktur eller utstyr er tilgjengelig. Feltanvendelsen av flotasjonsmetoden gjorde det mulig for oss å kommunisere funn til 400 eiere umiddelbart etter hver mikroskopiske avlesning for å gi anbefalinger om anthelmintiske behandlinger og forebyggende tiltak, og derfor unngå parasittspredning hos mennesker eller selskapsdyr. På samme måte gjorde flotasjonsteknikken i feltinnstillingen det mulig å undersøke villhunder og gi dem en anthelmintisk behandling ved hjelp av godbiter eller mat. Figur 3A og figur 3B viser egg av henholdsvis T. canis og Ancylostoma spp., observert etter at flotasjonsløsningen og teknikken ble gjort i en feltsetting. Når ferske avføringsprøver ble utsatt for flotasjonsmetoden i en feltinnstilling, var løsningen fremstilt i en brusflaske i stand til å bringe helminthegg i flotasjon. Produksjonen av saltkrystaller og luftbobler ble sammenlignet med prøvene som ble avlest i en laboratorieinnstilling, og ingen forskjell ble påvist av operatøren. Denne observasjonen er oppmuntrende og utfordrer kunnskapen om at konsentrasjonen av fekale prøver garanterer en mer nøyaktig mikroskopisk avlesning.
Når flotasjonsløsningen og avføringsprøvene ble behandlet i en laboratorieinnstilling, ble det ikke oppfattet noen forskjell med hensyn til morfologien og klarheten av avlesningene under mikroskopet, da samme mengde rusk fløt samtidig i både felt- og laboratoriets koprofiloskopiske påvisning av parasitter. Figur 3A,B viser henholdsvis T. canis og Ancylostoma spp. egg fra de 257 prøvene som ble behandlet i et fullt utstyrt laboratorium etter transport av prøver fra urbane, forstads- og landlige områder. Disse parasitteggene skilte seg ikke morfologisk fra de som ble observert under feltforhold (figur 3C).
Denne protokollen genererte et tilstrekkelig antall funn til å vurdere innflytelsen av sted, årstid, kjønn, rase, alder og utendørs eller innendørs forhold i T. canis og Ancylostoma spp. prevalens. Prevalensdata ble sammenliknet med ANOVA-test med signifikansverdi 0,05. Tabell 2 viser at T. canis viste en signifikant høyere distribusjonsfrekvens i tempererte og tørre klima sammenlignet med tilstander preget av varmt klima, mens det ikke var noen merkbar variasjon i prevalensen av Ancylostoma spp. på tvers av regioner med dominerende varme, tempererte eller tørre klima. På samme måte oppdages Ancylostoma spp. og T. canis oftest om sommeren. Det ble funnet at 60,86% av mennene var positive for ancylostomiasis og 37,38% for toksocariasis. Videre ble T. canis hyppigere påvist hos valper under 6 måneder; mens Ancylostoma spp. ble mer diagnostisert hos voksne hunder. Interessant nok ble det ikke funnet noen forskjell mellom hunderaser. Hunden hookworm smittet 65,54% av utendørs hunder; Likevel ble T. canis også oppdaget hos hunder med utendørs eller innendørs status.
Figur 1: Avføringsprøve fra hund. (A) Forsiktighet må utvises ved innsamling av avføringsprøver fra villhunder. Når det er mulig, må fersk avføring samles og oppbevares i en plastpose for innsending og koproparasitoskopisk analyse i laboratoriet. Prøvene må oppbevares i kjøleskap ved 4 °C og legges i isoporbokser eller isolerte metallkonvolutter innen 24 timer etter innsamling. (B) Tre gram avføring anbefales som standard; Derfor er 2-5 g rimelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Fremstilling av mettet saltløsning og prosessering av fekal suspensjon for mikroskopi. (A) Den ideelle tettheten av en mettet løsning laget med salt bør være over 1,20. Det anbefales på det sterkeste å kontrollere at det ikke er krystaller i bunnen og at løsningen er gjennomsiktig. (B) Passerer fekal suspensjon gjennom en plastsil fjerner grove partikler. (C) Inokulasjonssløyfen må utsettes for en flamme (en laboratoriebrenner eller en vanlig bærbar lighter) for å sikre at den er fri for forurensning. (D) La inokulasjonssløyfen avkjøles og ta tre dråper fra forskjellige steder på overflaten av suspensjonen. (E) Etter å ha plassert den første dråpen på glasslysbildet, unngå å flytte lysbildet for å redusere søl av dråpen. Glassglasset gir en tynn og gjennomsiktig plattform som gjør det mulig å observere prøver. (F) Plasser den andre dråpen midt i glassglasset. Å ta en ny dråpe fra overflaten av fekal suspensjon øker sannsynligheten for å finne egg i en suspensjon hvor parasittiske strukturer kan ha vært ujevnt fordelt. (G) Plasser den tredje dråpen på glassglasset. En tredje dråpe fra overflaten av fekal suspensjon vil tillate observasjon av et annet område hvor flytende egg kan ha konsentrert seg. (H) De tre dråpene observeres separat på glassglasset for å oppdage nematodeegg fra forskjellige områder av overflaten av fekal suspensjon. (I) Observer prøven under et mikroskop ved hjelp av 10x-objektivet. Hvis målet endres til 40x, plasser en deksellapp på fekale suspensjonsdråper. Når et positivt resultat observeres i dråpen, tilordne et kryss (+) for å markere tilstedeværelsen av parasitter i patentperioden på tilfeldige steder på fekalsuspensjonsoverflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Egg av Toxocara canis og Ancylostoma spp. påvist ved lysmikroskopi ved 40x forstørrelse. (A) Egg av Toxocara canis detektert ved lysmikroskopi ved bruk av 40x forstørrelse. Flotasjonsmetoden tillot visualisering av rene mikroskopiske felt fri for grove materialer (samlet i feltinnstilling). Uavhengig av metoden for fremstilling av flotasjonsoppløsningen var egg synlige og hovedsakelig observert uten morfologiske endringer. (B) Egg av Ancylostoma spp. oppdaget ved lysmikroskopi ved bruk av 40x forstørrelse. Selv om ingen konsentrasjon av avføring ble utført (i feltinnstilling), adresserte den enkle flotasjonsmetoden manglene ved morfologisk påvisning av egg i avføring når prosedyren ble utført i henhold til denne metoden. (C) Egg av T. canis og Ancylostoma spp. påvist ved lysmikroskopi ved bruk av 40x forstørrelse. Morfologiske trekk ved disse eggene (gjenfunnet i laboratorieinnstilling) var tydelige selv om ingen konsentrasjon av avføringsprøver ble gjort og ikke skilte seg fra eggene som ble gjenfunnet i en feltinnstilling. Skalastenger = 75 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Klima | Varmt klima | 38,66a | 22.52a |
| Tørt klima | 29.41a | 36.03a | |
| Temperert klima | 31.93a | 41,44b | |
| Vår | 23.76a | 19.81a | |
| Sommer | 49,81b | 50.00b | |
| Høst | 17.52a | 20.27a | |
| Vinter | 8,88c | 9,90C | |
| Kjønn | Mannlig | 60,86a | 62,61a |
| Kvinnelig | 39.13b | 37,38b | |
| Alder | 0-3 måneder | 18.72a | 51,80a |
| 3-6 måneder | 15.48a | 32.43b | |
| > 6 måneder | 22.44a | 10,36C | |
| > 1 år | 43.33b | 5,40C | |
| Rase | Crossbred | 52,78a | 55,86a |
| Purebred | 47.22a | 44.14a | |
| Boligstatus | Innendørs | 34.45a | 52,25a |
| Utendørs | 65,54a | 47,74b |
Tabell 2: Prevalens (%) av Ancylostoma spp. og Toxocara canis hos hunder i Mexico i løpet av 4 år i henhold til klima, sesong, kjønn, alder, rase og boligstatus. Indikasjoner fra dataene viser at det ikke er noen signifikant variasjon i forekomsten av Ancylostoma spp. over områder preget av varme, tempererte eller tørre klima. I kontrast viser T. canis en betydelig høyere prevalens i tempererte og tørre klima sammenlignet med varme klima. I tillegg er både Ancylostoma spp. og T. canis oftest identifisert i sommersesongen. Analyse av dataene viser videre at 60,86% av hannhundene testet positivt for ancylostomiasis, mens 37,38% testet positivt for toksocariasis. Videre er T. canis mer vanlig påvist hos valper i alderen mindre enn 6 måneder, mens Ancylostoma spp. er mer utbredt hos voksne hunder. Interessant nok ble det ikke observert merkbare forskjeller mellom ulike hunderaser. Funnene indikerer at 65,54% av utendørs hunder er smittet med hundehakeorm, mens T. canis er like utbredt blant innendørs og utendørs hunder. *Gjennomsnittsverdier innenfor en kolonne av faktoren (Klima, Sesong, Kjønn, Alder, Rase og Bolig) etterfulgt av de samme bokstavene er ikke signifikant forskjellige ved P < 0,05 i henhold til ANOVA Test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nematoder som T. canis og Ancylostoma spp. kan bebo tynntarmen hos hunder og har potensial til å bli overført til mennesker. Kliniske tegn forårsaket av T. canis er alvorlige hos unge hunder, og manifesterer seg som dårlig vekst, luftveisproblemer eller fordøyelseskanallesjoner28. Hos voksne hunder har infeksjonen vanligvis en tendens til å være mild. Diagnosen er avhengig av å identifisere karakteristiske egg i en fekal prøve. Denne tilstanden er en hyppig årsak til forskrivning av anthelmintisk behandling til hunder29. For å forstå epidemiologien til Toxocara, er det viktig å erkjenne at parasitten kan overføres fra mor til valp både gjennom morkaken før fødselen og gjennom suging som en galaktogen infeksjon kort tid etter hvelving. Mennesker kan kontrakt T. canis når inntak av smittsomme egg, som kan oppstå på ulike måter som forurenset jord eller pelsen til en smittet hund. I dette tilfellet fungerer mennesker som parateniske verter, og mens det ikke er noen parasittisk reproduksjon, kan de frigjorte larver fra eggene potensielt forårsake skade, spesielt når det gjelder barn30.
Infeksjon med hookworm Ancylostoma spp. hos hunder oppstår når dyrene inntar larver eller når larver trenger inn i huden. Valper kan få infeksjonen ved å konsumere en paratenisk vert eller gjennom den laktogene banen31. Eldre hakeorm spiser blod, noe som potensielt fører til alvorlig anemi og gastrointestinale symptomer, spesielt hos unge hunder. Infeksjoner som oppstår gjennom huden resulterer i dermatitt, som vanligvis løser omtrent en uke etter infeksjonens begynnelse. Ulike anthelmintiske medisiner har blitt ansatt, ledsaget av støttende terapi. Det har imidlertid vært rapporter om anthelmintisk resistens. Ancylostom har potensial til å være patogen for mennesker. Den transkutane overføringen av L3 larver kan føre til en tilstand som kalles kutan larve migrans. Disse lesjonene forsvinner vanligvis uten behandling i løpet av noen måneder. I sjeldne tilfeller kan hundehakeorm migrere inn i den menneskelige mage-tarmkanalen, indusere eosinofil enteritt30.
Den nøyaktige, økonomiske og raske diagnosen parasitose hos hunder er avgjørende for å øke vår epidemiologiske kunnskap om hundehelminthiaser. Av denne grunn tilpasset vi en protokoll for den enkle flotasjonsteknikken som skal brukes i en feltinnstilling for å oppdage T. canis og Ancylostoma spp. Et relevant problem i den nåværende protokollen var innsamling av prøver fra villhunder, da disse dyrene vanligvis er vanskelige å håndtere. Derfor ble prøvetaking gjort ved å observere og følge hundene til de gjorde sitt fornødne, noe som gjorde prøvetakingsmetoden tidkrevende, utfordrende og på en eller annen måte farlig. Ifølge vår erfaring anbefaler vi sterkt å vurdere parasitologiske studier hos omplasseringshunder.
Når det gjelder zoonotisk helminth eggutvinning, fortsetter kvalitativ koproskopi å være metoden som vanligvis brukes i parasitologilaboratoriet for diagnostiske formål1. Tidligere studier har funnet at flotasjonsteknikken ved hjelp av en mettet saltløsning er mer pålitelig enn direkte mikroskopi. For eksempel bestemte Dryden og medarbeidere en sensitivitet på 95,15% for Ancylostoma spp. egg i 206 fekale prøver behandlet av flotasjonsteknikken og 27,18% ved direkte mikroskopi32. Det aksepteres at flotasjonsløsningens tetthet er en kritisk faktor for flotasjonsmetoden 14,20,23. I løsninger som ikke når den tettheten, tar de parasittiske formene lengre tid å flyte eller aldri flyte. Når en flotasjonsløsning er overmettet, krystalliserer den om et par minutter og enda tidligere hvis et deksel er plassert20.
Valget av flotasjonsløsning i denne protokollen var basert på enkel forberedelse, bekvemmelighet, kostnad og miljøpåvirkning. Selv om sukkeroppløsningen tar lengre tid å krystallisere, bør formalin eller fenol tilsettes som konserveringsmiddel og redusere klebrig eller limaktig følelse; som er en ulempe under de feltforhold som rådet i denne studien. Videre er avhending av kjemiske reagenser et komplekst problem på grunn av miljøforskrifter. Data i denne studien viste at den mettede løsningen fremstilt med vanlig bordsalt under feltforhold ved bruk av en brusflaske på grunn av mangel på tilgjengelighet av laboratorieutstyr for å forberede og koke en flotasjonsløsning, var like effektiv som den som ble fremstilt i en laboratorieinnstilling. Den eneste merkbare forskjellen er jo lengre tid det tar å riste brusflasken til en gjennomsiktig løsning kan sees. Mikroskopiske observasjoner var like rene for prøven fremstilt ved bruk av begge metodene for å fremstille den mettede løsningen. Det er viktig å utføre flere studier i fremtiden med et større antall prøver for å bekrefte den nevnte uttalelsen. Likevel er det tidkrevende og krever fysisk innsats for å riste løsningen inne i flasken i flere timer. Et annet kritisk trinn i protokollen består av å la fekal suspensjon stå i minst 15 minutter for å la eggene flyte og konsentrere seg på overflaten. Men jo lengre hviletiden, jo mer rusk vil flyte og etter noen timer vil eggene deformeres eller bryte. Tatt i betraktning at følsomheten og spesifisiteten til koproparasitoskopiske metoder er lav, og at nøyaktigheten av disse metodene som diagnostiske tester avhenger av brukerens ferdigheter, utførte trente og erfarne parasitologer i den nåværende studien flotasjonsteknikken og identifiserte parasittene.
Denne studien, så vidt vi vet, er den første som estimerer forekomsten av Ancylostoma spp. og T. canis hos hunder i Mexico ved hjelp av fekale prøver undersøkt med den enkle flotasjonsmetoden i en feltinnstilling. Det ble her demonstrert at flyteteknikken vi brukte, til tross for tiårene den har vært i bruk, fortsatt er en svært effektiv, økonomisk og rask diagnostisk test14. Likevel er det koproparasitoskopiske teknikker med høyere følsomhet og spesifisitet enn den vi brukte til diagnose av hundehelminter; slik som sedimentasjonskonsentrasjonen, slik tilfellet er med Faust-teknikken. Videre er det viktig å merke seg at Faust, som er en konsentrasjonsmetode, også har vist seg å være mer effektiv i påvisning av protozoer som Giardia33. Likevel hadde den koproparasitoskopiske metoden vi valgte for denne studien flere fordeler som kostnad. Faust-teknikken er dyrere enn flotasjon med saltvannsmettet løsning fordi den krever ekstra og dyrt utstyr som en sentrifuge. Andre konsentrasjonsmetoder, som de som bruker reagenser som sinksulfat, er dyrere enn vanlig salt og trenger mer tid på grunn av antallet nødvendige vasker i sentrifugen. Derfor er Faust-teknikken begrenset for bruk i feltarbeid der det ikke er vanlig med tilgang til sentrifuge.
Viktigst av alt, en begrensning av den enkle flotasjonsteknikken er at den ikke er følsom nok til å oppdage Cryptosporidium-oocyster, Giardia-cyster eller Trichuris-egg. Teknikker som bruker sentrifugeringsprosedyrer for å konsentrere parasittformer bør derfor brukes hvis diagnosen av disse artene er ment. Det er viktig å fremheve at positivitetsratene for slektene rapportert i denne studien ikke bør betraktes som entydige fordi en bekvemmelighetsmetode ble brukt som utvalgsstrategi. Det er viktig å merke seg at det kan være situasjoner, for eksempel i krisesentre med utfordrende dyreforvaltning, der det blir avgjørende å identifisere helmintparasitter hos hunder. Som et resultat kan denne protokollen trenge justeringer i fremtiden for å imøtekomme samlingen av kombinerte prøver.
Som et svakt punkt bør det bemerkes at den enkle flotasjonsmetoden og fremstillingen av den mettede løsningen av NaCl ble utviklet for et bestemt formål - å undersøke hundens avføring under det meste feltforhold - men følsomheten til den enkle flotasjonsprosedyren har generelt blitt ansett for å være lav. Derfor, for å oppdage cyster eller egg av tyngre parasittarter, anbefales bruk av en konsentrasjonsteknikk sterkt. Gitt den lave følsomheten til den enkle flotasjonsmetoden, uansett om den utføres i felt- eller laboratorieinnstilling, var det rimelig å tvile på om denne teknikken ville være nyttig som en metode for valg for epidemiologiske studier av hundens helminthparasitter. Ikke desto mindre indikerer den høye Ancylostoma spp. prevalensen hos hunder i denne studien og påvisning av T. canis-egg at den enkle flotasjonsmetoden, enten den utføres i felt- eller laboratorieinnstilling, er nyttig for å gi bevis som kan støtte videre epidemiologiske studier og foreslå kontroll og forebyggende tiltak for å redusere infeksjonen av hunder og mennesker med disse nematodene.
Ved hjelp av den enkle flotasjonsmetoden analyserte vi faktorene som påvirker T. canis og Ancylostoma spp. eggutvinning fra hundens avføring. T. canis-funnene var i samsvar med den nyeste forskningen som indikerer at parasitter er spesielt mer utbredt i tempererte og tropiske områder. Dette stemmer overens med tidligere studier som har undersøkt hvordan miljøfaktorer, spesielt temperatur og nedbør, påvirker det økologiske spekteret av parasittarter 34,35,36. De nåværende resultatene viste at begge helminthene smitter menn i en betydelig høyere andel. Det er rimelig å spekulere i at dette funnet skyldtes at menn er immunologisk mindre reaktive mot infeksjoner37,38. Alder påvirker forekomsten av T. canis da valper ble mer påvirket av denne parasitten. Dette funnet stemmer overens med tidligere forskning som indikerer at denne parasitten har en tendens til å påvirke valper i større grad, mens voksne utvikler økt motstand, noe som resulterer i en lavere sannsynlighet for infeksjon 6,39. Både crossbred og renrasede hunder viste sammenlignbar prevalens av Toxocara canis og Ancylostoma spp. Imidlertid viste villhunder en høyere forekomst av Ancylostoma spp. sammenlignet med hunder bosatt i hjemlige omgivelser. Dette funnet er i strid med tidligere rapporter som ikke påviste forskjeller mellom hunderaser6. Det kan konkluderes med at fremtidige anvendelser av fremstillingen av mettet saltoppløsning og den enkle flotasjonsmetoden som brukes i denne protokollen, kan utføres for rutinemessige fekale undersøkelser under felt- eller laboratorieforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Dirección General de Asuntos del Personal Académico ved Universidad Nacional Autónoma de México for å gi de økonomiske ressursene gjennom tilskudd PAPIIT IN218720 og til Dr. Claudia Mendoza for å gi den forespurte forlengelsen. Dette verket er dedikert til min vakre Nicole, som gikk bort i 2019. Du vil alltid leve i mitt hjerte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
