عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

Summary

في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا عزل السكان من الخلايا الجذعية البالغة، ووصف الخلايا الجذعية المشتقة الدهنية أو ASCS، من الأنسجة الدهنية. توضح هذه المقالة عزلة ASCS من lipoaspirates باستخدام دليل، بروتوكول الهضم الأنزيمية باستخدام كولاجيناز.

Abstract

في عام 2001، وصف الباحثون في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، وعزل السكان جديدة من الخلايا الجذعية البالغة من liposuctioned الأنسجة الدهنية التي أسموه في البداية خلايا Lipoaspirate المصنعة أو خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. منذ ذلك الحين، تم إعادة تسمية هذه الخلايا الجذعية الخلايا الجذعية الدهنية كما مشتقة أو ASCS وذهبت لتصبح واحدة من خلايا جذعية للبالغين الأكثر شعبية للسكان في مجالات أبحاث الخلايا الجذعية والطب التجديدي. وصف الآلاف من المقالات الآن استخدام ASCS في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجدد، بما في ذلك تجديد العظام، وإصلاح الأعصاب الطرفية والهندسة القلب والأوعية الدموية. وقد بدأت المقالات الأخيرة لوصف عدد لا يحصى من الاستخدامات لASCS في العيادة. ويحدد البروتوكول هو موضح في هذه المقالة الإجراء الأساسي لليدويا وإنزيمي عزل ASCS من كميات كبيرة من lipoaspirates تم الحصول عليها من الإجراءات التجميلية. يمكن بسهولة أن تحجيم هذا البروتوكول أعلى أو لأسفل لaccommodأكلت حجم lipoaspirate ويمكن تكييفها لعزل ASCS من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من خلال abdominoplasties وإجراءات أخرى مماثلة.

Introduction

في عام 2001، وقد وصفت مجموعة من السكان المفترضة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من الأنسجة الدهنية في مجلة هندسة الأنسجة ^1. أعطيت هذه الخلايا اسم معالجتها Lipoaspirate أو جيش التحرير الشعبى الصينى الخلايا بسبب اشتقاقها من الأنسجة المصنعة lipoaspirate الحصول عليها من خلال الجراحة التجميلية. واستند أسلوب العزل الموضحة في هذه المقالة على الاستراتيجيات القائمة الأنزيمية للعزلة من انسجة الوعائية الكسر (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية ^2. تم تعريف صندوق التبرعات الخاص باعتباره الحد الأدنى من السكان معالجة خلايا الدم الحمراء، والخلايا الليفية، الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء، pericytes وقبل الخلايا الشحمية التي لم تنضم إلى ثقافة الركيزة الأنسجة ^{2، 3.} ويقترح زراعة هذا SVF مع مرور الوقت للقضاء على العديد من هؤلاء السكان الخلية تلويث ويؤدي إلى ملتصقة والسكان ليفية. وقد تم تحديد هذه الخلايا الليفية في الأدب على مدى السنوات ال 40 الماضية بأنها مرحلة ما قبلالخلايا الشحمية. ومع ذلك، أظهر فريق بحثنا أن هذه الخلايا تمتلك أرومية متوسطة multipotency وإعادة تسمية السكان SVF ملتصقة باسم خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى. وأضافت دراسات لاحقة من قبل العديد من المجموعات البحثية الأخرى لهذه الإمكانات، مما يشير إلى كل من الأديم الباطن وإمكانات الأدمة (للمراجعة انظر ^4). منذ ذلك الوقت، ظهرت العديد من الشروط الإضافية لهذه الخلايا في الأدب. من أجل توفير نوع من التوافق في الآراء، اعتمد مصطلح الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة أو ASCS في المؤتمر ^الثاني IFATS السنوية 2. على هذا النحو، سيتم استخدام ASC المدى في هذه المقالة.

بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة هو إجراء بسيط نسبيا والتي تتطلب معدات المختبرات القياسية ويستخدم الكواشف بسيطة مثل الفوسفات مخزنة المالحة والكواشف وسائل الاعلام زراعة الأنسجة القياسية وكولاجيناز. ويمكن ان تنتج أعداد كبيرة من ASCS اعتمادا على كمية من النسيج الدهني بدءا حجم وج اللاحقةالوقت ulture. ومع ذلك، فإن معالجة مثل هذا المبلغ الكبير من الأنسجة الدهنية يمكن أن تقدم بعض القضايا المادية التي يمكن تخفيفها إلى درجة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول لا تتطلب مرافق زراعة الأنسجة عقيمة واغطية وافق السلامة الأحيائية، مما يجعل من الضروري استخدام مرفق زراعة الأنسجة المعتمدة. يمكن هذا الشرط أيضا خفض فائدة السكان ASC في التطبيقات السريرية ما لم يتم عزل كانوا في الممارسات التصنيعية الجيدة مرافق (GMP) وافق المصممة لعزل وتوسيع المواد للاستخدام السريري. كبديل، فإن النظم الآلية التي يمكن عزل ASCS في نظام مغلق في غرفة العمليات تجنب هذه المسألة الأساسية والسماح للاستخدام الفوري من ASCS دون أي حاجة لاحقة التوسع في المختبر. حتى الآن، هناك ستة النظم الآلية المتوفرة تجاريا لعزل الخلايا من الأنسجة البشرية. هذه الأنظمة قد تجعل من الممكن عزلعدد كبير من ASCS من كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية التالية الحصاد على الفور. ويمكن عندئذ أن يعيد هذه ASCS في جسم المريض لمجموعة متنوعة من الأغراض دون التجدد المريض الاضطرار إلى مغادرة غرفة العمليات. بالإضافة إلى هذا البروتوكول يصف العزلة دليل ASCS، وتعطى بروتوكول لعزل الآلي ASCS باستخدام نظام Celution أيضا في مقال مصاحب.

Protocol

بروتوكول المعروضة هنا يصف العزلة دليل ASCS من lipoaspirates الحصول عليها من خلال العمليات التجميلية باستخدام الهضم الأنزيمي والتفاضلية الطرد المركزي. تم نشر هذا البروتوكول لأول مرة في مجلة هندسة الأنسجة في عام 2001 1، حيث كانت تسمى الخلايا الناتجة خلايا Lipoaspirate المصنعة أ…

Representative Results

مخطط بروتوكول أعلاه يصف، طريقة الأنزيمية دليل للعزلة من صندوق التبرعات الخاص من عينة كبيرة الحجم lipoaspirate. في هذا SVF العديد من سكان الخلية، بما في ذلك ASC. العديد من الدراسات تقترح أن زراعة هذا صندوق التبرعات الخاص في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية سنختار السكان الليفية …

Discussion

الأنسجة الدهنية لعزل ASCS يمكن أن يأتي في أشكال كثيرة: من قطعة صلبة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من خلال استئصال أو رأب الشحم إلى قطع أصغر الحصول عليها عن طريق إما استخراج حقنة أو بمساعدة شفط رأب الشحم (أي شفط الدهون). ما إذا كان المزيد من الخلايا صندوق التبرعات ا?…

Materials

			Reagent
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline)	Mediatech Cellgro	25-053-CI	without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)	Sigma	C2674	crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated	Gemini Bioproducts	100106	USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-104
25 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes	Genesee Scientific	21-106
100 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-202
150 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-203
500 ml Stericup Filter Units	Millipore	SCGPU05RE	PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers	FisherBrand	22-363-549	100 μm nylon mesh
dexamethasone – water soluble	Sigma	D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate	Sigma	A-8960
β-glycerophosphate disodium salt	Sigma	G-9422	also known as glycerophosphate
insulin	Sigma	I-6634	made from bovine pancreas
indomethacin	Sigma	I-7378
apo-transferrin	Sigma	T-4382
TGFβ1	R&D Systems	240-B-002	recombinant human
Oil Red O	Sigma	O-0625
Alcian Blue	Sigma	A-5268
Silver nitrate	Sigma	S-0319
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	supplied as a 16 % stock
			[header]
			Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood	Thermo Scientific		ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge	Hermle Labnet	Z383	Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	5-10L capacity, capable of 37 C
Automated Pipette Aids	Drummond Pipette Aid XL	4-000-105
CO2 Incubator	Thermo Scientific	Forma 310	direct heat or water jacketed