Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani
Summary
Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.
Abstract
Nel 2001, i ricercatori della University of California, Los Angeles, ha descritto l'isolamento di una nuova popolazione di cellule staminali adulte dal tessuto adiposo liposuzione che inizialmente chiamati celle lipoaspirato trasformati o cellule PLA. Da allora, queste cellule staminali sono stati rinominati in cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC e sono andati a diventare uno dei più popolari popolazioni di cellule staminali adulte nel campo della ricerca sulle cellule staminali e la medicina rigenerativa. Migliaia di articoli ora descrivono l'uso di ASC in una varietà di modelli animali di rigenerazione, compreso rigenerazione ossea, la riparazione dei nervi periferici e ingegneria cardiovascolare. Articoli recenti hanno cominciato a descrivere la miriade di usi per ASC nella clinica. Il protocollo illustrato in questo articolo è descritta la procedura di base per mano e enzimaticamente isolare ASC da grandi quantità di lipoaspirato ottenuti da procedure cosmetiche. Questo protocollo può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso per alloggiomangiato il volume di lipoaspirato e può essere adattato per isolare ASC dal tessuto grasso ottenuti attraverso abdominoplasties e in altri procedimenti analoghi.
Introduction
Nel 2001, una popolazione putativo di cellule staminali multipotenti dal tessuto adiposo è stato descritto nella Tissue Engineering 1 rivista. Queste cellule sono stati dati i nomi trasformati lipoaspirato o PLA cellule a causa della loro derivazione dal tessuto lipoaspirato trasformati ottenuti attraverso la chirurgia estetica. Il metodo di isolamento descritto in questo articolo è stato basato sulle strategie enzimatiche esistenti per l'isolamento della frazione stromale vascolare (SVF) dal tessuto adiposo 2. Il SVF è stata definita come una popolazione minimamente trasformati dei globuli rossi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti e pre-adipociti che devono ancora aderire ad una cultura substrato tessuto 2, 3. Coltura di questa SVF nel tempo si propone di eliminare molte di queste popolazioni cellulari contaminanti e provocare un aderente, popolazione fibroblastica. Questi fibroblasti sono stati identificati in letteratura per gli ultimi 40 anni ad essere pre-adipociti. Tuttavia, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che queste cellule possedevano mesodermal multipotency e rinominato la popolazione SVF aderenti come cellule PLA. Studi successivi da numerosi altri gruppi di ricerca hanno aggiunto a questo potenziale, proponendo sia endodermico e potenziali ectodermica (per la recensione vedi 4). Da allora, numerosi termini supplementari per queste cellule sono apparsi in letteratura. Al fine di fornire un certo tipo di consenso, il termine di cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC è stata adottata in occasione della conferenza annuale nd IFATS 2. Come tale, il termine ASC verrà utilizzato in questo articolo.
Il protocollo descritto in questo articolo è una procedura relativamente semplice che richiede attrezzature di laboratorio standard e utilizza reagenti semplici come soluzione salina fosfo-buffered, reagenti mezzi di coltura dei tessuti standard e collagenasi. Si può produrre un gran numero di ASC seconda della quantità di volume del tessuto adiposo di partenza e successiva ctempo ulture. Tuttavia, il trattamento di una tale quantità di tessuto adiposo può presentare alcuni problemi fisici che possono essere attenuato utilizzando questo protocollo. Inoltre, questo protocollo richiede tessuti sterili strutture di coltura e le cappe di biosicurezza approvati, richiedano quindi l'uso di un impianto di coltura tissutale approvato. Questo requisito può anche diminuire l'utilità della popolazione ASC in applicazioni cliniche meno che non siano isolati in buone pratiche di fabbricazione (GMP strutture) approvati progettati per l'isolamento e l'espansione di materiali per uso clinico. In alternativa, sistemi automatizzati in grado di isolare ASC in un sistema chiuso in sala operatoria sarebbe evitare questo problema fondamentale e consentire l'utilizzo immediato di ASC, senza necessità di successiva espansione in vitro. Ad oggi, ci sono sei sistemi automatizzati che sono disponibili in commercio per l'isolamento di cellule da tessuto umano. Questi sistemi possono consentire di isolare unnumero significativo di ASC di grandi quantità di tessuto adiposo subito dopo il suo raccolto. Questi ASC potrebbero poi essere reintrodotti nel paziente per una varietà di scopi rigenerativi, senza che il paziente dover mai lasciare la sala operatoria. In aggiunta a questo protocollo descrive l'isolamento manuale di ASC, un protocollo per l'isolamento automatizzato di ASC utilizzando il sistema Celution è data anche in un altro articolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tessuto adiposo per l'isolamento di ASC può venire in molte forme: da pezzi solidi di tessuto ottenuti con la resezione o liposuzione in piccoli pezzi ottenuti attraverso sia l'estrazione siringa o liposuzione aspirazione assistita (cioè liposuzione). Se le cellule più SVF (e quindi ASC) possono essere ottenuti da campioni adiposi resecati o aspirati non è chiaro come gli studi contrastanti sono stati presentati 16, 17. E 'possibile che sia sotto forma di tessuto adiposo è più ad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare e ringraziare quei personale di ricerca aggiuntivi che hanno contribuito allo sviluppo del protocollo descritto e il suo isolamento di ASC, tra cui: Dr. H. Peter Lorenz, MD, il dottor Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, e il dottor John Fraser, PhD. I risultati presentati sono stati finanziati, in parte, da borse di ricerca dal National Institutes of Health, compresi i NIAMS e NIDCR Istituti.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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