인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리
Summary
2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.
Abstract
2001 년에, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스의 연구자들은 초기 가공 Lipoaspirate 세포 또는 PLA 세포를 지칭 liposuctioned 지방 조직에서 성체 줄기 세포의 새로운 인구의 격리를 설명했다. 그 후,이 줄기 세포는 지방 – 유래 줄기 세포 또는부터 ASC로 개명 된 줄기 세포 연구 및 재생 의학 분야에서 가장 인기있는 성체 줄기 세포 집단 중의 하나가되기 위하여 갔다. 기사의 수천은 지금 뼈 재생, 말초 신경 수리 및 심장 혈관 엔지니어링을 포함하여 재생 동물 모델의 다양한부터 ASC를 사용하는 방법을 설명합니다. 최근 기사는 병원에서부터 ASC를위한 용도의 무수한을 설명하기 시작했다. 이 문서에 나와있는 프로토콜을 수동 및 효소 화장품 절차에서 얻은 lipoaspirates 많은 양에서부터 ASC를 분리하기위한 기본 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 확대 또는 축소 accommod 아래로 할 수있다lipoaspirate의 볼륨을 먹고 복부 성형술 및 기타 유사한 절차를 통해 얻은 지방 조직에서부터 ASC를 분리하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
2001에서, 지방 조직에서 다 능성 줄기 세포의 추정 인구는 저널 조직 공학 1에 기재 하였다. 이 세포는 성형 수술을 통해 얻은 처리 lipoaspirate 조직에서 자신의 유도에 의한 이름 가공 Lipoaspirate 또는 PLA 세포를 부여했다. 이 문서에서 설명하는 분리 방법은 지방 조직 2의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리에 대한 기존의 효소 전략을 기반으로했다. SVF는 조직 배양 기판 (2, 3)에 밀착 아직 적혈구 세포, 섬유 아세포, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포와 전 지방 세포의 최소 처리 인구로서 정의되었다. 시간이 지남에 따라이 SVF의 배양은 이러한 오염 된 세포 집단의 대부분을 제거하고 부착 성, 섬유 아세포의 집단 발생하는 것이 제안된다. 이러한 섬유 아 세포는 미리 것으로 지난 40 년 동안 문헌에서 확인 된지방 세포. 그러나, 우리의 연구 그룹은이 세포가 중배엽 다 능성을 보유하고 PLA 세포로 부착 SVF 인구 이름 것을 보여 주었다. 많은 다른 연구 그룹에 의해 후속 연구 (리뷰가 4 참조) 내배엽과 외배엽의 잠재력을 모두 제안하고,이 잠재력을 추가했습니다. 그 이후로,이 세포에 대한 많은 추가적인 조건이 문헌에 등장했다. 컨센서스의 일부 유형을 제공하기 위하여, 용어 지방 – 유래 줄기 세포 또는부터 ASC는 2 차 연례 IFATS 회의에서 채택되었다. 따라서, 용어 ASC는이 문서에서 사용됩니다.
이 문서에서 설명하는 프로토콜은 표준 실험실 장비를 필요로하고 포스 완충 식염수, 표준 조직 문화 미디어 시약 및 콜라게나 간단한 시약을 사용하는 비교적 간단한 절차입니다. 이것은 지방 조직 부피와 후속 C의 개시 량에 따라부터 ASC 다수 생성 할ulture 시간. 그러나, 지방 조직 등의 대량의 처리는이 프로토콜을 사용하는 정도로 완화 될 수있는 물리적 인 문제를 제시 할 수있다. 또한,이 프로토콜함으로써 승인 된 조직 문화 시설의 사용을 필요로 무균 조직 배양 시설과 승인 된 바이오 안전성 후드를 요구한다. 그들은 좋은 제조 연습 임상 사용의 분리 및 재료의 확장을위한 설계 (GMP) 승인 시설에서 격리하지 않은 경우,이 요구 사항은 임상 응용 프로그램에서 ASC 인구의 유용성을 감소시킬 수있다. 다른 방법으로 운영 극장에서 닫힌 시스템에서부터 ASC를 분리 할 수 있습니다 자동화 시스템은이 중요한 문제를 피할 것이다 이후 체외 확장에 대한 필요없이부터 ASC의 즉시 사용할 수 있습니다. 지금까지 인간의 조직에서 세포의 분리를 위해 상업적으로 이용 가능하다 여섯 자동화 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 가능하게 격리 할 수있다즉시 수확을 다음과 지방 조직의 양이 많은부터 ASC의 상당수. 이러한부터 ASC는 지금 수술실을 떠나지 환자없이 재생하는 다양한 목적을 위해 환자에 재 도입 될 수있다. 부터 ASC를 수동으로 분리를 설명하는이 프로토콜뿐만 아니라, Celution 시스템을 사용부터 ASC의 자동 분리를위한 프로토콜은 또한 동반자 문서에 나와있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
부터 ASC의 절연을위한 지방 조직은 여러 가지 형태가 있습니다 : 주사기 추출 또는 흡입 보조 lipoplasty (즉, 지방 흡입) 중 하나를 통해 얻은 작은 조각으로 절제 또는 lipoplasty을 통해 얻은 조직의 단단한 조각에서. 충돌하는 연구는 16, 17를 제시 한 것처럼 더 SVF 세포 (이에부터 ASC)가 절제된 또는 흡입 지방 샘플에서 얻을 수 있는지 여부는 불분명하다. 그것은 지방 조직의 형태 중 하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인정하고자하는 등 기술 된 프로토콜 및부터 ASC의 그 분리의 발전에 기여하는 추가 연구 인력 감사 : 박사 H. 피터 로렌스, MD, 박사 히로시 Muzuno, MD, 박사 제리 황, MD를 박사 아담 카츠, MD, 박사 윌리엄 푸트 렐, MD, 박사 룽 장, DDS, 박사, 박사 라리사로드 리 게스, MD, 박사 제니 알폰소, 박사, 박사 존 프레이저, 박사. 발표 결과는 NIAMS와 NIDCR 연구소를 포함하여 건강의 국립 연구소에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 투자되었다.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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