Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos
Summary
En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.
Abstract
En 2001, investigadores de la Universidad de California, Los Ángeles, describen el aislamiento de una nueva población de células madre adultas de tejido adiposo por liposucción que inicialmente denominan células lipoaspirado procesados o células del EPL. Desde entonces, estas células madre se han renombrado como células o ASC madre derivadas de tejido adiposo y han pasado a convertirse en una de las poblaciones de células madre adultas más populares en el campo de la investigación con células madre y la medicina regenerativa. Miles de artículos ahora describen el uso de ASC en una variedad de modelos animales de regeneración, incluyendo la regeneración del hueso, la reparación del nervio periférico y la ingeniería cardiovasculares. Artículos recientes han comenzado a describir la miríada de usos para las ASC en la clínica. El protocolo se muestra en este artículo se describe el procedimiento básico para la mano y el aislamiento de las ASC enzimáticamente a partir de grandes cantidades de lipoaspirates obtenidos de los procedimientos cosméticos. Este protocolo se puede escalar fácilmente hacia arriba o hacia abajo para accommodcomió el volumen de lipoaspirado y puede ser adaptado para aislar las ASC de tejido graso obtenidos a través de abdominoplastías y otros procedimientos similares.
Introduction
En el año 2001, una población putativo de células madre multipotentes a partir de tejido adiposo se describe en la revista Tissue Engineering 1. Estas células se les dio el nombre de Procesado células lipoaspirado o PLA, debido a su derivación a partir de tejido lipoaspirado procesado obtenidos a través de la cirugía estética. El método de aislamiento se describe en este artículo se basa en las estrategias enzimáticas existentes para el aislamiento de la fracción del estroma vascular (SVF) a partir de tejido adiposo 2. El SVF se ha definido como una población mínimamente procesado de las células rojas de la sangre, fibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos y pre-adipocitos que aún tienen que adherirse a un sustrato de cultivo de tejido 2, 3. Se propone El cultivo de esta SVF con el tiempo para eliminar muchas de estas poblaciones de células contaminantes y resultar en una, población fibroblástica adherente. Estos fibroblastos han sido identificados en la literatura en los últimos 40 años, como se pre-adipocitos. Sin embargo, nuestro grupo de investigación demostró que estas células poseían multipotencialidad mesodérmico y renombraron la población SVF adherente como células del EPL. Estudios posteriores de otros numerosos grupos de investigación se han sumado a este potencial, lo que sugiere tanto endodérmico y potenciales ectodérmicas (para revisión ver 4). Desde entonces, numerosos términos adicionales para estas células han aparecido en la literatura. Con el fin de proporcionar algún tipo de consenso, se adoptó el término células o ASC madre derivadas de tejido adiposo en la II conferencia anual IFATS 2. Como tal, el término ASC se utiliza en este artículo.
El protocolo descrito en este artículo es un procedimiento relativamente simple que requiere un equipo de laboratorio estándar y utiliza reactivos simples tales como solución salina fosfo-tamponada, reactivos estándar de los medios de cultivo de tejidos y la colagenasa. Se puede producir un gran número de ASC en función de la cantidad de volumen de partida tejido adiposo y la subsiguiente Ctiempo ulture. Sin embargo, el procesamiento de una gran cantidad de tejido adiposo como puede presentar algunos problemas físicos que pueden ser mitigados hasta cierto punto el uso de este protocolo. Además, este protocolo no requiere instalaciones de cultivo de tejidos estériles y campanas de bioseguridad aprobados, necesitando por ello el uso de una instalación de cultivo de tejidos aprobado. Este requisito también puede disminuir la utilidad de la población ASC en aplicaciones clínicas a menos que se aislaron en las buenas prácticas de fabricación de instalaciones aprobadas (GMP) diseñados para el aislamiento y la expansión de los materiales para su uso clínico. Como alternativa, los sistemas automatizados que pueden aislar ASC en un sistema cerrado en el quirófano evitaría este tema clave y permitir el uso inmediato de ASC sin ninguna necesidad para la posterior expansión in vitro. Hasta la fecha, hay seis sistemas automatizados que están disponibles comercialmente para el aislamiento de células a partir de tejido humano. Estos sistemas pueden hacer que sea posible aislar unimportante número de ASC de grandes cantidades de tejido adiposo inmediatamente después de su cosecha. Estos ASC podrían ser reintroducidas en el paciente para una variedad de propósitos regenerativos sin el paciente tener que salir de la sala de operaciones. Además de este protocolo que describe el aislamiento manual de los ASC, un protocolo para el aislamiento automatizado de ASC utilizando el Sistema Celution se da también en un artículo complementario.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tejido adiposo para el aislamiento de las ASC puede venir en muchas formas: desde piezas sólidas de tejido obtenidas mediante resección o lipoplastia en trozos más pequeños obtenidos a través de cualquiera de extracción jeringa o lipoplastia asistida por succión (es decir, la liposucción). Ya sea que las células más SVF (y por tanto ASC) pueden obtenerse a partir de muestras de tejido adiposo resecados o aspirado es claro como estudios contradictorios se han presentado 16, 17. Es posible…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer y agradecer a aquellos más personal de investigación que han contribuido al desarrollo del protocolo descrito y su aislamiento de la ASC, incluyendo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , el Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodríguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, y el Dr. John Fraser, PhD. Los resultados presentados fueron financiados, en parte, por las becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, incluidos los NIAMS e Institutos NIDCR.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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