בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם
Summary
ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.
Abstract
ב2001, חוקרים באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, תאר את בידודה של אוכלוסייה חדשה של תאי גזע בוגרים מרקמת שומן liposuctioned שהם בתחילה כינו את תאי Lipoaspirate מעובד או תאי PLA. מאז, תאי גזע אלה כבר לשנות את שמם כתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs והלכו על מנת להפוך לאחת מאוכלוסיות תאי גזע בוגרים הפופולריות ביותר בתחומי מחקר בתאי גזע ורפואה רגנרטיבית. אלפי מאמרי החברה מתארים את השימוש של ASCs במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים משובי, כוללים התחדשות עצם, תיקון עצב היקפי והנדסת לב וכלי דם. מאמרים אחרונים החלו לתאר את מספר עצום של שימושים לASCs במרפאת. הפרוטוקול שמוצג במאמר זה מתאר את ההליך הבסיסי לידני ואנזימי בידוד ASCs מכמויות גדולות של lipoaspirates מתקבל מהליכים קוסמטיים. פרוטוקול זה בקלות וניתן לשנותם למעלה או למטה כדי accommodאכלתי את עוצמת הקול של lipoaspirate ויכול להיות מותאם לבודד ASCs מרקמת שומן שהושג באמצעות abdominoplasties ונהלים דומים אחרים.
Introduction
ב2001, אוכלוסייה משוערת של תאי גזע multipotent מרקמת שומן שתוארה בכתב עת הנדסת רקמות 1. תאים אלה ניתנו תאים שם מעובד Lipoaspirate או PLA בשל גזירתם מרקמות lipoaspirate מעובד שהושגו באמצעות ניתוח קוסמטי. שיטת הבידוד המתוארת במאמר זה הייתה מבוסס על אסטרטגיות האנזימטית קיימות לבידוד של החלק של כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן 2. SVF הוגדר כאוכלוסיית עיבוד מינימאלי של תאי דם אדום, fibroblasts, בתאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes מראש adipocytes שעדיין לדבוק במצע רקמת תרבות 2, 3. Culturing של SVF זה לאורך הזמן מוצע לחסל הרבה של אוכלוסיות תאים מזהמים אלה ולגרום לאוכלוסייה חסיד, fibroblastic. fibroblasts אלה זוהה בספרות ל40 השנים האחרונות כמי שמראשadipocytes. עם זאת, קבוצת המחקר שלנו הוכיחה כי תאים אלה ברשות multipotency mesodermal ועל שמם אוכלוסיית SVF חסיד כתאי PLA. מחקרים מאוחרים יותר על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות שהוספתם לפוטנציאל זה, המצביעים על שני endodermal ופוטנציאלי ectodermal (לסקירה ראתה 4). מאז אותה תקופה, תנאים נוספים רבים לתאים אלה הופיעו בספרות. על מנת לספק איזה סוג של קונסנסוס, המונח בתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs אומצה בnd כנס IFATS השנתי 2. ככזה, ASC המונח ישמש במאמר זה.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא הליך פשוט יחסית שדורש ציוד מעבדה סטנדרטי ומשתמש בחומרים כימיים פשוטים כגון שנאגרו מלוח phospho ריאגנטים מדיה תרבות תקן הרקמות וcollagenase. זה יכול לייצר מספר גדול של ASCs בהתאם לכמות של החל שומן לרקמות נפח וג הבאזמן ulture. עם זאת, העיבוד של כמות כה גדולה של רקמת שומן יכול להציג כמה בעיות פיזיות שניתן למתן במידת שימוש בפרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול זה דורש מתקני סטרילי רקמת תרבות וברדסי בטיחות ביולוגיים שאושרו, ובכך מחייב את השימוש במתקן בתרבית רקמה שאושר. דרישה זו יכולה גם להקטין את התועלת של אוכלוסיית ASC ביישומים קליניים, אלא אם כן הם מבודדים בייצור נאות מתקנים מאושרים (GMP) מיועדים לבידוד וההרחבה של חומרים לשימוש קליני. כחלופה, מערכות אוטומטיות שיכול לבודד ASCs במערכת סגורה בחדר הניתוח היינו למנוע בעיה מפתח זה ולאפשר לשימוש המיידי של ASCs ללא כל צורך בהרחבה לאחר מכן במבחנה. נכון להיום, יש שש מערכות אוטומטיות כי הם זמינים מסחריים עבור הבידוד של תאים מהרקמה אנושית. מערכות אלו יכולות לעשות את זה אפשרי לבודדמספר משמעותי של ASCs מכמויות גדולות של רקמת שומן בעקבות הקציר שלה באופן מיידי. ASCs אלה אז יכול להיות מחדש למטופל עבור מגוון רחב של מטרות משובי ללא המטופל שתצטרכנה לעזוב את חדר הניתוח. בנוסף לפרוטוקול זה מתאר את הבידוד הידני של ASCs, פרוטוקול לבידוד אוטומטי של ASCs באמצעות מערכת Celution ניתן גם במאמר נלווה.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמת שומן לבידודה של ASCs יכולה לבוא בצורות רבות: מחתיכות מוצקות של רקמה המתקבלות באמצעות כריתה או lipoplasty לחתיכות קטנות יותר שהושגו באמצעות שני חילוץ מזרק או lipoplasty בסיוע יניקה (כלומר שאיבת שומן). האם ניתן להשיג יותר תאי SVF (ובכך ASCs) מדגימות שומן resected או להישאף לא ברור…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ולהודות לאנשי מחקר נוספים אלה שתרמו לפיתוח של הפרוטוקול המתואר ובידודה של ASCs, ביניהם: ד"ר ה 'פיטר לורנץ, MD, ד"ר הירושי Muzuno, MD, ד"ר ג'רי הואנג, MD , ד"ר האדם כץ, MD, ד"ר ויליאם פוטרל, MD, ד"ר רונג ג'אנג, DDS, PhD, ד"ר לריסה רודריגז, MD, ד"ר Zeni אלפונסו, PhD, וד"ר ג'ון פרייזר, PhD. התוצאות שהוצגו מומנו בחלקו על ידי מענקי מחקר מהמכון הלאומי לבריאות, כולל NIAMS ומכוני NIDCR.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J., Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user’s guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
