Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos
Summary
Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.
Abstract
Em 2001, pesquisadores da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, descreveu o isolamento de uma nova população de células-tronco adultas do tecido adiposo lipoaspirada que inicialmente denominado Células lipoaspirado ou células processados PLA. Desde então, essas células-tronco foram renomeados como células-tronco adiposo-derivadas ou ASC e passaram a se tornar um dos mais populares populações de células-tronco adultas nos campos da investigação em células estaminais e medicina regenerativa. Milhares de artigos agora descrever o uso de ASC em uma variedade de modelos animais regenerativos, incluindo a regeneração óssea, reparação de nervos periféricos e engenharia cardiovascular. Artigos recentes começaram a descrever a miríade de usos para ASC na clínica. O protocolo mostrado neste artigo descreve o procedimento básico para manualmente e enzimaticamente isolando ASC de grandes quantidades de lipoaspirates obtidos a partir de procedimentos cosméticos. Este protocolo pode ser facilmente escalado para cima ou para baixo para accommodcomeu o volume de lipoaspirado e pode ser adaptado para isolar as ASC de tecido adiposo obtidas por abdominoplasties e outros processos semelhantes.
Introduction
Em 2001, uma população putativo de células-tronco multipotentes do tecido adiposo foi descrito na revista Engenharia de Tecidos 1. Estas células receberam o nome Processado lipoaspirado ou PLA células devido à sua derivação de tecido lipoaspirado processado obtidos através de cirurgia estética. O método de isolamento descritas neste artigo foi baseado em estratégias enzimáticas existentes para o isolamento da fracção do estroma vascular (SVF) a partir de tecido adiposo 2. O SVF tem sido definida como uma população minimamente processados de glóbulos vermelhos, fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos e pré-adipócitos que ainda têm que aderir a um substrato de cultura de tecidos 2, 3. O cultivo deste SVF ao longo do tempo é proposto eliminar muitos destes contaminantes populações de células e resultar em uma população de fibroblastos aderente. Estes fibroblastos, foram identificados na literatura durante os últimos 40 anos como sendo pré-adipócitos. No entanto, nosso grupo de pesquisa demonstrou que estas células possuíam mesodermal multipotency e rebatizou a população SVF aderente como células PLA. Estudos posteriores por inúmeros outros grupos de pesquisa foram adicionados a esse potencial, o que sugere tanto endodermal e potenciais ectodérmicas (para revisão ver 4). Desde essa altura, numerosos termos adicionais para estas células têm aparecido na literatura. A fim de fornecer algum tipo de consenso, o termo células-tronco adiposo-derivadas ou ASC foi adotada na ª conferência anual IFATS 2. Como tal, o termo ASC serão usados neste artigo.
O protocolo descrito neste artigo é um procedimento relativamente simples, que requer equipamento laboratorial padrão e utiliza reagentes simples, tais como solução salina tamponada com fosfo, reagentes de meios de cultura de tecido padrão e colagenase. Pode produzir grandes números de ASC, dependendo da quantidade do volume inicial do tecido adiposo e subsequente culture tempo. No entanto, o processamento de uma grande quantidade de tecido adiposo, tais podem apresentar alguns problemas físicos que possam ser mitigados para um grau usando este protocolo. Além disso, este protocolo requer estéreis a cultura de tecidos e capuzes de biossegurança aprovados, implicando o uso de uma unidade de cultura de tecidos aprovado. Este requisito também pode diminuir a utilidade da população ASC em aplicações clínicas, a menos que eles sejam isolados em boa prática de fabrico (BPF instalações)-aprovados concebidos para o isolamento e a expansão do material para uso clínico. Como alternativa, os sistemas automatizados que podem isolar ASC em um sistema fechado na sala de operação evitaria esta questão fundamental e permitir a utilização imediata de ASC, sem necessidade de posterior expansão in vitro. Até à data, há seis sistemas automáticos que estão disponíveis comercialmente para o isolamento de células a partir de tecido humano. Estes sistemas podem tornar possível isolar umnúmero significativo de ASC de grandes quantidades de tecido adiposo imediatamente após a sua colheita. Estes ASC poderia, então, ser reintroduzida no paciente para uma variedade de fins regenerativos sem o paciente ter que deixar a sala de cirurgia. Além deste protocolo descrevendo o isolamento Manual de ASC, um protocolo para isolamento automatizado de ASC usando o Sistema Celution também é dada em um artigo do companheiro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tecido adiposo para o isolamento de ASC pode vir de várias formas: desde peças sólidas de tecido obtidos por meio de ressecção ou lipoaspiração em pedaços menores obtidos, quer através de extração de seringa ou lipoaspiração assistida por sucção (ou seja, a lipoaspiração). Se mais células SVF (ASC) e, assim, pode ser obtido a partir de amostras de tecido adiposo ressecados ou aspirados está claro como estudos conflitantes foram apresentadas 16, 17. É possível que um ou outro ti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer e agradecer aqueles pessoal adicional de pesquisa que contribuíram para o desenvolvimento do protocolo descrito e seu isolamento da ASC, incluindo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Zhang Rong, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, e Dr. John Fraser, PhD. Os resultados apresentados foram financiados, em parte, por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde, incluindo os NIAMS e Institutos NIDCR.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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