Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates
Summary
In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.
Abstract
In 2001, onderzoekers van de Universiteit van Californië, Los Angeles, beschreef de isolatie van een nieuwe populatie van volwassen stamcellen uit liposuctie vetweefsel dat ze in eerste instantie genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen. Sindsdien zijn deze stamcellen zijn hernoemd vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC en zijn gegaan naar een van de meest populaire volwassen stamcellen populaties op het gebied van stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde geworden. Duizenden artikelen beschrijven nu het gebruik van ASC in verschillende regeneratieve diermodellen, zoals botherstel, perifere zenuwen reparatie en cardiovasculaire techniek. Recente artikelen zijn begonnen met de talloze toepassingen te beschrijven voor ASC in de kliniek. De in dit artikel protocol beschrijft de basisprocedure voor het handmatig en enzymatisch ASC isoleren van grote hoeveelheden lipoaspirates verkregen cosmetische ingrepen. Dit protocol kan gemakkelijk worden opgeschaald of omlaag om accomat de hoeveelheid lipoaspirate en kan worden aangepast aan ASC's uit vetweefsel verkregen via abdominoplasties en andere soortgelijke procedures isoleren.
Introduction
In 2001, een vermeende populatie van multipotente stamcellen uit vetweefsel werd beschreven in het tijdschrift Tissue Engineering 1. Deze cellen kregen de naam Verwerkte Lipoaspirate of PLA cellen als gevolg van hun afleiding van verwerkte lipoaspirate weefsel verkregen door middel van cosmetische chirurgie. De isolatiemethode in dit artikel beschreven is gebaseerd op bestaande enzymatische strategieën voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit vetweefsel 2. De SVF is gedefinieerd als een minimaal verwerkt populatie van rode bloedcellen, fibroblasten, endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten en pre-adipocyten die nog moeten voldoen aan een weefselkweek substraat 2, 3. Kweken van deze SVF tijd wordt voorgesteld veel van deze verontreinigende celpopulaties elimineren en resulteren in een hechtende, fibroblastische bevolking. Deze fibroblasten zijn geïdentificeerd in de literatuur voor de laatste 40 jaar als zijnde pre-adipocyten. Echter, onze onderzoeksgroep aangetoond dat deze cellen bezat mesodermale multipotent en omgedoopt tot de adherente SVF bevolking PLA cellen. Latere studies door tal van andere onderzoeksgroepen hebben toegevoegd aan dit potentieel, wat suggereert zowel endodermale en ectodermale potentials (voor review zie 4). Sindsdien talrijke extra termen voor deze cellen zijn verschenen in de literatuur. Om enige vorm van consensus te bieden, werd de term vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC op de 2e jaarlijkse IFATS conferentie aangenomen. Als zodanig zal de term ASC worden gebruikt in dit artikel.
De in dit artikel beschreven protocol is een betrekkelijk eenvoudige procedure die standaard laboratorium apparatuur vereist en gebruikt eenvoudige reagentia zoals fosfo-gebufferde zoutoplossing, standaard weefselkweekmedium reagentia en collagenase. Het kan grote aantallen ASC naargelang de hoeveelheid uitgangsmateriaal vetweefsel volume en vervolgens c producerenultuur tijd. Echter, de verwerking van een grote hoeveelheid vetweefsel fysieke problemen die kunnen worden verminderd tot een mate met dit protocol presenteren. Bovendien is dit protocol vereist steriele weefselkweek faciliteiten en goedgekeurd bioveiligheid kappen, waardoor het gebruik van een goedgekeurde weefselkweek faciliteit noodzakelijk. Deze eis kan verminderen de bruikbaarheid van de ASC bevolking in klinische toepassingen tenzij ze worden geïsoleerd goede fabricagepraktijken (GMP)-erkende installaties ontworpen voor de isolatie en expansie van materialen voor klinisch gebruik. Als alternatief zou geautomatiseerde systemen die ASC kunnen isoleren in een gesloten systeem in de operatiekamer deze belangrijke kwestie voorkomen, terwijl het onmiddellijke gebruik van ASC zonder enige noodzaak voor daaropvolgende in vitro expansie. Tot op heden zijn er zes geautomatiseerde systemen die commercieel beschikbaar zijn voor de isolatie van cellen uit menselijk weefsel. Deze systemen maken het mogelijk isoleren van eenaanzienlijk aantal ASC uit grote hoeveelheden vetweefsel onmiddellijk na de oogst. Deze ASC kunnen daarna opnieuw in de patiënt voor verschillende regeneratieve doelen zonder de patiënt ooit de operatiekamer verlaten. Daarnaast protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC, is een protocol voor isolatie van geautomatiseerde ASC met het Celution systeem eveneens in een begeleidend artikel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vetweefsel voor de isolatie van ASC kan komen in vele vormen: van stevige stukjes weefsel verkregen door middel van resectie of lipoplasty om kleinere stukken verkregen via ofwel spuit extractie of-zuig bijgestaan lipoplasty (dwz liposuctie). Of meer SVF cellen (en daarmee ASC's) kan worden verkregen bij gereseceerde of weggezogen vet monsters is onduidelijk tegenstrijdige studies zijn gepresenteerd 16, 17. Het is mogelijk dat beide vormen van vetweefsel is meer dan geschikt voor de isolati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen erkennen en dank die aanvullende onderzoek personeel die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van het protocol beschreven en de isolatie van ASC, waaronder: dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD , Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, PhD, en Dr John Fraser, PhD. De gepresenteerde resultaten werden gefinancierd, voor een deel, door onderzoek subsidies van de National Institutes of Health, waaronder de NIAMS en NIDCR Instituten.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J., Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user’s guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
