İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon
Summary
2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.
Abstract
2001 yılında, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, araştırmacılar başlangıçta İşlenmiş Lipoaspirate Hücreleri veya PLA hücreleri adı liposuctioned adipoz dokudan erişkin kök hücrelerinin yeni bir nüfus izolasyonunu nitelendirdi. O zamandan beri, bu kök hücreler Yağ elde edilen kök hücreler ya da TSK olarak yeniden adlandırılmış ve kök hücre araştırma ve rejeneratif tıp alanında en popüler yetişkin kök hücreler nüfus biri olmaya gitti. Binlerce makale artık kemik rejenerasyonu, periferik sinir onarımı ve kardiyovasküler mühendisliği de dahil olmak üzere, rejeneratif hayvan modellerinde çeşitli TSK kullanımını tarif eder. Yeni makaleler klinikte TSK için kullandığı sayısız tarif başladı. Bu makalede gösterilen protokol elle ve enzimatik kozmetik işlemler elde lipoaspirates büyük miktarda gelen TSK izole etmek için temel prosedür özetliyor. Bu protokol kolayca ölçekli veya accommod aşağı olabilirlipoaspirate hacmini yedi ve abdominoplasties ve benzer prosedürler ile elde edilen yağ dokusundan TSK ve izole etmek için uyarlanabilir.
Introduction
2001 yılında, adipoz dokusundan multipotent kök hücrelerin farazi bir nüfus dergisinde Tissue Engineering 1 'de tarif edilmiştir. Bu hücreler kozmetik cerrahi yoluyla elde edilen işlenmiş lipoaspirate dokudan kendi türetme nedeniyle adı İşlenmiş Lipoaspirate ya da PLA hücreleri verildi. Bu makalede açıklanan izolasyon yöntemi yağ dokusu 2 stromal damar fraksiyon (SVF) izolasyonu için mevcut enzimatik stratejiler dayanıyordu. SVF, bir doku kültürü alt-tabaka 2, 3 uymak için henüz kırmızı kan hücreleri, fibroblastlar, endotelial hücreler, yumuşak kas hücreleri, perisitler ve ön adipositlerin minimal işleme nüfus olarak tanımlanmıştır. Zaman içinde bu SVF ekimi, bu kirletici hücre popülasyonlarının çok ortadan kaldırmak ve bir yapışkan, fibroblastik nüfus neden önerilmiştir. Bu fibroblastlar ön-varlık olarak son 40 yıldır literatürde tespit edilmiştiradipositleri. Ancak, araştırma grubu, bu hücrelerin mezodermal multipotency sahipti ve PLA hücreleri gibi yapışık SVF nüfusu adını gösterdi. Çok sayıda diğer araştırma grupları tarafından daha sonraki çalışmalar (yorum 4 görmek için) Endodermal ve ektodermal potansiyellerini hem düşündüren, bu potansiyeli ekledik. O zamandan beri, bu hücreler için çok sayıda ek şartlar literatürde ortaya çıktı. Uzlaşma çeşit sağlamak amacıyla, vadeli Yağ türetilmiş Kök Hücreler veya TSK 2. yıllık IFATS toplantısında kabul edildi. Bu nedenle, bu terim ASC bu makalede kullanılacaktır.
Bu makalede açıklanan protokol standart laboratuar ekipmanı gerektirir ve bu fosfo-tamponlu tuz çözeltisi, standart doku kültür ortamı reaktifler ve kolajenaz gibi basit bir reaktif kullanan bir nispeten basit bir işlemdir. Bu yağ dokusu hacim ve daha sonra c başlangıç miktarına bağlı olarak TSK çok sayıda üretebilirulture zaman. Ancak, yağ dokusu gibi bir büyük miktarda işlem bu protokolü kullanarak bir dereceye kadar azaltılabilir bazı fiziksel sorunlar ortaya çıkabilir. Ayrıca, bu protokol bu şekilde onaylı bir doku kültürü imkan kullanımını gerektiren, steril doku kültürü tesisleri ve onaylanmış biyo-güvenlik davlumbaz gerektirir. Bunlar iyi üretim uygulamaları klinik kullanım için izolasyonu ve genleşme için tasarlanmış (GMP) onaylı tesisleri izole sürece Bu gereksinim, klinik uygulamalarda ASC nüfusun yarar azaltabilir. Alternatif olarak, işletme tiyatro, kapalı bir sistem içinde TSK ayırabilirsiniz otomatik sistemler bu tuş sorunu önleyeceğini ve sonraki in vitro genişlemesi için herhangi bir ihtiyaç olmaksızın TSK hemen kullanımı için izin verir. Bugüne kadar, insan dokusundan hücrelerinin izole edilmesi için ticari olarak temin edilen altı otomatik sistemleri vardır. Bu sistemler sayesinde izole etmek için yapabilirderhal hasadından sonra adipoz doku büyük miktarda gelen TSK önemli sayıda. Bunlar TSK her zamankinden çalışma odasını terk etmek zorunda hasta olmadan rejeneratif çeşitli amaçlar için hastaya geri olabilir. TSK manuel izole açıklayan bu protokol ek olarak, Celution Sistemi kullanılarak TSK otomatik izolasyonu için protokol, eşlik eden bir makalede verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
TSK izolasyonu için yağ dokusu çeşitli biçimlerde gelebilir: şırınga çıkarma veya emme destekli lipoplasty (yani liposuction) ya aracılığıyla elde edilen küçük parçalar rezeksiyon veya lipoplasty yoluyla elde edilen doku katı parçalarından. Çelişkili çalışmalar 16, 17 sunulmuştur daha SVF hücreleri (ve dolayısıyla TSK) rezeke veya aspire yağ örneklerinden elde edilebilir belirsizdir. Bu yağ dokusu ya da bir şekilde sürece operatör kendi izolasyon tekniği yeterli o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kabul etmek istiyoruz ve dahil açıklanan protokolü ve TSK kendi izolasyon gelişmesine katkıda bu ek araştırma personelini teşekkür: Dr H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, Doktora, ve Dr John Fraser, PhD. Sunulan sonuçlar NIAMS ve NIDCR Enstitüleri dahil olmak üzere Ulusal Sağlık Enstitüleri, araştırma hibe, kısmen finanse edilmiştir.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J., Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user’s guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
