जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में रुक फ्रैक्चर / रुक खोदना की मौलिक तकनीकी तत्वों

Summary

बुनियादी तकनीकों और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा के लिए जैविक नमूनों और nanomaterials के फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण के शोधन वर्णित हैं. इस तकनीक ultrastructural सुविधाओं और जैविक झिल्लियों की विशेषज्ञताओं खुलासा करने के लिए और सामग्री विज्ञान और नैनो उत्पादों में ultrastructural स्तर आयामी और स्थानिक डेटा प्राप्त करने के लिए एक पसंदीदा तरीका है.

Abstract

प्रकृति में नमूनों, आम तौर पर जैविक या nanomaterial, खंडित, जमे हुए, और एक कार्बन / प्लैटिनम "डाली" ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा के लिए करना उत्पन्न करने के लिए दोहराया है जिससे फ्रीज फ्रैक्चर / फ्रीज खोदना एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. नमूने तरल नाइट्रोजन उच्च वैक्यूम के तहत तापमान ठंडा पर नमूना के बाद fracturing के साथ, अक्सर बर्फ क्रिस्टल के गठन को सीमित करने cryoprotective एजेंटों की उपस्थिति में, ultrarapid ठंड दरों के अधीन हैं. परिणामी खंडित सतह दोहराया और कलाकारों के लिए सतह के तीन आयामी विस्तार प्रदान कि एक कोण से कार्बन और प्लैटिनम के वाष्पीकरण से स्थिर है. इस तकनीक कोशिका झिल्ली और उनकी विशेषज्ञता की जांच के लिए विशेष रूप से ज्ञानवर्धक साबित कर दिया है और सेल से संबंधित कार्य करने के लिए सेलुलर फार्म को समझने के लिए काफी योगदान दिया है. इस रिपोर्ट में, हम प्रदर्शन के लिए साधन की आवश्यकताओं और तकनीकी प्रोटोकॉल सर्वेक्षणफ्रीज फ्रैक्चर, जुड़े नामकरण और फ्रैक्चर विमानों की विशेषताओं, फ्रीज फ्रैक्चर छवियों की व्याख्या के लिए पारंपरिक प्रक्रिया में बदलाव, और मापदंड. इस तकनीक का व्यापक रूप से कोशिका जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में ultrastructural जांच के लिए इस्तेमाल किया और आणविक, नैनो के लिए एक उभरती इमेजिंग तकनीक के रूप में वादा रखती है, और सामग्री विज्ञान के अध्ययन किया गया है.

Introduction

अवधारणा और जैविक नमूनों की फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण के व्यावहारिक अनुप्रयोग एक सदी पहले आधी से अधिक Steere ¹ द्वारा पेश किया गया था. जल्दी तंत्र काम कर रहे एक घुन्ना इकाई ¹ में असमान घटक विनियोजित. मूल उपकरण संशोधित और दूरदराज के हेरफेर, उच्च वैक्यूम के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण जरूरत को समायोजित करने के क्रम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों में परिष्कृत, और कार्बन और धातुओं के वाष्पीकरण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 और चित्रा ने परीक्षा के लिए उपयुक्त एक प्रतिकृति उत्पादन किया गया था 2).

ठेठ साधन नमूना तालिका और सूक्ष्म बांह नियम तरल नाइट्रोजन throughputs होने (चित्रा 1) के साथ एक उच्च निर्वात चैम्बर के होते हैं. चैम्बर भी नमूना चरण के लिए एक 90 º कोण और Plati के लिए अन्य पर तैनात कार्बन वाष्पीकरण स्थिर रखने के लिए दो इलेक्ट्रॉन बंदूकें, एक मकान45 º (चित्रा 2) - एक समायोज्य कोण, आम तौर पर 15º पर ग्रहण संख्या / कार्बन. इकाई को सत्ता निर्वात पंप संचालित करने के लिए लागू किया जाता है और इलेक्ट्रॉनिक पैनल तापमान समायोजन और इलेक्ट्रॉन बंदूक नियंत्रण को विनियमित.

मूल रूप से परीक्षा और कोशिका झिल्ली का विश्लेषण और उनके विशेषज्ञताओं ^{2, 3} के लिए एक तकनीक के रूप में भी अधिक से अधिक लोकप्रियता हासिल फ्रैक्चर फ्रीज, वायरस के बेहतर इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक साधन के रूप में कल्पना की. दरअसल, इस प्रक्रिया कोशिकाओं और ऊतकों और इन अध्ययनों के कई सेल और आणविक जीवविज्ञान ^4-9 क्लासिक योगदान के रूप में खड़े में संरचना / समारोह रिश्तों elucidating का अभिन्न अंग रहा है. फ्रीज फ्रैक्चर तकनीक के विकास के लिए प्रमुख लक्ष्य और तर्क पारंपरिक जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया रासायनिक निर्धारण और प्रसंस्करण से पाने इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म प्रस्ताव पर नमूदार कलाकृतियों को सीमित करने के लिए किया गया था. यहाँ लक्ष्य रासायनिक सीमित करने के लिए हैनिर्धारण पर्याप्त गति के साथ और अक्सर बर्फ क्रिस्टल के गठन और अन्य ठंड कलाकृतियों को सीमित करने के क्रम में एक cryoprotectant की उपस्थिति में नमूना जमा करने के लिए और. अभी हाल ही में इस तकनीक नैनोकणों और nanomaterials की परीक्षा के लिए आणविक जीव विज्ञान और सामग्री जांचकर्ताओं से ब्याज की एक पुनरुत्थान पाया गया है.

फ्रैक्चर रुक और फ्रीज खोदना छवियों को एक तीन आयामी चरित्र दिखा रहे हैं और कभी कभी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs के लिए गलत कर रहे हैं. हालांकि, फ्रीज फ्रैक्चर तैयारी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच कर रहे हैं और उच्च संकल्प शब्द के भागों के अध्ययन के लिए उनके महत्वपूर्ण योगदान कोशिका झिल्ली की संरचना / समारोह तत्वों की अपनी अनूठी प्रतिनिधित्व है. फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण और / या ऐसे ग्लिसरॉल के रूप में cryoprotectant एजेंटों के उपयोग के साथ बर्फ क्रिस्टलीकरण सीमित करने के लिए पर्याप्त गति के साथ कोशिकाओं और ऊतकों ठंड द्वारा शुरू की है. नमूनों तो वैक्यूम और एक प्रतिनिधि तहत खंडित कर रहे हैंLica खंडित सतह पर कार्बन और प्लैटिनम का वाष्पीकरण द्वारा उत्पन्न होता है. मूल नमूना एक मानक ईएम नमूना ग्रिड पर लिया गया है जो प्रतिकृति से पच जाता है. फ्रीज फ्रैक्चर छवियों का एक अन्य आम अशुद्ध अर्थ वे सेल सतहों को दर्शाती है. फ्रीज फ्रैक्चर का मूल आधार जैविक झिल्लियों फ्रैक्चर प्रक्रिया (चित्रा 3) द्वारा लिपिड bilayer के माध्यम से विभाजित कर रहे हैं हालांकि. जैविक झिल्लियों में यह प्रक्रिया दो फ्रैक्चर चेहरे, कोशिकी के निकट है कि झिल्ली के bimolecular पुस्तिका के आधे से पता चलता है जो कोशिका द्रव्य, पीएफ-सामना करने के लिए आसन्न झिल्ली के आधे के संगठन का पता चलता है जो एक, और एक पैदावार परिवेश, एफई चेहरा. यह सच है कि सेल सतहों फ्रीज फ्रैक्चर छवियों में प्रतिनिधित्व लेकिन फ्रैक्चर प्रक्रिया के बाद फ्रीज नक़्क़ाशी के बाद जोड़ा कदम प्रयोग किया जाता है जब केवल प्रकट नहीं कर रहे हैं. प्रभावी ढंग से सतह Detai प्रकट करने के लिए पहले से खंडित नमूनों खोदना करने के क्रम मेंएल, नमूनों एक तीव्र दर से और unetchablecryoprotectant बिना जमे हुए किया जाना चाहिए. अंतर्निहित सुविधाओं खुलासा खंडित नमूना की सतह से पानी की नक़्क़ाशी नमूना पकड़े चरण के बीच एक तापमान अंतर पैदा नमूना चरण से अधिक ठंडा सूक्ष्म हाथ और सतह से उदात्त करने के लिए पानी का कारण बनता है, जो ठंडा सूक्ष्म हाथ स्थिति से पूरा किया है. पानी फ्रीज नक़्क़ाशी पैंतरेबाज़ी के दौरान खंडित नमूना की सतह से sublimed जाता है, तो वास्तविक सेल सतहों, बाह्य मैट्रिक्स, cytoskeletal संरचनाओं, और आणविक विधानसभाओं के पहलुओं को उच्च संकल्प पर पता चला जा सकता है. इस प्रकार फ्रीज फ्रैक्चर और खोदना फ्रीज विनिमेय शर्तें नहीं हैं बल्कि जो बाद के विशेष अध्ययन की जरूरत के आधार पर आवश्यक या वांछनीय नहीं हो सकता है एक कदम के लिहाज से इस प्रक्रिया को दर्शाते हैं.

फ्रीज फ्रैक्चर के बाद / फ्रीज खोदना प्रक्रियाओं, खंडित सतहों निर्देशित evapora के अधीन हैंप्रतिकृति को समर्थन और इमेजिंग विपरीत प्रदान करने के क्रम में कार्बन और प्लैटिनम की कोट ेश्य. प्लैटिनम / कार्बन इमेजिंग वाष्पीकरण यूनिडायरेक्शनल या रोटरी हो सकता है और प्रतिरोध या इलेक्ट्रॉन बंदूकों या तो द्वारा पूरा किया है. एक ज्ञात कोण, आम तौर पर 30º से यूनिडायरेक्शनल ग्रहण - 45 º, कुछ morphometric गणना प्रदर्शन करने में उपयोगी है. गहरे नक़्क़ाशी के अधीन किया गया है कि नमूने आमतौर पर छाया रोटरी हैं और इन नमूनों की परिणामी छवियों फ़ोटोग्राफ़ी मूल्यांकन के लिए उलट हैं.

ऐतिहासिक और साथ ही फ्रीज फ्रैक्चर / फ्रीज खोदना तकनीक के वर्तमान लक्ष्य अधिक पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं के साथ जुड़े रहे हैं कि कलाकृतियों नमूना रासायनिक निर्धारण और प्रसंस्करण की सीमा है. हालांकि, इस तकनीक और एन, तीन आयामी विस्तार प्रदान करने और इस प्रकार जैविक, भौतिक विज्ञान में morphometric डेटा के अधिग्रहण की सुविधा के लिए अपनी क्षमता में एक ठोस लाभ प्रदान करता हैanotechnology नमूनों. फ्रैक्चर-रुक और फ्रीज खोदना प्रक्रियाओं जटिल और बहुआयामी हैं और अपने आवेदन के कुछ पहलुओं को अनुकूलित कर रहे हैं. इस प्रस्तुति प्रक्रिया की प्रमुख विशेषताओं में से एक सर्वेक्षण दृश्य प्रस्तुत करता है और पाठक विशिष्ट अनुसंधान की जरूरत के लिए प्रक्रिया विवरण को संबोधित करने और अनुकूलित करने के क्रम में व्यापक प्रकाशित प्रोटोकॉल ^{10, 11} के लिए भेजा है.

Protocol

रुक फ्रैक्चर / रुक खोदना के लिए जैविक नमूनों की 1. तैयारी

1. 1 घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में एक पारंपरिक ईएम लगानेवाला तैयार करने जैसे 2% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde का प्रयोग करें. जैविक ऊतकों की प्राथमिक निर्धारण करने के लिए. नोट: यह पूर्व निर्धारण के बिना नमूनों में से कुछ प्रकार के फ्रीज करने के लिए वांछनीय हो सकता है, यूनिवर्सल रक्त जनित रोगज़नक़ सावधानियों नमूना मानव ऊतक होते हैं जहां उचित निर्धारण जनादेश.
2. प्राथमिक निर्धारण के बाद, नहीं 1 से अधिक घंटे के लिए 0.2 एम sucrose के साथ पूरक एक ही बफर में नमूना कुल्ला.
3. 1 घंटा से अधिक नहीं के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 25% ग्लिसरॉल से मिलकर एक cryoprotectant समाधान के लिए नमूना स्थानांतरण.

रुक फ्रैक्चर के अग्रिम में 2 बर्फ़ीली और नमूनों का संग्रहण

1. उचित आकार और नमूना के लिए आकार का चयन करें सोने या तांबे नमूना आधार संसाधित किया जा रहा है (चित्रा 4
2. ठीक ग्रेड संदंश और / या एक धातु नमूना ठूंठ के शीर्ष पर नमूना के छोटे गेज सिरिंज सुई स्थिति छोटे टुकड़े का उपयोग करना.
   1. एक चिपचिपा को नमूना के तरल सामग्री को कम थोड़ा फिल्टर पेपर के साथ ठूंठ के किनारे से तरल बंद बनाकर स्थिरता जैसे गोंद.
   2. एकल प्रतिकृतियां के लिए, ठूंठ पर ऊतक का एक टीला बनाने के लिए छोटे गेज सिरिंज सुई का उपयोग करें. डबल प्रतिकृतियां के लिए, यह वास्तव में ठूंठ पर एक ठूंठ और स्थिति को पलटना और एक सैंडविच (चित्रा 5A) बनाने नमूना की सतह पर हल्के से जगह है. दो स्टब्स के बीच से बाहर नमूना प्रेस मत करो.
3. तरल नाइट्रोजन के साथ दो पृथक देवर जहाजों भरें. नोट: पहला पोत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलेंडर (चित्रा 5 ब) से प्रोपेन गैस की एक छोटी मात्रा दव्र लिए किया जाता है जो एक छोटे से अच्छी तरह से युक्त एक धातु पोस्ट रह सकते हैं. दूसरा पोत संक्षिप्त के लिए पोत होल्डिंग / विभाजित भंडारण हैly तरल नाइट्रोजन के तहत जमे हुए नमूनों को बनाए रखने.
   1. प्रोपेन कुएं में तैनात सिलेंडर नोक का प्रयोग, सिलेंडर वाल्व खोलने और गैस यह दव्र जाएगा जहां पहले पोत की कुएं में प्रवाह करने की अनुमति देते हैं. नोट: सावधानी !! प्रोपेन संपर्क पर चोट ठंड के कारण हो सकता, विस्फोटक है, और एक ASPHYXIANT है. केवल इस तरह के प्रयोग कम तापमान के खिलाफ सुरक्षात्मक कपड़ों का उपयोग, भी बाहरी इग्निशन स्रोतों से बचने के लिए, देखभाल और पर्याप्त वेंटिलेशन बनाए रखने के लिए प्रमाणित एक रासायनिक हुड में प्रोपेन का प्रयोग करें.
   2. जितनी जल्दी संभव हो, नमूना ठीक ग्रेड संदंश के साथ माउंट और फिर जल्दी से तरल नाइट्रोजन की दूसरी पकड़े पोत (चित्रा 5 ब) के लिए स्थानांतरण कई सेकंड के लिए पहला पोत में तरलीकृत गैस में यह फ़ैसला लेने.
   3. नमूनों जमे हुए हैं एक बार, तैयार है जब तक तरल नाइट्रोजन के तहत दुकान फ्रीज फ्रैक्चर संयंत्र को स्थानांतरित करने के लिए. विस्तारित के लिए एक बड़ा भंडारण तरल नाइट्रोजन देवर कंटेनर के आधार पर स्थानांतरणअगर वांछित, लेकिन परवाह भंडारण स्टब्स पिघलना करने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए.

रुक फ्रैक्चर के 3 ऑपरेशन साधन और नमूना प्रसंस्करण

1. पीतल धारक पर और चेंबर में नमूनों लोड हो रहा है
   1. एक पुस्तिका प्रकार डबल प्रतिकृति नमूना धारक में सोने नमूना स्टब्स लोड या तरल नाइट्रोजन के तहत डिवाइस दबाना और नमूना चैम्बर (चित्रा 6) में स्थिति के लिए तैयार है जब तक वहाँ बनाए रखें.
   2. चैम्बर उच्च वैक्यूम (लगभग 2 एक्स 10 ^-6 मिलीबार) हासिल की है और चरण तरल नाइट्रोजन के तापमान पर ठंडा किया गया है, पंप बंद करने के चैम्बर उतारना, और जितनी जल्दी संभव हो नमूना मेज पर घुड़सवार नमूना स्टब्स की स्थिति .
   3. , पंप पर बारी उच्च वैक्यूम पैर जमाने, और सूक्ष्म हाथ और Bri लिए नमूना तालिका -100 डिग्री सेल्सियस तापमान और प्रत्यक्ष तरल नाइट्रोजन समायोजित करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक मंच और हाथ तापमान नियंत्रण का उपयोगतरल नाइट्रोजन के तापमान को यह एनजी.
2. फ्रैक्चर प्रक्रिया
   1. तरल नाइट्रोजन के तापमान पर उच्च निर्वात, -100 डिग्री सेल्सियस के एक चरण तापमान और सूक्ष्म हाथ प्राप्त करने पर, दूर से जिससे नमूना आरोह के नमूनों fracturing डबल प्रतिकृति नमूना धारक खोलने (फ्रीज fracture_movie1.mov).
   2. नक़्क़ाशी निम्नलिखित फ्रैक्चर के लिए करना नमूनों के मामले में, दाढ़ी बनाने के लिए सूक्ष्म हाथ पर एक क्लैंप में बनाए रखा एक रेजर ब्लेड का उपयोग (यानी, अस्थिभंग) कदम 3.2.1 के एवज में नमूनों की सतह (फ्रीज etch_movie2.mov).
   3. जोड़ा फ्रीज नक़्क़ाशी कदम प्रदर्शन किया जा रहा है, कई मिनट के लिए एक के लिए खंडित सतहों पर ठंडा सूक्ष्म हाथ की स्थिति. नोट: खंडित सतह से इस पैंतरेबाज़ी उदात्त होगा (यानी, खोदना) पानी. इस पैंतरेबाज़ी का प्रभाव प्रासंगिकता के अलावा, पानी की उच्च बनाने की क्रिया द्वारा सच सेल सतहों, बाह्य मैट्रिक्स, और / या आणविक विधानसभाओं प्रकट करने के लिए हैcture झिल्ली लिपिड bilayer से गुजर चेहरे.
3. धातु ग्रहण और प्रतिकृति समर्थन वाष्पीकरण इलेक्ट्रॉन बंदूकों का उपयोग
   1. प्लैटिनम / कार्बन इलेक्ट्रॉन या प्रतिरोध बंदूक सक्रिय करें और यह 30º का एक कोण से खंडित सतह पर प्लेटिनम / कार्बन की एक पतली परत (लगभग 2 एनएम) लुप्त हो जाना करने की अनुमति - 45 º. 20 सेकंड - यह आमतौर पर लगभग 15 की आवश्यकता है.
   2. कदम 3.3.1 के रूप में कार्बन इलेक्ट्रॉन या प्रतिरोध बंदूक सक्रिय और प्रतिकृति को समर्थन देने के लिए सीधे उपरि (90 º) से खंडित नमूना सतह पर कार्बन की एक पतली परत लुप्त हो जाना. 20 सेकंड - यह आमतौर पर लगभग 15 की आवश्यकता है.
4. प्रतिकृतियां की बहाली
   1. प्रतिकृति ग्रहण और कार्बन स्थिरीकरण के पूरा होने पर, वैक्यूम पंप को बंद कक्ष उतारना, और नमूना साधन से माउंट हटा दें.
   2. ठीक ग्रेड संदंश की एक जोड़ी का उपयोग डबल से प्रत्येक सोने नमूना ठूंठ को दूरप्रतिकृति पुस्तिका / दबाना और धीरे एक जगह प्लेट (चित्रा 7) में एक पानी की सतह पर ठूंठ को कम करने से पहले कई सेकंड के लिए पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: पानी की सतह पर तैरने लगते होगा पक्षपाती नमूना सामग्री युक्त कार्बन / प्लैटिनम प्रतिकृति.
   3. ठीक एक तार पाश या ठीक ग्रेड संदंश और कई घंटे तक एक के लिए 50% सल्फ्यूरिक एसिड में 5% सोडियम dichromate युक्त एक और मौके की थाली पर स्थानांतरण द्वारा आयोजित एक पारंपरिक तांबे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड का उपयोग प्रतिकृतियां पैंतरेबाजी. नोट: इस स्नान प्रतिकृति से वास्तविक जैविक नमूना सामग्री हज़म. पूरी ताकत घरेलू ब्लीच डाईक्रोमेट / सल्फ्यूरिक एसिड समाधान के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
   4. पाचन पूरा हो गया है, एक साफ पानी की सतह को वापस प्रतिकृति हस्तांतरण और एक मानक तांबा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर निकालते हैं. (नोट: प्रतिकृतियां पाचन के दौरान छोटे टुकड़ों में टुकड़ा हो सकता है लेकिन फिर भी बहुत छोटी प्रतिकृतियां पर्याप्त जानकारी हो सकती है और retr होना चाहिएieved और जांच की.) वे लिटाने के साथ साल के लिए स्थिर रहेगा, जहां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्रिड बॉक्स में ग्रिड समर्थन स्टोर प्रतिकृति.

रुक फ्रैक्चर / खोदना प्रतिकृतियां के 4 Ultrastructural परीक्षा

1. 80 केवी - आम तौर पर 50 से एक त्वरक वोल्टेज में एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखें प्रतिकृतियां.
2. मानक मंदिर फिल्म पर या एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरा के साथ प्रासंगिक छवियों को रिकार्ड.

Representative Results

फ्रीज फ्रैक्चर छवि व्याख्या के प्रमुख आधार फ्रैक्चर विमानों सम्मेलन पीएफ चेहरा (प्लाज्मा फ्रैक्चर चेहरा) और एफई चेहरा (बाह्य फ्रैक्चर चेहरा) (चित्रा ने बुलाया दो फ्रैक्चर चेहरे प्रदान झिल्ली लिपिड bilayer, के माध्यम से पारित है 3). पीएफ चेहरा सेल और एफई चेहरे की कोशिका द्रव्य से सटे झिल्ली लिपिड bilayer के आधे बाह्य परिवेश से सटे झिल्ली लिपिड bilayer का आधा है. फ्रीज फ्रैक्चर तकनीक झिल्ली संरचना की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और दो चेहरे आमतौर पर पीएफ-चेहरों कम होते हैं जो एफई चेहरे के विपरीत कई झिल्ली जुड़े कणों के साथ आबादी होने के साथ विशिष्ट अलग हैं. फ्रीज खंडित कोशिकाओं के cytoplasmic सामग्री उपस्थिति में आम तौर पर मोटे हैं और इस तरह के नाभिक और गॉल्जी रूप झिल्ली बाध्य organelles आसानी से पहचाना जा सकता है हालांकि विशेष रूप से खुलासा नहीं कर रहे हैं. खास रुचि inve कोइस तकनीक का उपयोग stigators उनके कार्य के लिए व्याख्या की जा सकती है कि झिल्ली संरचना के विशेषज्ञों रहे हैं. इन झिल्ली जुड़े कणों की विशिष्ट वितरण, सिलिअरी झिल्ली विशेषज्ञताओं, और कहनेवाला जंक्शनों शामिल हैं.

सिलिया जुड़े संरचनाएं

प्रत्येक यूकेरियोटिक पपनी और कशाभिका के आधार पर सेल झिल्ली में रहने वाले (चित्रा 8) ^12-16 झिल्ली जुड़े कणों की एक सरणी पपनी की शाफ्ट encircling किस्में में संगठित और रोमक हार के रूप में जाना जाता है. यह संरचना विभिन्न प्रजातियों में शब्द के भागों विविधता के कुछ डिग्री दर्शाती है और यह यह ciliogenesis दौरान सिलिअरी शाफ्ट के उद्भव से पहले प्रकट होता है और परिपक्व पपनी में जगह में रहता है के रूप में multifunctional यद्यपि के होने का अनुमान लगाया गया है. नवजात सिलिअरी हार ई के समय से पहले झिल्ली कण सरणियों के एकत्रीकरण और संगठन से निकलाविकासशील axoneme ¹⁴ के शुरुआती संगठन में अपनी संभव भागीदारी का सुझाव ciliogenesis दौरान सिलिअरी शाफ्ट के mergence.

टाइट जंक्शन और उपकला Permeabi lity

विभिन्न epithelia में, फ्रीज फ्रैक्चर के अध्ययन basolateral सीमाओं के शिखर पहलू encircling किनारा और नाली संरचनाओं anastomosing के एक परिष्कृत संगठन प्रकट करते हैं. इस बेल्ट की तरह संरचना तंग जंक्शन या zonulaoccludens (चित्रा 9) के रूप में जाना जाता है और paracellular प्रवाह ^{3, 17-20} को उपकला पारगम्यता के एक नियामक के रूप में कार्य करने के लिए माना जाता है. अधिक जटिल संगठन के साथ उन "तंग" के रूप में वर्णित हैं, जबकि कुछ किस्में के साथ तंग जंक्शनों "टपका हुआ" के रूप में वर्णित किया गया है. इस संगठन वे जुड़े रहे हैं जो करने के लिए epithelia के समारोह में फिट करने के लिए प्रकट होता है. तंग जंक्शनों के पीएफ-चेहरों एफई चेहरे प्रदर्शनी compleme जबकि किस्में के रूप में प्रकटntary खांचे.

अंतराल जंक्शनों और कहनेवाला संचार

गैप जंक्शनों (चित्रा 10) के ऊतकों की एक किस्म के फ्रीज फ्रैक्चर की तैयारी में दिखाई देते हैं और एफई चेहरे पर पीएफ-चेहरे और पूरक गड्ढों पर कणों के घने सरणियों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. इन संरचनाओं कहनेवाला संचार की सुविधा है कि झिल्ली साइटों का प्रतिनिधित्व करने के लिए लगा रहे हैं. वे मौजूद हैं, जहां ऊतकों में, कम आणविक भार फ्लोरोसेंट रंगों और कैल्शियम अपशिष्टों के पारित होने के प्रदर्शनों वे संकेतन अणुओं के पारित होने के लिए एक भौतिक मार्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं, सुझाव है कि ^21-24 का प्रदर्शन किया गया है.

एक वाणिज्यिक फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना संयंत्र की संख्या 1 लेआउट. अब तक एक दबाव देवर च छोड़ानमूना चरण के लिए तरल नाइट्रोजन ठंडा और नियंत्रित परिस्थितियों में सूक्ष्म हाथ ठंडा eeding. केंद्र में सही करने के लिए नमूना कक्ष और इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण पैनल के साथ इकाई है. सही में वेंट गैस वातावरण को नमूना कक्ष लाने के लिए प्रयोग किया जाता है जिस पर एक अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन टैंक है.

दरवाजे के साथ चित्रा 2 रुक फ्रैक्चर / खोदना संयंत्र नमूना कक्ष directionally उद्देश्य से इलेक्ट्रॉन बंदूकों की स्थिति, ठंडा कफन खोलने के लिये खोला, और नमूना पीतल धारकों में नमूनों तैनात हैं जहां पोस्ट. नमूने के बाईं ओर एक बंदरगाह के माध्यम से चैम्बर के लिए पेश कर रहे हैं चैम्बर.

चित्रा 4 फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना प्रक्रियाओं के लिए नमूना आरोह के दो प्रकार के. (बाएं) एक डबल प्रतिकृति नमूना धारक पुस्तिका नक़्क़ाशी बिना प्रदर्शन पारंपरिक फ्रीज फ्रैक्चर प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है. नमूना दो सोने नमूना स्टब्स के शोर और पीतल पुस्तिका में तैनात है. नमूना (फ्रीज fract देखें नमूना चैम्बर में वैक्यूम के अंतर्गत पुस्तिका खोलने के द्वारा खंडित है ure_movie1.mov). (सही) एक फ्रीज नक़्क़ाशी के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल माउंट. नमूना सोने आधार पर तैनात है और पीतल धारक में बंद है. नमूना सूक्ष्म हाथ में तय एक धार के साथ कोमल शेविंग द्वारा खंडित है. यह विन्यास (फ्रीज etch_movie2.mov देखें) नक़्क़ाशी प्रक्रियाओं के लिए पसंद किया जाता है.

एक फ्रीज फ्रैक्चर नमूना के 5 चित्रा तैयारी माउंट. नमूना दो सोने के आरोह (ए) के शोर और एक अच्छी तरह से युक्त तरल नाइट्रोजन में जमे हुए एक देवर तरल नाइट्रोजन युक्त होल्डिंग (पृष्ठभूमि) को बाद के हस्तांतरण के साथ प्रोपेन (अग्रभूमि) ठंडा है ( बी).

ig6highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना संयंत्र का नमूना चैम्बर के लिए परिचय के लिए तैयार करने में डबल प्रतिकृति नमूना धारक पुस्तिका में एक जमे हुए फ्रीज फ्रैक्चर नमूना की स्थिति के 6 प्रदर्शन.

फ्रैक्चर के बाद और फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना संयंत्र में ग्रहण प्रतिकृतियां के 7 चित्रा रिट्रीवल. 'ए' एक जगह की थाली में एक स्वच्छ पानी की सतह है. नमूना ठूंठ से मंगाई प्रतिकृति "बी" एक अच्छी तरह से प्रतिकृति से ऊतक के पाचन के लिए सोडियम डाईक्रोमेट या पूरी ताकत घरेलू ब्लीच का एक acidified समाधान युक्त को सौंप दिया है. 'सी' से साफ प्रतिकृति ख से पहले स्थानांतरित कर रहा है, जो करने के बाद साफ पानी सतहों का प्रतिनिधित्व करता हैएक तांबे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर पुनः प्राप्त eing.

8 चित्रा Cilia फ्रीज फ्रैक्चर से पता चला संबंधित संरचनाओं. व्हाइट तीर ciliogenesis के दौर से गुजर उपकला कोशिकाओं की luminal सीमा पर विशेष झिल्ली कण सरणियों को इंगित. ये कण सरणियों आकस्मिक और परिपक्व सिलिया (काला तीर) के ठिकानों पर रहते हैं जो नवजात सिलिअरी हार का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा अस्थिभंग उपकला कोशिका झिल्ली प्रकट माध्यम से PF- और एफई फ्रैक्चर चेहरे के उदाहरण हैैं. तंग junctional परिसरों का किनारा और नाली संगठन स्पष्ट है और कहनेवाला अंतरिक्ष तीर द्वारा चिह्नित है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 10 चूहा जिगर में एक अंतर जंक्शन के एक फ्रीज फ्रैक्चर छवि. कण पीएफ-चेहरे पर स्पष्ट कर रहे हैं और पूरक गड्ढों एफई चेहरे पर स्पष्ट कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

4 / 51694fig11highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
एक कोलाइडयन सोने का उपयोग कर एक connexin का आंकड़ा 11 Immunohistochemical स्थानीयकरण अंतराल जंक्शन पर विशिष्ट स्थानीयकरण illustrating एक फ्रीज फ्रैक्चर तैयारी पर एंटीबॉडी लेबल. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

12 चित्रा गहरे नक़्क़ाशी और रोटरी ग्रहण के साथ तेजी से ठंड का एक उदाहरण है. उपकला कोशिका कोशिका द्रव्य के माध्यम से खंडित कर दिया गया है और एक पीएफ चेहरा स्पष्ट (तीर) है. तीर के पीछे बाद नक़्क़ाशी से पता चला एक सच्चे कोशिका की सतह देखा जा सकता है. कृपया सीएलआईइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां सी.के..

13 चित्रा एक गोजातीय सांस की नली ciliaryaxoneme शामिल आणविक परिसरों प्रकट करने के लिए गहरे नक़्क़ाशी और रोटरी ग्रहण के साथ तेजी से ठंड का एक उदाहरण है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इसकी शुरूआत और वाणिज्यिक उपलब्धता के बाद के वर्षों में, फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना प्रक्रियाओं को व्यापक रूप से जैविक झिल्ली संरचना की जांच के लिए उपयोग किया गया. दरअसल, झिल्ली की संरचनात्मक विशेषज्ञताओं में से कुछ का सबसे अच्छा दृष्टिकोण फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना तैयारी में प्राप्त किया गया है. इन अध्ययनों से न केवल झिल्ली के संरचनात्मक संगठन की समझ के लिए योगदान दिया लेकिन यह भी संरचना और समारोह से संबंधित हैं कि कैसे में अंतर्दृष्टि प्रदान की है.

दिनचर्या जैविक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आगमन जैविक नमूनों को अंतर इलेक्ट्रॉन घनत्व प्रदान करने के लिए आवश्यक एल्डिहाइड fixatives, प्रतिक्रियाशील रसायनों, और भारी धातुओं के साथ रासायनिक उपचार खुद विरूपण साक्ष्य की पीढ़ी के लिए योगदान दिया है कि एक जागरूकता के बारे में लाया. फ्रीज फ्रैक्चर प्रौद्योगिकी के विकास के प्रसंस्करण विरूपण साक्ष्य को कम करने के प्रयास पर आधारित था. फिर भी, यह कि फ्रीज फ्रैक्चर स्वीकार किया गया है/ खोदना बर्फ क्रिस्टल क्षति है एक प्रमुख, जिनमें से एक कलाकृतियों का अपना सेट, परिचय. ऊतकों के कारण ultrastructural विस्तार काटना कि बर्फ क्रिस्टल के गठन में जो परिणाम नमूना आसपास के नाइट्रोजन गैस का एक इन्सुलेट परत के गठन के लिए तरल नाइट्रोजन अनुभव में सीधे एक कम ठंडा दर गिर गया. यह समस्या ग्लिसरॉल जैसे cryoprotectants के उपयोग के साथ और तरल नाइट्रोजन ठंडा प्रोपेन में पहली ऊतक ठंड से दूर है. ऐतिहासिक, डुबकी ठंड क्लोरोफ्लोरोकार्बन तरल नाइट्रोजन में ठंडा प्रदर्शन किया था लेकिन इन सामग्रियों की वजह से पर्यावरण पर उनके प्रतिकूल प्रभावों के इस्तेमाल से बाहर चरणबद्ध किया गया है. यहां तक ​​कि सबसे अच्छा cryoprotective स्थितियों में, प्रक्रिया की प्रकृति अनिवार्य रूप से cytoplasmic भंग में सतह की तरह एक मोटे, बजरी में यह परिणाम है; हालांकि, झिल्ली संरचनाओं के माध्यम से भंग कोशिका झिल्ली में उनके अभिविन्यास के सापेक्ष विशिष्ट तलीय संगठनों होने अच्छी तरह से आयोजित सुविधाओं प्रकट करते हैं. इन छवियों हैंसंभव केवल कुछ मामलों में बर्फ क्रिस्टल क्षति को सीमित कि ऐसे ग्लिसरॉल के रूप में cryoprotectant एजेंटों का उपयोग करते हैं, और ग्लिसरॉल के साथ ही यह भी झिल्ली जुड़े कणों की artifactual पुनर्वितरण शुरू हो सकता है. इसके अलावा, ग्लिसरॉल इस प्रकार सफल नक़्क़ाशी के लिए अवसर सीमित खंडित सतह से sublimated नहीं किया जा सकता. बाद नक़्क़ाशी प्रक्रिया वांछनीय है, तो नमूना या तो तेजी से तरल हीलियम या नाइट्रोजन कीचड़ या तो उपयोग कर बर्फ क्रिस्टल क्षति को सीमित करता है कि एक फैशन में जमे हुए किया जाना चाहिए और / या आसानी से खंडित से sublimated है जो एसीटोन के रूप में एक cryoprotectant इस तरह के प्रयोग से संपर्क सतहों.

बैल की प्रारंभिक रिपोर्ट वायरस इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया गया है, यह फ्रीज फ्रैक्चर / खोदना अधिक व्यापक आवेदन पाया कि झिल्ली संरचना में है. दरअसल, इस तरह तंग और अंतराल जंक्शनों और सिलिअरी झिल्ली विशेषज्ञताओं के रूप में संरचनाओं सुंदर ढंग से फ्रीज फ्रैक्चर की तैयारी में खुलासा किया गया है. रुक फ्रैक्चर फाउंडेशन हैविकास ^{15, 17,24} के दौरान और झिल्ली पैथोलॉजी ^25-30 में झिल्ली भेदभाव की समझ हासिल करने में डी काफी उपयोगिता. इस प्रयोगशाला से पिछली रिपोर्टों, airway विकास के दौरान तंग junctional परिसरों के भेदभाव के पैटर्न का प्रदर्शन किया है, सिलिअरी झिल्ली प्रयोगात्मक संक्रामक एजेंट जोखिम के साथ जुड़े संरचनाओं, और वायु प्रदूषक और तंबाकू के धुएं जोखिम के साथ जुड़े airway उपकला कोशिकाओं में तंग junctional परिसरों की गिरावट के विघटन प्रायोगिक पशुओं और मानव विषयों में.

तकनीकी एक्सटेंशन रुक फ्रैक्चर / रुक खोदना प्रक्रिया

यहाँ वर्णित नमूनों फ्रीज करने के लिए तरलीकृत प्रोपेन का उपयोग शमन विधि शायद पारंपरिक फ्रीज फ्रैक्चर के लिए जैविक नमूनों ठंड के लिए सबसे आम तरीका है. हालांकि, ठंड के लिए अन्य तरीकों फ्रीज नक़्क़ाशी प्रदर्शन किया जाना है जहां विनियोजित किया जाना चाहिएएड. ग्लिसरॉल एक गैर etchablecryoprotectant है, बर्फ क्रिस्टल के गठन की सीमा कि मायनों में जमे हुए किया जाना चाहिए फ्रीज नक़्क़ाशी के लिए नमूनों. इस तरह के एसीटोन के रूप में और / या नमूना एक धातु की सतह के खिलाफ तरल हीलियम या तरल नाइट्रोजन कीचड़ के साथ ठंडा माउंट ठंड से एक etchablecryoprotectant का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. Cryoprotectants बिना तेजी से ठंड भी तरलीकृत प्रोपेन में ठंड स्प्रे ठंड या उच्च दबाव का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है.

आगे संरचना और समारोह का उपयोग फ्रीज फ्रैक्चर प्रौद्योगिकी से संबद्ध करने के हाल के प्रयासों immunohistochemical लेबलिंग ^{31, 32} के साथ मिलकर इस तकनीक विनियोजित है. यहाँ, विशिष्ट एंटीजन एंटीबॉडी प्रभावी ढंग से और सही झिल्ली साइटों (चित्रा 11) के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता है.

यूनिडायरेक्शनल ग्रहण के साथ फ्रीज फ्रैक्चर अब तक का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के द्वारा होता है, वहीं कुछ प्रयोगात्मक डिजाइन littl के साथ तेजी से ठंड के लिए कॉल करेंगेई या सीमित cryoprotection, इसके विपरीत ¹⁶ (चित्रा 12 और 13 चित्रा) प्रदान करने के लिए सही सेल सतहों, बाह्य मैट्रिक्स, और / या macromolecular परिसर, और रोटरी ग्रहण प्रकट करने के लिए खंडित सतह के नक़्क़ाशी के साथ.

, और आणविक जीव विज्ञान में एक इमेजिंग उपकरण के रूप में इस तकनीक का प्रयोग करने में नैनो में फ्रीज फ्रैक्चर, पदार्थ विज्ञान के आवेदन में एक बढ़ती रुचि है. दरअसल, कई मायनों में nanomaterials फ्रीज फ्रैक्चर मूल इमेजिंग के लिए एक साधन के रूप में परिकल्पित किया गया था, जिसके लिए वायरल संरचनाओं के साथ उनके संगठन में लगातार हो सकता है. इसके अलावा, विनिर्मित liposomes, जैविक झिल्लियों के लिए फार्म में इसी तरह की संरचनाओं, व्यापक रूप से दवा एजेंटों के लक्षित वितरण और निर्देशित जीन थेरेपी के लिए अध्ययन किया जा रहा है. उनके संगठन अनिवार्य है क्योंकि जैसे, फ्रीज फ्रैक्चर प्रसंस्करण विकास में एक घटक के रूप में खुलासा छवियों के निर्माण में काफी उपयोगिता हो सकती है झिल्लीइन उपचारों ³³ पिंग.

संक्षेप में, फ्रीज फ्रैक्चर प्रौद्योगिकियों कोशिका झिल्ली के संगठन और समारोह निस्र्पक में ऐतिहासिक महत्व के लिए किया गया है. हालांकि, फ्रीज फ्रैक्चर इन तेजी से उभरते क्षेत्रों में प्रगति के लिए योगदान देगा लगभग निश्चित रूप से आणविक जीव विज्ञान और नैनो और समन्वय के साथ उपयोगिता के नए क्षेत्रों लग रहा है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
Standard aldehyde fixatives	various suppliers
Sodium dichromate	various suppliers
Sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Propane	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.