RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد آلية تحرير RNA الميتوكوندريا في المثقبيات. وبالمثل، تم إحراز تقدم كبير في تحديد مكونات معقدة editosome التي تحفز تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تعمل هذه البروتينات معا. المركبات الكيميائية التي تم الحصول عليها من شاشة عالية الإنتاجية ضد editosome قد تمنع أو تؤثر على الخطوات واحدة أو أكثر في دورة التحرير. وبالتالي، فإن تحديد مركبات كيميائية جديدة تولد تحقيقات الجزيئية قيمة للتشريح وظيفة editosome والتجمع. في دراسات سابقة، أجريت في المختبر تحرير المقايسات خارج باستخدام الحمض النووي الريبي المسمى الراديو. هذه المقايسات هي مضيعة للوقت وغير فعالة وغير مناسبة لأغراض الإنتاجية العالية. هنا، واستنادا مضان متجانسة "خلط وقياس" المطرقة ribozyme في المختبر مراسل مقايسة لمراقبة التحرير الحمض النووي الريبي، ويرد. فقط نتيجة لتحرير الحمض النووي الريبيوribozyme المطرقة نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) oligoribonucleotide الركيزة يخضع الانقسام. هذا بدوره يؤدي إلى فصل من fluorophore من فاكهه تقضي بالتالي إنتاج إشارة. في المقابل، عندما يتم تثبيط وظيفة editosome، سيتم تطفئ إشارة مضان. هذا هو الاختبار حساسة للغاية والبسيطة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق عموما لمراقبة التحرير في الحمض النووي الريبي المختبر أو إنتاجية عالية الفرز من المواد الكيميائية التي يمكن أن تحول دون وظيفة editosome.
Introduction
عملية تحرير الحمض النووي الريبي، تعديل مرنا ما بعد النسخي، اكتشفت لأول مرة في trypanosomatids 1. منذ ذلك الحين، وقد أجريت أعمال كبيرة في دراسة آلية وراء تحرير الحمض النووي الريبي في المثقبية البروسية 2،3. في سلسلة من التفاعلات الإنزيمية، وeditosome، وهو مجمع الأساسية من حوالي 20 البروتينات، ويخلق mRNAs والميتوكوندريا ناضجة لمكونات متعددة من الأكسدة الفسفرة نظام توليد الطاقة. ترتيب الأحداث الحفاز هو الانقسام endonucleolytic، uridylate (U) بالإضافة أو الحذف، والربط، وفقا لما تمليه الرنا دليل (gRNAs) 4.
بالإضافة إلى البروتينات الأساسية المعقدة editosome، كما تم تحديد عدد من العوامل التبعي 5-7. وتعتبر هذه البروتينات معظمها مجمعة في المجمعات مستقلة. ومع ذلك، من اجل تجميع البروتين في مجمع editosome الأساسية وأنماط التفاعل بين مجمع الأساسية مع ملحقالمجمعات هي لم يتحدد بعد. تستهدف عملية تحرير الحمض النووي الريبي في trypanosomatids قد توفر dissectors الكيميائية التي تساعد في دراسة التجمع وظيفة معقدة editosome. علاوة على ذلك، أظهرت دراسات عدة بروتينات وظيفية على editosome الإستخدامات الأساسية عبر مراحل الحياة المختلفة، مشيرا إلى قدرتها كأهداف المخدرات 8-12. وبالتالي، فإن مثبطات جدت من editosome قد تعمل أيضا مركبات الرصاص ضد trypanosomatids. هذا هو الوقت المناسب، والأدوية المتاحة حاليا ضد الأمراض التي تسببها trypanosomatid سامة، غير فعالة ومكلفة 13،14.
مقايسة فعالة ومريحة في المختبر من الضروري استكشاف الكون الكيميائية لمثبطات معينة التي تعمل على منع تحرير الحمض النووي الريبي. وقد وضعت ثلاثة فحوصات وتستخدم لمراقبة editosome الأنشطة: (أ) جولة كاملة في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 15، (ب) المشقوق مسبقا في المختبر فحص الحمض النووي الريبي تحرير 16،17، والثانية (ج) المطرقة ribozyme (HHR) مقايسة 18 القائم. المقايسات الأولين تعتمد على رؤية مباشرة من المنتج تحريرها (أتباز 6 مرنا) مع مساعدة من النشاط الإشعاعي. يستخدم فحص مقرها HHR-نسخة معدلة من مرنا أتباز 6 التي على غرار لتتصرف كما ribozyme على التحرير. وribozyme وظيفية ثم يشق تحديدا ركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد، بمثابة المراسل. في الآونة الأخيرة، مشيري وآخرون ضعت 'خلط وقياس' المستندة إلى HHR في المختبر مراسل فحص الحمض النووي الريبي لمراقبة التحرير حيث يتم استبدال الركيزة الحمض النووي الريبي رديولبلد مع نقل الطاقة مضان الرنين (الحنق) الركيزة 19. مزايا مبدأ هذا الاختبار هي: (أ) هو مزيج سريع ومريحة ونوع مقياس الفحص، حيث أن إنتاج ribozyme نشطة والركيزة الانقسام تحدث في وقت واحد في نفس الأنبوب في انخفاض حجم (أي 20 ميكرولتر)، (ب ) فإنه يتجنب استخدام المواد المسمى بالإشعاع، (ج) الحساسية التي هيfforded من قبل الأجهزة مضان في شكل لوحة عيار الصغيرة، و (د) إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. باستخدام هذا الاختبار، تم تأكيد تأثير الحمض النووي الريبي معروفة التحرير مثبطات يغاز ضد editosome النقية 19. هذه التجربة التحقق من صحة الاختبار لتحديد السريع لمثبطات تحرير الحمض النووي الريبي، في المقام الأول ضد editosomes كله من T. البروسية.
الرقم 1 هو خطوة بخطوة تخطيطي مفصل للفي المختبر فحص الحمض النووي الريبي التحرير القائم على مضان. هذا البروتوكول يمكن إما أن تستخدم لرصد تحرير الحمض النووي الريبي في المختبر أو يتم تكييفه لفحص المكتبات مركب من المقاييس المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقدم الإنتاجية العالية طريقة الفرز رواية لتحديد مثبطات ضد مجمع التحرير الحمض النووي الريبي من المثقبيات، وتوفير وسيلة جديدة لاكتشاف الأدوية لمواجهة الأمراض التي تسببها trypanosomatids. وقد استند الحنق-ribozyme الفحص المستخدمة على نطاق واسع لأغراض مختلفة 20-22؛ ومع ذلك، ل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
