RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Se ha avanzado considerablemente en la determinación del mecanismo de edición del ARN mitocondrial en tripanosomas. Del mismo modo, se ha avanzado considerablemente en la identificación de los componentes del complejo editosome que catalizan la edición del ARN. Sin embargo, todavía no está claro cómo estas proteínas trabajan juntos. Los compuestos químicos obtenidos a partir de una pantalla de alto rendimiento contra el editosome pueden bloquear o afectar a una o más etapas en el ciclo de edición. Por lo tanto, la identificación de nuevos compuestos químicos generará valiosos sondas moleculares para disecar la función editosome y montaje. En estudios anteriores, los ensayos in vitro de edición pt se llevaron a cabo utilizando ARN radiomarcado. Estos ensayos consumen mucho tiempo, ineficiente e inadecuada para fines de alto rendimiento. Aquí, una basada en la fluorescencia homogénea "de mezcla y medida" reportero de ensayo martillo ribozima in vitro para monitorear la edición de ARN, se presenta. Sólo como consecuencia de la edición de ARN dela ribozima cabeza de martillo un sustrato oligorribonucleótido transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se somete a la escisión. Esto a su vez resulta en la separación del fluoróforo de la inhibidor de la fluorescencia produciendo de este modo una señal. En contraste, cuando la función de editosome se inhibe, se apagará la señal de fluorescencia. Se trata de un ensayo altamente sensible y simple que debe ser de aplicación general para vigilar pt la edición de ARN in vitro o cribado de alto rendimiento de los productos químicos que pueden inhibir la función editosome.
Introduction
El proceso de edición de ARN, una modificación post-transcripcional del mRNA, fue descubierto por primera vez en tripanosomátidos 1. Desde entonces, el trabajo sustancial se ha llevado a cabo en el estudio del mecanismo detrás de la edición de ARN en Trypanosoma brucei 2,3. En una serie de reacciones enzimáticas, la editosome, un complejo de núcleo de aproximadamente 20 proteínas, crea ARNm mitocondriales maduros para múltiples componentes del sistema de la fosforilación oxidativa de generación de energía. El orden de los eventos catalíticos es la escisión endonucleolítica, uridilato (U) adición o supresión, y la ligadura, según lo dictado por los ARN guía (gRNAs) 4.
Además de las principales proteínas editosome complejos, un número de factores accesorios también se han identificado 5-7. Estas proteínas se consideran sobre todo agrupadas en complejos independientes. Sin embargo, el orden de ensamblaje de proteínas en el complejo editosome núcleo y los patrones de interacción del complejo central con el accesoriocomplejos están aún por determinar. Orientación del proceso de edición del ARN en tripanosomátidos puede proporcionar disectores químicas que ayudan en el estudio de la asamblea y función del complejo editosome. Además, los estudios funcionales en varias proteínas editosome han demostrado esencialidad a través de diferentes etapas de la vida, lo que indica su potencial como medicamento actúa 8-12. Por lo tanto, los inhibidores de la editosome han encontrado también pueden actuar como compuestos de plomo contra los tripanosomátidos. Esto es oportuna, ya que los fármacos actualmente disponibles contra las enfermedades causadas por trypanosomatid son tóxicos, ineficiente y costoso 13,14.
Un ensayo eficiente y conveniente in vitro es necesario explorar el universo químico de inhibidores específicos que bloquean la edición del ARN. Tres ensayos se han desarrollado y utilizado para monitorear editosome actividades: (a) ronda completa en el ensayo de la edición de ARN in vitro 15, (b) pre-troceados en el ensayo de la edición de ARN in vitro 16,17, unnd ensayo 18 (c) de martillo ribozimas (HHR)-basado. Los dos primeros ensayos se basan en la visualización directa del producto editado (ATPasa 6 ARNm) con la ayuda de la radiactividad. El ensayo basado en HHR utiliza una versión modificada de la ATPasa 6 ARNm que se modela a comportarse como una ribozima en la edición. La ribozima funcional entonces hiende específicamente a un sustrato de ARN radiomarcado, que sirve como un reportero. Recientemente, Moshiri et al. Desarrolló una 'mezcla y medir' HHR-basado pt reportero de ensayo in vitro para monitorizar la edición del ARN en el que el sustrato de ARN radiomarcado se sustituye con una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) sustrato 19. Las ventajas principales de este ensayo son: (a) es una mezcla rápida y conveniente y el tipo de medida de ensayo, como la producción de ribozima activa y de escisión de sustrato se producen simultáneamente en el mismo tubo en bajo volumen (es decir, 20 l), (b ) que evita el uso de materiales marcados radiactivamente, (c) la sensibilidad que es unfforded por la instrumentación de fluorescencia en un formato de placa de microtitulación, y (d) una elevada relación señal-ruido. Utilizando este ensayo, el efecto de los inhibidores de la edición de ARN ligasa conocidos contra editosome purificado se confirmó 19. Este experimento valida el ensayo para la identificación rápida de los inhibidores de la edición de ARN, principalmente contra editosomes enteros de T. brucei.
La figura 1 es un esquema detallado paso a paso del ensayo pt la edición de ARN in vitro basado en la fluorescencia. Este protocolo puede ser utilizado para el seguimiento de la edición de ARN in vitro o ser fácilmente adaptado para el cribado de bibliotecas de compuestos de diversas escalas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un método de cribado de alto rendimiento novedoso para identificar inhibidores contra el complejo de la edición de ARN de tripanosomas se presentó, proporcionando una nueva herramienta para el descubrimiento de fármacos para combatir enfermedades causadas por los tripanosomátidos. Ensayo FRET basado ribozima-ha sido ampliamente utilizado para diferentes propósitos 20-22; Sin embargo, hemos utilizado la capacidad de ensayo de ribozima basada en FRET para el control in vitro de la activi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
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