トリパノソーマにおけるRNA編集に対する薬剤をスクリーニングするためのレポーターとして、RNA触媒
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
実質的な進歩は、トリパノソーマにおけるミトコンドリアRNA編集のメカニズムを決定する際になされたものである。同様に、かなりの進歩は、RNA編集を触媒editosome複合体の成分を同定してなされたもの。しかし、これらのタンパク質がどのように連携するか、まだ明らかではない。 editosomeに対するハイスループットスクリーニングから得られた化学化合物は、編集サイクルにおける1つ以上のステップをブロックするか、または影響を及ぼし得る。したがって、新規な化学化合物の同定はeditosome機能およびアセンブリを切開するための貴重な分子プローブを生成する。以前の研究において、 インビトロ編集アッセイは、放射標識RNAを用いて行った。これらのアッセイは、ハイスループット目的のために非効率的で時間のかかる不適当である。ここでは、均質な蛍光ベース「ミックスと測定」RNA編集を監視するためにハンマーヘッドリボザイムのin vitroレポーターアッセイを、提示されている。唯一のRNA編集の結果としてハンマーヘッド型リボザイム蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）オリゴリボヌクレオチド基質は、切断を受ける。これは、順番に、それによって信号を生成するクエンチャーからのフルオロフォアの分離をもたらす。 editosome機能が阻害されると対照的に、蛍光シグナルをクエンチする。これは、 インビトロ RNA編集またはeditosomeの機能を阻害することができる化学物質のハイスループットスクリーニングで監視することが一般的に適用可能であるべきで高感度かつ簡単なアッセイである。
Introduction
RNA編集、mRNAの転写後修飾のプロセスは、第1 trypanosomatidsに発見された。それ以来、かなりの作業がトリパノソーマ 2,3におけるRNA編集のメカニズムを研究してなされた。一連の酵素反応において、editosome、約20のタンパク質のコア複合体は、エネルギー発生の酸化的リン酸化系の複数のコンポーネントのための成熟したミトコンドリアmRNAを作成する。触媒のイベントの順序は、ガイドRNA（gRNAs）によって指示されるように、ヌクレオチド鎖切断、ウリジレート（U）追加や削除、および連結される4。
コアeditosome複合タンパク質に加えて、補因子の数も5-7同定されている。これらのタンパク質は、主に独立した複合体にグループ化が見られる。しかし、コアeditosome複合体におけるタンパク質集合の順序や小物とのコア複合体の相互作用パターン複合体は、まだ決定されている。 trypanosomatidsにおけるRNA編集処理をターゲットとすると、そのeditosome複合体の構築と機能を研究する際の補助化学解剖器具を提供することがあります。さらに、いくつかのeditosomeタンパク質に関する機能的研究は、薬剤が8月12日を対象として、その可能性を示す、様々なライフステージ全体の本質を示している。したがって、editosome見出さの阻害剤はまた、trypanosomatidsに対するリード化合物として作用することができる。トリパノソーマによって引き起こされる疾患に対して、現在利用可能な薬剤は、毒性が非効率的で13,14高価ですので、これは、タイムリーである。
効率的で便利なin vitroアッセイは、RNA編集をブロックする特異的阻害剤の化学の世界を探求することが必要である。 3つのアッセイが開発されeditosome活動を監視するために使用されている： インビトロ RNA編集アッセイ15（a） において 、フルラウンド、（b）は、 インビトロ RNA編集アッセイ16,17 に予め切断されND（C）ハンマーヘッドリボザイム（HHR）ベースのアッセイ18。最初の2つのアッセイは、放射能の助けを借りて編集された製品（ATPアーゼ6 mRNA）の直接可視化に依存しています。 HHRベースのアッセイは、編集時リボザイムとして動作するようにモデル化されているATPアーゼ6 mRNAの修正版を使用しています。機能的なリボザイムはその後、具体的レポーターとして、放射性標識されたRNA基質を切断する。最近、母子里らは、「ミックスおよび測定」を開発放射性標識RNA基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）基板19で置換されているRNA編集を監視するために、インビトロレポーターアッセイで HHR系。このアッセイの原理の利点は、（a）は、アクティブリボザイムと基質切断の生産が低量（ すなわち 20μL）で同一チューブ内で同時に発生すると、迅速かつ便利なミックスと分析の指標の一種で、（B ）は、放射性標識物質の使用を回避し、（c）の感度すなわち蛍光マイクロタイタープレート形式で計測、および（d）は高い信号対雑音比によってfforded。このアッセイを用いて、精製されたeditosomeに対する既知のRNA編集リガーゼ阻害剤の効果は、19を確認した。この実験は、主にTから全体editosomesに対して、RNA編集酵素阻害剤の迅速な同定のためのアッセイを検証ブルーセイ 。
図1は、蛍光ベースのインビトロ RNA編集アッセイでの詳細なステップバイステップの概略図である。このプロトコルは、 インビトロで監視RNA編集のために使用することができるいずれかまたは容易に様々なスケールの化合物ライブラリをスクリーニングするために適合され得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
トリパノソーマのRNA編集複合体に対する阻害剤を同定するための新規のハイスループットスクリーニング方法はtrypanosomatidsによって引き起こされる疾患に対抗する創薬のための新しいツールを提供し、提示された。 FRETベースのリボザイムアッセイは広範囲に異なる目的のために20〜22に使用されている;しかしながら、我々は、RNA編集アクティビティ19 のインビトロ監?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
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