ARN catalyseur en tant que reporter pour le criblage de médicaments contre l'ARN Édition dans trypanosomes
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Des progrès substantiels ont été accomplis dans la détermination du mécanisme de l'édition de l'ARN mitochondrial chez les trypanosomes. De même, des progrès considérables ont été réalisés dans l'identification des composants du complexe de éditosome qui catalysent édition de l'ARN. Cependant, il n'est pas encore clair comment ces protéines fonctionnent ensemble. Les composés chimiques obtenus à partir d'un écran à haut débit contre la éditosome peuvent bloquer ou affecter une ou plusieurs étapes du cycle d'édition. Par conséquent, l'identification de nouveaux composés chimiques va générer des sondes moléculaires utiles pour disséquer la fonction de éditosome et l'assemblage. Dans des études antérieures, des essais in vitro de modification ont été réalisées en utilisant l'ARN radiomarqué. Ces tests prennent du temps, inefficace et inadapté à des fins à haut débit. Ici, une base de fluorescence homogène "mélanger et mesurer" marteau ribozyme test in vitro de reporter à surveiller édition de l'ARN, est présenté. Qu'à la suite de l'édition d'ARN d'le ribozyme en tête de marteau d'un substrat de oligoribonucléotide transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) subit un clivage. Ceci à son tour conduit à la séparation du fluorophore de l'agent d'extinction en produisant ainsi un signal. En revanche, lorsque la fonction de éditosome est inhibé, le signal de fluorescence est éteinte. Il s'agit d'un test très sensible et simple qui devrait être généralement applicables à surveiller dans l'édition de l'ARN in vitro ou criblage à haut débit de produits chimiques qui peuvent inhiber la fonction de éditosome.
Introduction
Le processus d'édition de l'ARN, une modification de l'ARNm post-transcriptionnelle, a été découvert en trypanosomatidés 1. Depuis lors, d'importants travaux ont été réalisés en étudier le mécanisme derrière édition de l'ARN chez T. brucei 2,3. Dans une série de réactions enzymatiques, la éditosome, un complexe de base de l'ordre de 20 protéines, crée des ARNm matures mitochondriales pour plusieurs composants du système de la phosphorylation oxydative de la production d'énergie. L'ordre des événements est catalytiques clivage endonucléolytique, uridylate (U) ajout ni suppression, et la ligature, comme dicté par ARN guides (ARNg) 4.
En plus des protéines essentielles éditosome complexes, un certain nombre de facteurs accessoires ont également été identifiés 5-7. Ces protéines sont observés essentiellement regroupés dans les complexes indépendants. Cependant, l'ordre d'assemblage des protéines dans le complexe de éditosome de base et les modèles d'interaction du complexe de base de l'accessoirecomplexes sont encore à déterminer. Cibler le processus d'édition de l'ARN dans trypanosomatidés peut fournir aux ciseaux chimiques que l'aide à l'étude de l'assemblage et de la fonction du complexe éditosome. En outre, des études fonctionnelles sur plusieurs protéines éditosome ont montré essentialité dans les différents stades de la vie, en indiquant leur potentiel en tant que médicament cible 8-12. Par conséquent, les inhibiteurs de la éditosome trouvés peuvent également agir en tant que composés de plomb contre trypanosomatidés. C'est rapide, comme les médicaments actuellement disponibles contre les maladies causées par trypanosomatide sont toxiques, inefficace et coûteux 13,14.
Un essai in vitro efficace et pratique est nécessaire d'explorer l'univers chimique d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent édition de l'ARN. Trois tests ont été mis au point et utilisé pour surveiller éditosome activités: (a) tour complet test in vitro de l'édition de l'ARN 15, (b) pré-coupés test in vitro de l'édition de l'ARN 16,17, une (c) ribozyme en tête de marteau (RHS) à base de dosage 18. Les deux premiers essais reposent sur la visualisation directe du produit modifié (ATPase six ARNm) avec l'aide de la radioactivité. L'analyse basée sur la HHR utilise une version modifiée de l'ATPase 6 ARNm qui est modélisée à se comporter comme un ribozyme à l'édition. Le ribozyme fonctionnelle clive ensuite spécifiquement un substrat d'ARN radiomarqué, servant en tant que journaliste. Récemment, Moshiri et al. Développé un "mélange et mesure" HHR-fondé pt essai rapporteur in vitro pour surveiller édition de l'ARN, où le substrat de l'ARN radiomarqué est remplacé par un transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) du substrat 19. Les principaux avantages de ce dosage sont les suivants: (a) il s'agit d'un mélange rapide et commode et le type de dosage de mesure, comme la production de ribozyme actif et clivage du substrat se produisent simultanément dans le même tube à faible volume (20 ul), (b ) elle permet d'éviter l'utilisation de matières radiomarquées, (c) la sensibilité qui est unfforded par fluorescence instrumentation dans un format de plaque de micro-titrage, et (d) un signal de niveau haut par rapport au bruit. En utilisant ce dosage, l'effet des inhibiteurs connus de l'ARN ligase de montage de contre éditosome purifié a été confirmée 19. Cette expérience a validé le test pour l'identification rapide des inhibiteurs de l'édition de l'ARN, principalement contre editosomes entiers de T. brucei.
La figure 1 est un schéma détaillé étape par étape de l'essai in vitro de l'édition de l'ARN à base de fluorescence. Ce protocole peut être utilisé soit pour la surveillance de l'édition de l'ARN in vitro ou facilement être adapté pour le criblage de banques de composés de diverses échelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une méthode de criblage à haut débit roman pour identifier des inhibiteurs contre le complexe d'édition de l'ARN de trypanosomes a été présenté, en fournissant un nouvel outil pour la découverte de médicaments pour lutter contre les maladies causées par trypanosomatidés. Dosage de ribozyme à base de FRET a été largement utilisé à des fins différentes de 20 à 22; Cependant, nous avons utilisé le test de capacité de ribozyme à base de FRET pour la surveillance in vitro de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
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