RNA Catalisador como repórter para Triagem Drogas contra edição de RNA em Tripanossomas
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Um progresso substancial foi feito para determinar o mecanismo de edição de RNA mitocondrial em tripanossomas. Da mesma forma, um progresso considerável foi feito na identificação dos componentes do complexo editosome que catalisam edição RNA. No entanto, ainda não está claro como as proteínas funcionam juntos. Os compostos químicos obtidos a partir de uma tela de alto rendimento contra o editosome pode bloquear ou afectar um ou mais passos no ciclo de edição. Portanto, a identificação de novos compostos químicos que geram sondas moleculares valiosos para dissecar a função editosome e montagem. Em estudos anteriores, os ensaios in vitro de edição foram realizadas utilizando ARN marcado com rádio. Estes ensaios são demorados, ineficiente e inadequado para fins de alto rendimento. Aqui, um baseado em fluorescência homogênea "misturar e medir" ensaio repórter martelo ribozyme in vitro para monitorar a edição de RNA, é apresentado. Apenas como conseqüência da edição de RNAa ribozima uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato oligoribonucleotide sofre clivagem. Isto por sua vez resulta na separação do fluoróforo do extintor, produzindo assim um sinal. Em contraste, quando a função editosome é inibida, o sinal de fluorescência será extinta. Este é um método altamente sensível e simples, que devem ser aplicadas para controlar a edição de ARN in vitro ou elevado rendimento de rastreio de produtos químicos que podem inibir a função editosome.
Introduction
O processo de edição de RNA, uma modificação mRNA pós-transcricional, foi descoberto pela primeira vez em tripanosomatídeos 1. Desde então, o trabalho substancial foi realizada em estudar o mecanismo por trás edição de RNA em Trypanosoma brucei 2,3. Em uma série de reacções enzimáticas, a editosome, um complexo de núcleo de cerca de 20 proteínas, cria mRNAs mitocondriais maduros para vários componentes do sistema de geração de energia a fosforilação oxidativa. A ordem dos eventos catalíticos é clivagem endonucleolítica, uridylate (U) adição ou exclusão, e ligadura, como ditado por RNAs guia (gRNAs) 4.
Além das proteínas complexas editosome núcleo, um certo número de factores acessórios também foram identificadas 5-7. Estas proteínas são vistas principalmente agrupadas em complexos independentes. No entanto, a ordem de montagem de proteínas no complexo editosome núcleo e os padrões de interacção do complexo de núcleo com o acessóriocomplexos estão ainda a ser determinado. Visando o processo de edição de RNA em tripanosomatídeos pode fornecer dissectores químicas que ajudam no estudo do conjunto e de função do complexo editosome. Além disso, estudos funcionais em várias proteínas editosome mostraram essencialidade em diferentes fases da vida, indicando o seu potencial como droga atinge 8-12. Portanto, os inibidores da editosome encontrados também podem actuar como compostos de chumbo contra tripanosomatideos. Este é oportuna, como drogas atualmente disponíveis contra doenças causadas por tripanossomatídeo são tóxicos, ineficiente e caro 13,14.
Um ensaio eficiente e conveniente in vitro é necessário explorar o universo químico para inibidores específicos que bloqueiam edição RNA. Três ensaios foram desenvolvidos e utilizados para monitorar editosome atividades: (a) volta completa em ensaio edição de RNA in vitro 15, (b) pré-clivada em ensaio edição de RNA in vitro 16,17, umª ensaio 18 (c) martelo ribozyme (HHR)-based. Os dois primeiros ensaios de contar com visualização direta do produto editado (ATPase 6 mRNA) com a ajuda de radioatividade. O ensaio baseia-HHR utiliza uma versão modificada da ATPase 6 ARNm que é modelada para se comportar como um ribozima mediante edição. A ribozima funcional então cliva especificamente um substracto de ARN marcado radioactivamente, que serve como um repórter. Recentemente, Moshiri et al. Desenvolveu um "misturar e medir 'HHR-base no ensaio in vitro repórter para monitorizar a edição de ARN em que o substrato de RNA marcado radioactivamente é substituído por uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) do substrato 19. As principais vantagens deste ensaio são os seguintes: (a) é uma mistura rápida e conveniente e medida do tipo de ensaio, como a produção de ribozima activa e substrato de clivagem ocorrer simultaneamente no mesmo tubo em baixo volume (isto é, 20 mL), (b ) que evita a utilização de materiais marcados radioactivamente, (c), que é uma sensibilidadefforded por instrumentação de fluorescência em um formato de placa de micro-titulação, e (d) um sinal de alta-ruído. Utilizando este ensaio, o efeito de inibidores conhecidos de ligase de RNA de edição contra editosome purificada foi confirmada 19. Este experimento validou o ensaio para a rápida identificação de inibidores de edição de RNA, principalmente contra editosomes inteiros de T. brucei.
A Figura 1 é um esquema detalhado passo-a-passo do ensaio na edição de ARN in vitro baseados em fluorescência. Este protocolo pode ser utilizado para monitorizar a edição de ARN in vitro ou ser facilmente adaptado para o rastreio de bibliotecas de compostos de diversas escalas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um método de triagem romance de alto rendimento para identificar inibidores contra o complexo RNA edição de Tripanossomas foi apresentado, fornecendo uma nova ferramenta para a descoberta de medicamentos para combater as doenças causadas por tripanosomatídeos. Ensaio ribozyme baseado trastes tem sido amplamente utilizado para diferentes fins 20-22; no entanto, nós utilizamos a capacidade de ensaio ribozyme baseado em FRET para o monitoramento in vitro de edição de RNA atividade 19.…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
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