RNA Catalyst come reporter per lo screening dei farmaci contro l'RNA Editing in tripanosomi
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Notevoli progressi sono stati compiuti nel determinare il meccanismo mitocondriale RNA editing in trypanosomes. Allo stesso modo, sono stati compiuti notevoli progressi nell'identificazione dei componenti del complesso editosome che catalizzano RNA editing. Tuttavia, non è ancora chiaro come queste proteine lavorino insieme. Composti chimici ottenuti da uno schermo ad alta velocità contro il editosome possono bloccare o influenzare una o più fasi del ciclo di editing. Pertanto, l'identificazione di nuovi composti chimici genererà sonde molecolari importanti per sezionare la funzione editosome e assemblaggio. In studi precedenti, in vitro saggi di modifica de sono stati effettuati utilizzando RNA radio-marcato. Questi test sono molto tempo, inefficace e inadatto per scopi di high-throughput. Qui, una con sede a fluorescenza omogenea "mix e misurare" martello ribozyme in vitro giornalista per monitorare RNA editing, viene presentato. Solo come conseguenza di RNA editing diil ribozyme martello una risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET) substrato oligoribonucleotide subisce scissione. Questo a sua volta provoca la separazione del fluoroforo dal quencher producendo così un segnale. Al contrario, quando la funzione editosome è inibita, si spegnerà il segnale di fluorescenza. Questo è un test altamente sensibile e semplice che dovrebbe essere generalmente applicabile per monitorare in vitro RNA editing o high throughput screening delle sostanze chimiche che possono inibire la funzione editosome.
Introduction
Il processo di editing dell'RNA, una modifica mRNA post-trascrizionale, è stato scoperto nel trypanosomatids 1. Da allora, il lavoro sostanziale è stato condotto nello studio del meccanismo che sta dietro RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In una serie di reazioni enzimatiche, la editosome, un complesso nucleo di circa 20 proteine, crea mRNA mitocondriali maturi per più componenti del sistema di fosforilazione ossidativa di generazione di energia. L'ordine degli eventi catalitici è scissione endonucleolitico, uridylate (U), aggiunta o cancellazione, e legatura, come dettato dalla RNA guida (gRNAs) 4.
Oltre al nucleo proteine editosome complessi, un numero di fattori accessori sono stati anche identificati 5-7. Queste proteine si osservano principalmente raggruppati in complessi indipendenti. Tuttavia, l'ordine di montaggio proteina nel complesso nucleo editosome e gli schemi di interazione del complesso nucleo con l'accessoriocomplessi sono ancora da determinare. Targeting il processo di editing RNA in trypanosomatids può prevedere dissettori chimici che aiuti a studiare l'assemblaggio e la funzione del complesso editosome. Inoltre, studi funzionali in diverse proteine editosome hanno dimostrato l'essenzialità attraverso diverse fasi della vita, indicando la loro potenziale come bersagli farmacologici 8-12. Pertanto, gli inibitori trovate del editosome possono anche agire come composti di piombo contro trypanosomatids. Questo è tempestivo, in quanto i farmaci attualmente disponibili contro le malattie causate da trypanosomatid sono tossici, inefficiente e costoso 13,14.
Un test efficiente e conveniente in vitro è necessario per esplorare l'universo chimica per inibitori specifici che bloccano RNA editing. Tre saggi sono stati sviluppati e utilizzati per monitorare editosome attività: (a) ciclo completo in vitro RNA editing saggio di 15, (b) pre-spaccati in vitro RNA editing saggio di 16,17, unnd dosaggio 18 (c) martello ribozyme (HHR)-based. I primi due saggi si basano sulla visualizzazione diretta del prodotto modificato (ATPasi 6 mRNA) con l'aiuto di radioattività. Il saggio basato HHR utilizza una versione modificata del ATPasi 6 mRNA che viene modellato a comportarsi come un ribozima su editing. Il ribozima funzionale poi specificamente ad un substrato RNA radiomarcato, che serve come reporter. Recentemente, Moshiri et al. Sviluppato un 'mescolare e misurare' HHR-basato in vitro reporter per monitorare RNA editing dove il substrato RNA radiomarcato viene sostituito con un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrato 19. I vantaggi principali di questo saggio sono: (a) è un mix rapido e conveniente e misura tipo di dosaggio, come la produzione di ribozima attivo e substrato fenditura si verificano simultaneamente nella stessa provetta a basso volume (cioè 20 microlitri), (b ) evita l'uso di materiali marcati radioattivamente, (c) sensibilità che è unfforded da fluorescenza strumentazione in un formato di piastra di micro-titolazione, e (d) un alto rapporto segnale-rumore. Usando questo test, l'effetto di inibitori noti RNA editing ligasi contro editosome purificato è stato confermato 19. Questo esperimento convalidato il test per la rapida identificazione di inibitori di RNA editing, soprattutto contro editosomes interi da T. brucei.
La figura 1 è uno schema dettagliato passo-passo del saggio in vitro RNA editing basato sulla fluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato sia per il monitoraggio RNA editing in vitro o facilmente essere adattato per lo screening di librerie di composti di varie scale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un metodo di screening high-throughput romanzo per identificare inibitori contro il complesso RNA editing dei tripanosomi è stato presentato, fornendo un nuovo strumento per la scoperta di farmaci per combattere malattie causate da trypanosomatids. Test ribozyme-based FRET è stato ampiamente utilizzato per diversi scopi 20-22; Tuttavia, abbiamo utilizzato la capacità di dosaggio ribozima basato FRET per il monitoraggio di attività in vitro editing dell'RNA 19. Questa analisi potreb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
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