РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Существенный прогресс был достигнут в определении механизма митохондриальной редактирования РНК в трипаносом. Точно так же, значительный прогресс был достигнут в выявлении компоненты editosome комплекса, которые катализируют редактирование РНК. Тем не менее, он по-прежнему не ясно, как эти белки работают вместе. Химические соединения, полученные с экрана высокой пропускной против editosome может блокировать или повлиять на один или более этапов в цикле редактирования. Таким образом, выявление новых химических соединений будет генерировать ценные молекулярные зонды для рассечения функцию editosome и сборку. В предыдущих исследованиях, в пробирке редактирования анализы проводились с использованием радиоактивно меченного РНК. Эти анализы требуют много времени, неэффективны и не подходят для целей высокой пропускной. Здесь, однородная флуоресценции основе "смешивать и измерения" молот рибозим в пробирке репортер анализа для мониторинга редактирование РНК, представлена. Только как следствие редактирования РНКмолот рибозим флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) олигорибонуклеотид субстрат подвергают расщеплению. Это в свою очередь приводит к разделению флуорофора от гасителя с получением таким образом сигнал. В противоположность этому, когда функция editosome ингибируется, сигнал флуоресценции будет гасили. Это очень чувствительный и простой анализ, который должны широко применяться для мониторинга в пробирке редактирования РНК или высокопроизводительного скрининга химических веществ, которые могут препятствовать функцию editosome.
Introduction
Процесс редактирования РНК, пост-транскрипционного модификации мРНК, был впервые обнаружен в trypanosomatids 1. С тех пор, значительная работа была проведена в изучении механизма за редактирование РНК в Trypanosoma brucei 2,3. В серии ферментативных реакций, editosome, основной комплекс около 20 белков, создает зрелых митохондриальных мРНК для нескольких компонентов генерирующего энергию окислительного фосфорилирования системы. Порядок каталитических событий эндонуклеолитического декольте, uridylate (U) добавление или удаление, и перевязки, как это диктуется направляющих РНК (gRNAs) 4.
В дополнение к основным editosome сложных белков, ряд дополнительных факторов были также определены 5-7. Эти белки в основном видели сгруппированы в независимых комплексов. Тем не менее, порядок сборки белка в editosome комплекса основного и шаблоны взаимодействия основного комплекса с аксессуаркомплексы еще предстоит определить. Ориентация на процесс редактирования РНК в trypanosomatids может обеспечить химические Диссекторы, которые помогают в изучении сборку и функцию editosome комплекса. Кроме того, функциональные исследования на нескольких editosome белков показали существенности через разных этапах жизни, что свидетельствует об их потенциал как препарат нацелен 8-12. Таким образом, найдено ингибиторы editosome может также действовать в качестве ведущих соединений против trypanosomatids. Это своевременно, как имеющиеся в настоящее время препараты против заболеваний, вызванных trypanosomatid являются токсичными, неэффективной и дорогой 13,14.
Эффективным и удобным для анализа в пробирке необходимо исследовать химический вселенную для специфических ингибиторов, которые блокируют редактирование РНК. Три анализы были разработаны и используются для мониторинга editosome деятельности: (а) полный раунд в пробирке редактирования РНК анализа 15, (б) предварительно расщепляется в пробирке редактирования РНК анализа 16,17,й (с) молот рибозим (HHR) на основе анализа 18. Первые два анализы полагаться на прямой визуализации редактируемого продукта (АТФазы 6 мРНК) с помощью радиоактивности. HHR основе анализа использует модифицированную версию АТФазы 6 мРНК, что моделируется вести себя как рибозим при редактировании. Функциональная Рибозим затем специально расщепляет радиоактивной РНК субстрат, выступающей в качестве репортера. Недавно Moshiri соавт. Разработали 'смешивать и измерять' HHR основе в пробирке анализе репортерного контролировать редактирование РНК, где радиоактивно помеченных РНК-подложка заменяется переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) подложки 19. Основными преимуществами данного анализа являются: (а) это быстрый и удобный смеси и мера тип анализа, как производство активного рибозима и подложки расщепления происходят одновременно в той же пробирке в малом объеме (т.е. 20 мкл), (б ) это позволяет избежать использования радиоактивно меченых материалов, (в) чувствительность то естьfforded с помощью флуоресцентной приборов в формате микро-титра пластины, и (г) высокое отношение сигнал-шум. С помощью этого анализа, эффект известными редактирование РНК лигазы ингибиторов против очищенного editosome было подтверждено 19. Этот эксперимент подтвердил правильность анализа для быстрой идентификации ингибиторов редактирования РНК, в первую очередь против целых editosomes от Т. brucei.
Рисунок 1 представляет собой подробное шаг за шагом схема флуоресценция основе в пробирке редактирования РНК анализа. Этот протокол может быть использован для мониторинга редактирование РНК в пробирке или быть легко адаптирована для скрининга библиотек соединений различных масштабов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Роман высокой пропускной метод скрининга для идентификации ингибиторов против редактирования комплекса РНК трипаносом был представлен, обеспечивая новый инструмент для открытия новых лекарств для борьбы заболеваний, вызванных trypanosomatids. FRET основе Рибозим анализ широко используется …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
