Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Önemli bir ilerleme trypanosom mitokondriyal RNA düzenleme mekanizmasını belirleyen yapılmıştır. Benzer bir şekilde, önemli bir ilerleme RNA düzenlemeyi katalize editosome kompleksin bileşenleri tespit yapılmıştır. Ancak, bu proteinlerin nasıl birlikte çalıştığını hala net değildir. Editosome karşı yüksek verimli bir ekrandan edilen kimyasal bileşikler, düzenleme çevrimi içinde bir veya daha fazla aşamasını bloke eden ya da etkileyebilir. Bu nedenle, yeni kimyasal bileşiklerin tanımlanması editosome fonksiyonu ve kesme düzeneği için değerli moleküler problar üretecektir. Önceki çalışmalarda, in vitro deneyler, düzenleme, radyo-etiketli RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Bu deneyler zaman verimsiz ve yüksek verimli amaçlar için uygun, alıcıdır. Burada, homojen floresans-esaslı "karıştır ve ölçmek" RNA düzenleme izlemek için bir çekiç ribozim in vitro haberci deneyi sunulmuştur. Sadece bir RNA düzenleme bir sonucu olarakçekiç ribozim, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) oligonükleotid alt-tabaka bölünme geçirmektedir. Bu da, böylece bir sinyal üreten söndürücüden fluorofor ayrılması ile sonuçlanır. Editosome fonksiyonu bloke edildiğinde aksine, floresans sinyali söndürülür olacaktır. Bu in vitro RNA ya da düzenleme editosome fonksiyonunu inhibe kimyasallar yüksek yayılımlı tarama esnasında izlenmesi için genel olarak uygulanabilir olması gerekir, son derece hassas ve basit bir testtir.
Introduction
RNA düzenleme, bir post-transkripsiyonel mRNA modifikasyon bir işlem olup, ilk tripanosomatidlerde 1 keşfedilmiştir. O zamandan beri, önemli iş Tiypanosoma brucei 2,3 RNA düzenleme arkasındaki mekanizmayı inceleyerek yapılmıştır. Enzimatik reaksiyonlar bir dizi olarak, editosome, yaklaşık 20 protein bir çekirdek kompleksi, enerji üretim oksidatif fosforilasyon sisteminin çoklu bileşenleri için olgun mRNA mitokondriyal oluşturur. Katalitik olayların sırası kılavuzu RNA'lar (gRNAs) tarafından dikte gibi, endonükleolitik bölünme, üridilat (U) ekleme veya silme, ve ligasyon 4.
Çekirdek editosome kompleks proteinlerine ilave olarak, yardımcı bir dizi faktör de 5-7 tespit edilmiştir. Bu proteinler daha çok bağımsız kompleksleri gruplandırılmıştır görülür. Ancak, çekirdek editosome kompleks protein montaj sırası ve aksesuar ile çekirdek kompleks etkileşim kalıplarıkompleksleri belirlenecek henüz. Tripanosomatidlerde RNA düzenleme işlemini hedefleme kimyasal Disektörler sağlayabilir ki editosome kompleksinin oluşumu ve işlevi okuyan yardım. Ayrıca, birkaç editosome proteinler üzerinde fonksiyonel çalışmalar ilaç 8-12 hedef olarak potansiyellerini gösteren, farklı yaşam evrelerinde genelinde zorunluluk göstermiştir. Bu nedenle, editosome en bulunan inhibitörleri aynı zamanda tripanosomatidlerde karşı kurşun bileşikleri olarak hareket edebilir. Tripanosomatid neden olduğu hastalıklara karşı mevcut ilaçlar, toksik verimsiz ve 13,14 pahalı gibi bu, zamanında.
Bir etkili ve uygun in vitro deney RNA düzenlemeyi engelleyen özel inhibitörler için kimyasal evreni keşfetmek için gereklidir. Üç deneyleri geliştirilmiş ve editosome aktivitelerini izlemek için kullanılmıştır: vitro RNA düzenleme tahlilinde 15 (a) tam yuvarlak, (b) in vitro RNA düzenleme tahlilinde 16,17, ön ayrıldı and (c) çekiç ribozimi (HHR) deneyi 18-tabanlı. İlk iki deney radyoaktivite yardımıyla düzenlenmiş ürün (ATPase 6 mRNA) doğrudan görselleştirme dayanır. HHR-bazlı analiz düzenleme üzerine bir Ribozim davranmasına modellenmiştir ATPaz 6 mRNA değiştirilmiş bir sürümünü kullanır. Fonksiyonel Ribozim sonra özellikle bir muhabir olarak hizmet veren, radyo etiketli RNA substrat Cleaves. Son zamanlarda, Moshiri'nin et al. Geliştirilmiş bir 'karışımı ve ölçmek' radyo işaretli RNA alt-tabaka, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) alt-tabaka 19 ile değiştirildiği burada RNA düzenleme izlemek için in vitro tahlilinde raportör HHR-göre. Bu testin prensibi avantajlar şunlardır: (a) aktif ribozim ve alt-tabaka bölünme üretim düşük hacimli (örneğin 20 ul) aynı tüp içerisinde aynı anda meydana gibi, hızlı ve uygun bir karışım ve tahlilin ölçmek tür, (b ) bu radyoaktif etiketli malzemelerin kullanımı önler, (c) bir hassasiyeti olduğufloresan bir mikro-titre plaka biçiminde enstrümantasyon, ve (d)-gürültü oranı yüksek bir sinyal ile fforded. Bu tayin kullanılarak, saflaştırılmış editosome karşı bilinen RNA ligaz düzenleme inhibitörlerinin etkisi 19, teyit edilmiştir. Bu deney esas olarak T'den bütün editosomes karşı, RNA düzenleme önleyicilerinin hızlı tespit edilmesi için tahlil doğrulanmış brucei.
Şekil 1 ayrıntılı bir adım adım şemadır flüoresan bazlı vitro RNA düzenleme deneyde gösterilebilir. Bu protokol, ya in vitro RNA ya da düzenleme izleme kolayca çeşitli ölçekler bileşik kütüphanelerinin taranması için adapte edilmesi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypanosom RNA düzenleme kompleksine karşı inhibitörlerini teşhis etmek için yeni bir yüksek veri akışı tarama yöntemi tripanosomatidlerde neden olduğu hastalıkların karşı ilaç keşfi için yeni bir araç temin sunuldu. FRET tabanlı tahlil ribozim yaygın olarak farklı amaçlar 20-22 için kullanılmıştır; ancak, RNA düzenleme aktivitesi 19 in vitro izlenmesi için FRET bazlı ribozim tahlilin kapasitesini kullanılmıştır var. Bu deney, potansiyel olarak, memelile…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Referências
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
