Een<em> In Vitro</em> Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles
Summary
Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole en haar freebase analoge vertonen een lage micromolaire cel cytotoxiciteit. Dit manuscript beschrijft een RNA transcriptie reactie, beeldvorming RNA met ethidiumbromide gekleurde gel en kwantificeren RNA met UV-Vis spectroscopie, teneinde transcriptie remming te bepalen door corroles en toont een eenvoudige methode voor de beoordeling antikanker kandidaat eigenschappen.
Abstract
Chemotherapie gaat vaak gepaard met een breed spectrum van cytotoxische middelen met veel bijwerkingen en beperkte targeting. Corroles zijn een klasse van tetrapyrrolic macrocyclische die differentiële cytostatische en cytotoxische eigenschappen in bepaalde cellijnen, afhankelijk van de identiteit van het gechelateerde metaal en functionele groepen vertonen. De unieke gedrag van gefunctionaliseerde corroles op specifieke cellijnen introduceert de mogelijkheid van gerichte chemotherapie.
Veel antikankergeneesmiddelen worden beoordeeld op hun vermogen om RNA transcriptie remmen. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor RNA-transcriptie in aanwezigheid van bekende en potentiële inhibitoren. De evaluatie van de RNA produkten van de transcriptiereactie door gelelektroforese en UV-Vis spectroscopie levert informatie over remmende eigenschappen van potentiële kandidaten geneesmiddel tegen kanker, met modificaties om de analyse, over hun werkingsmechanisme.
Weinigbekend is over de moleculaire werkingsmechanisme van corrole cytotoxiciteit. In dit experiment, beschouwen we twee corrole verbindingen: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) en freebase analoge 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Een RNA transcriptie assay werd gebruikt om de remmende eigenschappen van de corroles onderzoeken. Vijf transcriptiereacties werden bereid: DNA behandeld met Actinomycine D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc op [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01, respectievelijk, en een onbehandelde controle.
De transcriptiereacties werden geanalyseerd na 4 uur met agarose gelelektroforese en UV-Vis spectroscopie. Er is een duidelijke remming door Ga (tpfc), Actinomycine D, en triptolide.
Dit RNA transcriptie assay kan worden gewijzigd om de mechanistische wordt ingegaan door het variëren van de concentraties van de antikanker complex, DNA of polymerase enzym, of door incubatie van het DNA polymerase of het complexes voor RNA transcriptie; Deze modificaties zouden maken tussen een remming mechanisme met het DNA of het enzym. Het toevoegen van het complex na RNA transcriptie kan worden gebruikt om te testen of de complexen afbreken of hydrolyseren het RNA. Deze test kan ook worden gebruikt om extra antikanker kandidaten bestuderen.
Introduction
Chemotherapie gaat vaak breed-spectrum cytotoxische middelen met ongewenste bijwerkingen en beperkt targeting, maar met een beter begrip van de biologie van kanker, is er een steeds toenemende vraag naar antikankermiddelen met groter kanker targeting werkzaamheid en minder bijwerkingen. 1 menselijke kankercellen veelvuldig worden afhankelijk van één geactiveerd of overexpressie oncogen te overleven. 2 zijn dus vele antikankergeneesmiddelen beoordeeld op hun vermogen om RNA transcriptie remmen. Behandelingen die de expressie van deze transformerende genen blokkeren effectief in het elimineren van kankercellen en leidt tot celdood. 3 Getransformeerde cellen gevoeliger voor verstoringen in RNA transcriptie dan zijn overeenkomstige normale cellen. 4 Antikankergeneesmiddelen die transcriptie remmen verwachting selectief remmen de expressie van de oncogenen die voor de kankercel te overleven. 5 Bijgevolg RNA transcriptie inhibition is een handige manier om potentiële kandidaten medicijn tegen kanker te identificeren en leer meer over hun werkingsmechanisme. Dit protocol laat zien dat Ga (tpfc) remt RNA transcriptie op dezelfde volgorde als de chemotherapie drugs Actinomycine D en triptolide; gelijkaardige vergelijkingen kunnen worden gemaakt met behulp van dit protocol met andere kandidaten medicijn tegen kanker. Actinomycine D is een RNA transcriptie remmer gebruikelijke zwangerschapsduur trofoblastische kanker, testiculaire kanker, Wilm's tumor, rhabdomyosacoma behandelen en Ewing-sarcoom 6. Actinomycine D is gebruikt bij kankertherapie bijna vijftig jaar geleden voor het eerst werd goedgekeurd door de FDA in 1964.Triptolide een selectieve transcriptie remmer die is onderzocht in vitro en in diverse tumordragende diermodellen 30 jaar. 7
De amfifiele macrocyclische aard van corroles schenkt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere klassen van geneesmiddelen zoals kleine moleculen of biologisches. 8-14 De macrocyclische karakter maakt cellulaire permeabiliteit die groter is dan verwacht voor dergelijke grote moleculen, en zijn groot genoeg om met macromoleculaire oppervlakken, zoals eiwitten. 8 Corroles bekend strak covalente complexen vormen met biomoleculen en drugs. 10 Naast de inherente cytotoxiciteit van het corrole raamwerk hebben we aangetoond dat een gesulfoneerd corrole fungeert als een dragermolecuul voor chemotherapeutische middelen, in het bijzonder de DNA-intercalerende antracyclinegeneesmiddel doxorubicine. Wanneer het gesulfoneerde corrole werd toegediend met doxorubicine, werd een 3-voudige verhoging in de IC50 van doxorubicine waargenomen voor DU-145-cellen. 9 corrole raamwerk is stabiel en heeft inherente absorptie en fluorescentie-eigenschappen die bij gefunctionaliseerde ondergaan unieke absorptie verschuivingen die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren. 10 functionalisering van de steiger niet inherent affect de fotofysische eigenschappen van de corrole, 9-15 maar zoals gezien met een gesulfoneerd corrole selectief modificeren van het kader van de corrole kan zijn biologische eigenschappen aanzienlijk veranderen. 16 We hebben eerder geëvalueerd zes metallocorroles tegen zeven menselijke kankercellijnen. De resultaten geven aan dat de toxiciteit tegen menselijke kankercellen is afhankelijk van de specifieke metaalion, evenals functionele groep substitutie. Bijvoorbeeld, gesulfoneerde gallium corroles ervaren hoge cellulaire opname en selectief doorgedrongen tot in de kern van de hersenen uitgezaaide prostaatkanker cellen (DU-145); hetzelfde corrole, hoewel het niet doordringt in de kern van andere cellijnen, vertoont grotere cytotoxiciteit voor borst (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28) en eierstokkanker (OVCAR-3) kankercellen dan prostaatkanker. 9
Eerste celgebaseerde proeven geven aan dat deze verbindingen veelbelovend als anti-kanker therapeutische middelen, die furth grondeer onderzoek naar het werkingsmechanisme. Transcriptie remming wordt waargenomen bij bepaalde organometalische 17-27 en we getracht dit proces een mogelijk mechanisme voor de cytotoxische werking van de corrole familie onderzocht. Deze transcriptie assay biedt een eenvoudige, goedkope en gemakkelijke methode voor het beoordelen van de transcriptie remming, die zal leiden tot meer gedetailleerde informatie over de effecten van deze moleculen in levende cellen.
Hier, de transcriptie remming van gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) en de vrije base analogon 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figuur 1) getest. In tegenstelling tot sommige overgangsmetaalcomplexen, gallium (III) is redox inactief en dus niet direct betrokken is bij de redox proces van redox-gebaseerde metabole routes. 28 Ongeacht, gallium (III) vertoont cytotoxische eigenschappen en is onderzocht voor therapeutische doeleinden. Gallium is de tweede meest veelbelovende metaal voor antikanker geneesmiddelen na platina en heeft vele studies en onderzoeken ondergaan; nitraat en chloride gallium zouten zijn geëvalueerd in klinische studies tegen hepatoma, lymfoom, blaas kanker en andere ziekten. 29-34 Gallium (III) is daarom ideaal voor kanker corrole studies. Aanvankelijke gegevens blijkt Ga (tpfc) en tpfc lage GI 50, de geneesmiddelconcentratie nodig 50% van de maximale celproliferatie inhiberen, met diverse kankercellijnen (zie figuur 2); Dit bevestigt de geldigheid van verdere experimenten op deze twee verbindingen om hun remmende eigenschappen te bepalen. We vergelijken deze verbindingen met de gemeenschappelijke geneesmiddelen tegen kanker Actinomycine D en triptolide. Actinomycine D intercalaten DNA, RNA rek remt en apoptose in bepaalde cellijn picomolaire concentraties 6,35-37 Triptolide blijkt tumorgroei te remmen.; het bindt aan menselijke XPB / ERCC3 een subeenheid of transcriptiefactor TFIIH, leidt tot remming van RNA-polymerase II-activiteit. 6-7,38-40
Terwijl het algemeen bekend dat corroles vertonen cytotoxische eigenschappen, bestaat er weinig informatie over de verschillende mechanismen die voortvloeien uit functionalizatie. Corrole remming van RNA-transcriptie zou meer inzicht in hun interacties met biomacromoleculen bieden. Andere complexen bekend te binden aan DNA, zoals dirhodium (II, II) complexen, chroom (III) complexen, ruthenium (II) complexen polypyridyl, rhodium (III) complexen, en diverse anderen, werden onderworpen aan RNA transcriptie assays, 18- 27 resulteert in een beter begrip van hun interacties met biomacromoleculen. Deze gemakkelijke en overal verkrijgbaar experiment is ook een goede eerste test om de cytotoxiciteit eigenschappen van een bepaald molecuul te beoordelen en te bepalen of het zou nader biologische testen. Het RNA transcriptie assay maakt ook vele modificaties, zoals varyinG de hoeveelheid verbinding of enzymen; variëren van de incubatietijd, de reactietijd en het monster tijdstippen; en variëren van de DNA-template lengte en sequentie onder andere van belang zijnde variabelen, zo potentieel die een grote hoeveelheid gegevens. Deze transcriptie test is ook beschikbaar als betaalbare kits met alle benodigde reactie componenten geleverd, hoewel componenten kunnen worden gekocht en individueel bereid. In deze experimenten, gebruiken we een commercieel verkrijgbare kit bekende hoog rendement hebben. 41
Om transcriptie remming te bepalen, gebruiken we twee methoden: agarose gel elektroforese en UV-Vis spectroscopie. Agarose gelelektroforese is een eenvoudige en effectieve methode voor het scheiden, identificeren en zuiveren van 0,5- tot 25-kb DNA en RNA fragmenten. 42 UV-Vis spectroscopie kan worden gebruikt om de concentratie en zuiverheid van het RNA te bepalen. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze test toont aan dat de toevoeging van Ga (tpfc) remt RNA transcriptie vergelijkbaar met de bekende DNA-bindende kanker complexen Actinomycine D en triptolide. De cytotoxische gedrag van Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 uM) mag vanwege zijn remmende eigenschappen. Aangezien geen transcriptie remming werd waargenomen in tpfc de cytotoxiciteit van tpfc niet door RNA transcriptie remming maar door andere middelen nog niet bestudeerd.
In de vier transcriptiereacties uitgevoerd, werd D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onze oprechte dank Dr. Cindy N. Chiu voor hulp met gelelektroforese, en Andy Zhou en Michael Grodick voor hun genereuze donatie van DNA en restrictie-enzym. Wij dankbaar erkennen Professor J. Heath en professor D. Prober voor genereuze toegang tot apparatuur en materialen. Wij danken dr Karn Sorasaenee voor nuttige tips. Wij danken Mary H. Tang voor het maken van de afbeelding in het schematische overzicht in de video. De financiering werd verstrekt door Johnson & Johnson en USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
Referências
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Pesquisa do Câncer. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Pesquisa do Câncer. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
- . . RNA quality control. , (2007).
- Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).
