Ein<em> In-vitro-</em> Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole
Summary
Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften.
Abstract
Chemotherapie oft mit Breitspektrum-zytotoxischen Substanzen mit vielen Nebenwirkungen und begrenzte Targeting. Corrolen sind eine Klasse von Tetrapyrrol-Makrozyklen, die Differenz zytostatische und zytotoxische Eigenschaften in bestimmten Zelllinien, abhängig von der Identität des chelatisierten Metall und funktionelle Gruppen aufweisen. Die einzigartige Verhalten von funktionalisierten Corrole auf bestimmte Zelllinien wird die Möglichkeit der gezielten Chemotherapie.
Viele Krebsmedikamente sind durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Hier stellen wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die RNA-Transkription in Gegenwart von bekannten und potentiellen Inhibitoren. Die Bewertung der RNA-Produkte der Transkriptionsreaktion durch Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie liefert Informationen über hemmende Eigenschaften potentieller Antikrebsarzneimittelkandidaten und mit Modifikationen an der Assay mehr über deren Wirkmechanismus.
Wenigwird über den molekularen Wirkmechanismus von Corrol Zytotoxizität bekannt. In diesem Experiment betrachten wir zwei Corrol Verbindungen: Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und freien Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Ein RNA-Transkriptionsassay wurde verwendet, um die hemmenden Eigenschaften der Corrole untersuchen. Fünf Transkriptionsreaktionen wurden hergestellt: [template DNA-Basen] Verhältnis von 0,01 sind, und einer unbehandelten Kontrolle: mit Actinomycin D, Triptolid, Ga (tpfc) tpfc an einem [komplexen] behandelte DNA.
Die Transkriptionsreaktionen wurden nach 4 h unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie analysiert. Es ist klar, Hemmung durch Ga (tpfc), Actinomycin D und Triptolid.
Das RNA-Transkriptionsassay kann modifiziert werden, um mehr mechanistischen Detail durch Variieren der Konzentrationen des Antikrebs-Komplex, DNA oder Polymeraseenzym bereitstellen, oder durch Inkubieren der DNA-Polymerase oder mit dem complexes vor der RNA-Transkription; Diese Modifikationen würden zwischen einer Hemmung Mechanismus mit der DNA oder das Enzym unterscheiden. Zugabe des Komplexes nach der RNA-Transkription verwendet werden, um zu testen, ob die Komplexe zersetzen oder hydrolysiert das RNA ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um zusätzliche Antikrebskandidaten zu untersuchen.
Introduction
Chemotherapie beinhaltet oft Breitspektrum cytotoxischen Mitteln mit unerwünschten Nebenwirkungen und begrenzten Ausrichtung, aber mit einem besseren Verständnis der Krebsbiologie, gibt es eine ständig steigende Nachfrage nach Antikrebsmitteln mit höheren krebs Targeting Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen. 1 Humankrebszellen werden häufig 2 somit von einem einzigen aktiviert oder überexprimiert Onkogen für das Überleben., viele Krebsmedikamenten durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Behandlungen, die die Expression dieser Gene zu blockieren Transformation sind wirksam bei der Beseitigung von Krebszellen und führen zu Zelltod. 3 Transformierte Zellen sind empfindlicher gegenüber Störungen in der RNA-Transkription als auch entsprechende normale Zellen. 4 Medikamente gegen Krebs, welche die Transkription hemmen sollen selektiv gehemmt Expression der Onkogene, die notwendig für die Krebszelle, um zu überleben. 5 Folglich RNA Transkription inhibition ist eine nützliche Methode, um mögliche Krebsmedikamentenkandidaten zu identifizieren und mehr über ihre Wirkungsweise. Dieses Protokoll zeigt, dass Ga (tpfc) hemmt die RNA-Transkription auf der gleichen Reihenfolge wie die Chemotherapeutika Actinomycin D und Triptolid; ähnliche Vergleiche können mit diesem Protokoll mit anderen Krebsmedikamentenkandidaten durchgeführt werden. Actinomycin D ist ein RNA-Transkriptionsinhibitor häufig verwendet, um Schwangerschafts trophoblastic Krebs, Hodenkrebs, Wilms-Tumor, rhabdomyosacoma behandeln und Ewing-Sarkom 6. Actinomycin D wurde in der Krebstherapie fast fünfzig Jahre lang verwendet worden, da sie erstmals von der FDA zugelassenen 1964.Triptolide ist ein selektiver Inhibitor der Transkription, die in vitro und de verschiedene tumortragenden Tiermodelle für 30 Jahre untersucht worden ist. 7
Die amphiphile Natur der makrozyklischen Corrolen vermittelt wesentliche Vorteile gegenüber anderen Substanzklassen, wie kleine Moleküle oder biologischens. 8-14 makrocyclischen Charakter ermöglicht Zellpermeabilität, die größer ist als für solche großen Moleküle erwarten ist, und dass sie groß genug ist, um mit makromolekularen Oberflächen, wie jene von Proteinen in Wechselwirkung treten können. 8 Corrole bekannt, um enge kovalente Komplexe mit Biomolekülen zu bilden und Arzneimitteln. 10 zusätzlich zu der inhärenten Cytotoxizität des Corrol Rahmen haben wir gezeigt, daß ein sulfoniertes Corrol wirkt als Trägermolekül für chemotherapeutische Mittel, insbesondere die DNA-interkalierende Anthracyclin Doxorubicin. Wenn das sulfonierte Corrol wurde mit Doxorubicin verabreicht wurde eine 3-fache Steigerung in der IC 50 von Doxorubicin für DU-145-Zellen beobachtet. 9 Corrol Rahmen ist stabil und hat inhärente Absorption und Fluoreszenz-Eigenschaften, die, wenn funktionalisierte laufen einzigartige Absorptionsschichten das kann für die Charakterisierung verwendet werden. 10 Funktionalisierung des Gerüsts nicht von Natur aus affect die photophysikalischen Eigenschaften des Corrol, 9-15, aber, wie mit einem sulfonierten Corrol gesehen, selektiven Modifizieren der Rahmen des Corrol seine biologischen Eigenschaften wesentlich zu verändern. 16. Wir haben bereits ausgewertet sechs metallocorroles gegen sieben menschlichen Krebszelllinien. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Toxizität gegenüber menschlichen Krebszellen ist abhängig von der spezifischen Metallionen sowie funktionelle Gruppe Substitution. Zum Beispiel sulfonierte Gallium Corrole erfahren hohe zelluläre Aufnahme und drang selektiv in den Kern der Gehirn metastatischen Prostatakrebszellen (DU-145); die gleiche Corrol, obwohl es nicht in den Kern der anderen Zelllinien durchdringen, weist höhere Zytotoxizität für Brustkrebs (MDA-MB-231), Melanom (SK-MEL-28) und Eierstock- (OVCAR-3) Krebszellen als für Prostatakrebs. 9
Erste Tests auf Zellbasis zeigen, dass diese Verbindungen zeigen Versprechen als Anti-Krebs-Therapeutika, welche furth Verdiensteer Untersuchung des Wirkmechanismus. Transkriptionshemmung mit bestimmten organometallischen Komplexen 17-27 beobachtet, und man versucht, diesen Prozess als ein möglicher Mechanismus für die zytotoxische Verhalten des Corrol Familie untersuchen. Diese Transkriptions-Assay bietet eine einfache, kostengünstige und einfache Methode zur Beurteilung der Inhibierung der Transkription, was mehr detaillierte Informationen über die Wirkung dieser Moleküle in lebende Zellen führt.
Hier wird die Transkription Hemmung von Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und seine freie Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) getestet. Anders als bei einigen Übergangsmetallkomplexe, (III) Gallium ist Redox inaktiv und wird daher nicht direkt in der Redox-Prozess des Redox-basierte Stoffwechselwegen beteiligt sind. 28. Unabhängig, Gallium (III) nicht aufweisen cytotoxischen Eigenschaften und ist für therapeutische Zwecke untersucht. Gallium ist die zweite vielversprechendsten Metall für Krebstherapeutika nach Platin und hat zahlreiche Studien und Untersuchungen unterzogen wurden; Nitrat und Chlorid Galliumsalzen wurden in klinischen Studien gegen Hepatom, Lymphom, Blasenkrebs und anderen Krankheiten untersucht worden. 29-34 Gallium (III) ist daher ideal für Anti-Krebs-Corrol Studien. Erste Daten zeigen, Ga (tpfc) und tpfc haben einen niedrigen GI-50, die Drogenkonzentration notwendig, 50% der maximalen Zellproliferation zu hemmen, mit verschiedenen Krebszelllinien (siehe Abbildung 2); Dies bekräftigt die Gültigkeit der weiteren Experimenten auf diesen beiden Verbindungen, ihre hemmende Eigenschaften zu bestimmen. Vergleicht man diese Verbindungen mit den gemeinsamen Krebsmedikamente Actinomycin D und Triptolid. Actinomycin D Interkalate DNA inhibiert RNA Dehnung und induziert Apoptose in bestimmten Zelllinie bei picomolaren Konzentrationen 6,35-37 Triptolid wurde gezeigt, dass das Tumorwachstum zu hemmen. es um Menschen XPB / ERCC3, eine Untereinheit o bindetf Transkriptionsfaktor TFIIH, was zur Hemmung der RNA-Polymerase II-Aktivität. 6-7,38-40
Während es allgemein bekannt ist, dass Corrole aufweisen cytotoxischen Eigenschaften besteht wenig Informationen über die verschiedenen Mechanismen, die aus Funktionalisierung. Corrol Hemmung der RNA-Transkription würde einen besseren Einblick auf ihre Wechselwirkungen mit Biomakromolekülen bieten. Andere Komplexe bekannt, an DNA zu binden, wie dirhodium (II, II) -Komplexe, Chrom (III) Komplexe, Ruthenium (II) Polypyridylkomplexe, Rhodium (III) -Komplexe und verschiedene andere, wurden die RNA-Transkriptionstests unterworfen, 18- 27 was zu mehr Verständnis für ihre Interaktionen mit Biomakromolekülen. Diese einfache und weithin verfügbar Experiment ist auch ein guter erster Test, um die Zytotoxizität Eigenschaften eines Moleküls zu bewerten und festzustellen, ob es verdient eine weitere biologische Tests. Das RNA-Transkriptionsassay ermöglicht auch viele Modifikationen, wie varying die Menge einer Verbindung oder Enzymen verwendet wird; Variieren der Inkubationszeit, der Reaktionszeit und der Probenzeitpunkten; und Verändern der DNA-Matrize Länge und Sequenz, unter anderen Variablen von Interesse, wodurch potenziell eine große Menge von Daten. Diese Transkriptions Assay ist auch leicht erschwinglich Kits mit allen vorgesehenen notwendigen Reaktionskomponenten zur Verfügung, obwohl Komponenten können gekauft und individuell vorbereitet werden. In diesen Experimenten verwenden wir eines kommerziell erhältlichen Kits bekannt, hohe Ausbeute zu haben. 41
Transkription Hemmung beurteilen, nutzen wir zwei Methoden: Agarose-Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie. Agarose-Gel-Elektrophorese ist ein einfaches und effektives Verfahren zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von 0,5-bis 25-kb-DNA und RNA-Fragmente. 42 UV-Vis-Spektroskopie kann verwendet werden, um die Konzentration und Reinheit der RNA zu bestimmen. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Test zeigt, dass die Zugabe von Ga (tpfc) inhibiert RNA Transkriptions vergleichsweise zu bekannten DNA-bindenden Antikrebs Komplexe Actinomycin D und Triptolid. Die zytotoxische Verhalten von Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 bis 154,7 uM) kann seine hemmenden Eigenschaften zurückzuführen. Da kein Transkriptionshemmung in tpfc beobachtet wird, ist die Zytotoxizität tpfc aufgrund RNA Transkriptionshemmung aber durch andere Mittel noch nicht untersucht verursacht.
In den vier Trans…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Cindy N. Chiu für die Hilfe bei der Gelelektrophorese und Andy Zhou und Michael Grodick für die großzügige Spende von DNA und Restriktionsenzym. Wir danken Professor J. Heath und Professor D. Prober für großzügigen Zugang zu Ausrüstung und Materialien. Wir danken Dr. Karn Sorasaenee für Anregungen. Wir danken Mary H. Tang für die Erstellung der Darstellung in der schematische Übersicht in dem Video verwendet. Die Finanzierung wurde von Johnson & Johnson und USC Y86786 vorgesehen.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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