Un<em> In Vitro</em> Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles
Summary
Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l'inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.
Abstract
La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con molti effetti collaterali e il targeting limitato. Corroles sono una classe di macrocicli tetrapirrolici che presentano differenziali proprietà citostatici e citotossici in linee cellulari specifici, a seconda delle identità del metallo chelato e gruppi funzionali. Il comportamento unico di corroles funzionalizzati verso linee cellulari specifiche introduce la possibilità di chemioterapia mirata.
Molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell'RNA. Presentiamo qui un protocollo passo-passo per RNA trascrizione in presenza di inibitori noti e potenziali. La valutazione dei prodotti RNA della reazione di trascrizione mediante elettroforesi su gel e-Vis UV spettroscopia fornisce informazioni sulle proprietà inibitive di potenziali farmaci candidati antitumorali e, con modifiche al dosaggio, più circa il loro meccanismo d'azione.
Piccolosi conosce il meccanismo molecolare di azione di citotossicità corrole. In questo esperimento, consideriamo due composti corrole: gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analogici freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un saggio di trascrizione dell'RNA è stata utilizzata per esaminare le proprietà anticorrosione dei corroles. Cinque reazioni di trascrizione sono stati preparati: DNA trattato con Actinomicina D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc a [complesso]: [modello base DNA] rapporto 0,01, rispettivamente, e un testimone non trattato.
Le reazioni di trascrizione sono stati analizzati dopo 4 ore mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettroscopia UV-Vis. C'è l'inibizione chiaro Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide.
Questo test RNA trascrizione può essere modificato per fornire dettagli più meccanicistica variando le concentrazioni del complesso antitumorale, DNA, o enzima polimerasi, o incubando il DNA polimerasi o con il complexes prima RNA di trascrizione; queste modifiche sarebbero distinguere tra un meccanismo di inibizione coinvolge il DNA o l'enzima. Aggiunta del complesso dopo la trascrizione dell'RNA può essere utilizzato per verificare se i complessi degradano o idrolizzare l'RNA. Questo test può anche essere usato per studiare ulteriori candidati antitumorali.
Introduction
La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con effetti collaterali indesiderati e il targeting limitata, ma con una maggiore comprensione della biologia del cancro, vi è una sempre crescente domanda di farmaci antitumorali con efficacia il cancro-targeting superiore e minori effetti collaterali. 1 le cellule tumorali umane spesso diventano dipendenti da un singolo oncogene attivato o overexpressed per la sopravvivenza 2 Così., molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell'RNA. Trattamenti che bloccano l'espressione di questi geni che trasformano sono efficaci per eliminare le cellule tumorali e portano alla morte cellulare. 3 Le cellule trasformate sono più sensibili alle interruzioni di RNA di trascrizione di quelle corrispondenti cellule normali. 4 farmaci antitumorali che inibiscono la trascrizione dovrebbero inibire selettivamente la espressione degli oncogeni che sono necessari per la cellula tumorale di sopravvivere. 5 Di conseguenza, i trascrizione dell'RNAnhibition è un modo utile per identificare i potenziali candidati farmaco antitumorale e saperne di più sul loro meccanismo d'azione. Questo protocollo dimostra che Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell'RNA sullo stesso ordine delle droghe di chemioterapia Actinomicina D e triptolide; paragoni simili possono essere effettuate utilizzando questo protocollo con altri farmaci candidati antitumorale. Actinomicina D è un inibitore della trascrizione di RNA comunemente usato per trattare il cancro gestazionale trofoblastica, cancro ai testicoli, tumore di Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing sarcoma di 6. Actinomicina D è stato utilizzato nella terapia del cancro per quasi 50 anni da quando è stata approvata dalla FDA nel 1964.Triptolide è un inibitore selettivo della trascrizione che è stata valutata in vitro e in vari modelli animali di tumore per 30 anni. 7
La natura amfifilico macrociclico di corroles conferisce vantaggi significativi rispetto ad altri classi di farmaci, quali piccole molecole o biologicas. 8-14 Il carattere macrociclico permette permeabilità cellulare che è maggiore del previsto per tali grandi molecole, e sono abbastanza grandi per interagire con superfici macromolecolari, come quelle delle proteine. 8 Corroles sono noti per formare complessi covalenti stretti con biomolecole e droghe. 10 Oltre alla citotossicità intrinseca del quadro corrole, abbiamo dimostrato che un solfonati agisce corrole come una molecola carrier per agenti chemioterapici, in particolare il antracicline doxorubicina farmaco-DNA intercalanti. Quando il corrole solfonata è stato somministrato con doxorubicina, un aumento di 3 volte nella IC 50 di doxorubicina è stata osservata per DU-145 cellule. 9 Il quadro corrole è stabile e ha assorbanza e fluorescenza intrinseche proprietà che, quando funzionalizzato, sottoposti a turni di assorbanza unici che possono essere utilizzati per la caratterizzazione. 10 Funzionalizzazione del ponteggio no intrinsecamente affetto,t le proprietà fotofisiche del corrole, 9-15 ma, come si è visto con un corrole solfonato, modificando selettivamente quadro del corrole può cambiare in modo sostanziale le sue proprietà biologiche. 16 Abbiamo già valutato sei metallocorroles contro sette linee cellulari tumorali umane. I risultati indicano che la tossicità verso cellule tumorali umane dipende lo ione metallico specifica, così come la sostituzione del gruppo funzionale. Ad esempio, corroles gallio solfonati sperimentato elevato assorbimento cellulare e penetrarono selettivamente nel nucleo delle cellule tumorali della prostata metastatico cervello (DU-145); cellule stesso corrole, anche se non penetra nel nucleo di altre linee cellulari, presenta una maggiore citotossicità per il seno (MDA-MB-231), il melanoma (SK-MEL-28), e delle ovaie (OVCAR-3) che per il cancro il cancro alla prostata. 9
Saggi cellulari iniziali indicano che questi composti promettenti come anti-cancro agenti terapeutici, quali meriti Fürthindagini er nel meccanismo di azione. L'inibizione della trascrizione è osservato con alcuni complessi organometallici 17-27 e abbiamo cercato di esaminare questo processo come un possibile meccanismo per il comportamento citotossica della famiglia corrole. Questo test trascrizione fornisce un metodo semplice, poco costoso, e facile per valutare l'inibizione di trascrizione, che porterà a informazioni più dettagliate sugli effetti di queste molecole in cellule vive.
Qui, l'inibizione della trascrizione di gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)), e il suo analogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) sono testati. A differenza di alcuni complessi di metalli di transizione, di gallio (III) è redox inattivo e, pertanto, non è direttamente coinvolto nel processo redox delle vie metaboliche a base redox-. 28 Indipendentemente, gallio (III) non presentano proprietà citotossiche ed è stato indagato per scopi terapeutici. Gallio è il secondo metallo più promettente per terapie antitumorali dopo platino e ha subito molti studi e ricerche; sali nitrati e cloruro di gallio sono stati valutati in studi clinici contro epatocarcinoma, linfoma, tumori della vescica, e di altre malattie. 29-34 gallio (III) è quindi l'ideale per antitumorali studi corrole. I dati iniziali mostrano Ga (tpfc) e tpfc hanno un basso GI 50, la concentrazione necessaria farmaco per inibire il 50% della proliferazione cellulare massima, con varie linee cellulari tumorali (vedi figura 2); questo afferma la validità di ulteriori esperimenti su questi due composti per determinare le loro proprietà anticorrosione. Confrontiamo questi composti con i farmaci antitumorali comuni Actinomicina D e Triptolide. Actinomicina D intercala DNA, inibisce la RNA di allungamento, e induce apoptosi in alcune linee cellulari a concentrazioni picomolari 6,35-37 Triptolide ha dimostrato di inibire la crescita tumorale.; si lega a XPB umana / ERCC3, una subunità ofattore di trascrizione f TFIIH, porta alla inibizione della RNA polimerasi II attività. 6-7,38-40
Mentre è risaputo che corroles presentano proprietà citotossiche, esiste poca informazione sui diversi meccanismi derivanti dalla funzionalizzazione. L'inibizione Corrole di RNA trascrizione offrirebbe una maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Altri complessi noti per legarsi a DNA, come dirhodium (II, II), complessi di cromo (III), rutenio (II) polypyridyl, rodio (III), e vari altri, sono stati sottoposti a test RNA trascrizione, 18- 27 con conseguente maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Questo esperimento facile e ampiamente disponibile è anche un buon test iniziale per valutare le proprietà di citotossicità di una data molecola e determinare se merita ulteriori test biologici. Il dosaggio RNA trascrizione permette anche per molte modifiche, come varying la quantità di composto o enzimi utilizzati; variando il periodo di incubazione, tempo di reazione e momenti di campionamento; e variando la lunghezza del DNA modello e sequenza, tra le altre variabili di interesse, quindi potenzialmente fornendo una grande quantità di dati. Questo test trascrizione è anche facilmente disponibili come kit a prezzi accessibili con tutti i componenti della reazione necessari previsti, anche se i componenti possono essere acquistati e preparati singolarmente. In questi esperimenti, usiamo un kit disponibile in commercio noti per avere alto rendimento. 41
Per valutare l'inibizione della trascrizione, utilizziamo due metodi: elettroforesi gel e spettroscopia UV-Vis. Elettroforesi su gel di agarosio è un metodo semplice ed efficace per la separazione, l'identificazione e purificazione da 0,5 a DNA e RNA frammenti di 25 kb. 42 spettroscopia UV-Vis può essere utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza di RNA. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo test dimostra che l'aggiunta di Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell'RNA paragonabile alle note che legano il DNA complessi antitumorali Actinomicina D e Triptolide. Il comportamento citotossica di Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 micron) possono grazie alle sue proprietà anticorrosione. Poiché nessuna inibizione della trascrizione è stata osservata nel tpfc, la citotossicità di tpfc non è dovuta alla trascrizione dell'RNA inibizione ma è causata da altri mezzi non ancora studiati. </…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott Cindy N. Chiu aiuto per elettroforesi su gel, e Andy Zhou e Michael Grodick per la loro generosa donazione di DNA e di enzima di restrizione. Noi riconosciamo con gratitudine il professor J. Heath e il professor D. Prober per l'accesso generoso attrezzature e materiali. Ringraziamo il Dott Karn Sorasaenee per utili suggerimenti. Ringraziamo Mary H. Tang per creare la figura utilizzata nella panoramica schematica nel video. Il finanziamento è stato fornito da Johnson & Johnson e USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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