<em> 체외</em> 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub> 3</sub> 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles
Summary
갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다.
Abstract
화학 요법은 종종 많은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함한다. Corroles은 금속 킬레이트 관능기의 신원에 따라 특정 세포주에서 세포 증식 및 세포 독성 차동 특성을 나타낼 tetrapyrrolic 거대 고리의 클래스이다. 특정 세포 라인으로 작용 corroles의 고유 한 동작은 대상 화학 요법의 가능성을 소개합니다.
많은 항암제 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 여기에서 우리는 알려진 잠재적 인 억제제의 존재에 RNA 전사를위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 겔 전기 영동 및 UV-비스 분광법 전사 RNA 반응 생성물의 평가는 이들의 작용 메카니즘에 대한 자세한 분석에 대한 수정과, 잠재적 항암제 후보 방청 특성에 대한 정보를 제공한다.
작은corrole 세포 독성의 작용 기작에 대한 알려져있다. 갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) :이 실험에서, 우리는 두 corrole 화합물을 고려하십시오. RNA 전사 분석법 corroles 방청의 특성을 조사하는데 사용되었다. 다섯 전사 반응을 제조 하였다 : 각각 0.01,의 [템플릿 DNA베이스] 비, 및 치료를받지 않은 : [복잡한]에서 티노 마이신 D, triptolide, 조지아 (tpfc), tpfc 치료 DNA.
전사 반응은 아가로 오스 겔 전기 영동 및 비스 – UV 분광법을 사용하여 4 시간 후에 분석 하였다. 조지아 (tpfc), 티노 마이신 D, 및 triptolide에 의한 명확한 억제가 있습니다.
이 RNA 전사 분석법 또는 공단과 DNA 폴리머 라제 또는 잠복기에 의해 항암제 복합체, DNA, 또는 중합 효소의 농도를 변화시킴으로써, 더욱 상세 기작을 제공하도록 변형 될 수있다이전에 RNA 전사에 XES; 이러한 수정 또는 DNA를 포함하는 효소 억제기구를 구별한다. RNA 전사가 단지이 저하 여부를 테스트 또는 RNA를 가수 분해하는 데 사용할 수 있습니다 후 복잡한 추가. 이 분석은 또한 추가적인 항암 후보를 연구하는데 이용 될 수있다.
Introduction
화학 요법은 종종 바람직하지 않은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함, 아직 암 생물학의 더 큰 이해와 높은 암을 대상으로 효능과 부작용이 거의 항암제에 대한 수요는 계속 증가하고있다. 한 인간의 암 세포는 자주가 생존 한 활성화되거나 과발현되는 암 유전자에 의존. 따라서이 많은 항암제는 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 이러한 변형 유전자의 발현을 차단 치료는 암세포를 효과적으로 제거하고 세포 사멸과 리드. 정상 세포에 대응하는 것보다 3 형질 전환 된 세포는 RNA 전사의 중단에 더 민감하다. 선택적으로 억제 할 것으로 예상된다 전사를 억제하는 4 항암제 암 세포가 생존에 필요한 암 유전자의 발현. (5) 따라서, RNA 전사 전nhibition 잠재적 인 항암제 후보를 식별하고 이들의 작용 메커니즘에 대한 자세한 내용을 배울 수있는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 조지아 (tpfc)는 화학 요법 약물 티노 마이신 D 및 triptolide와 같은 순서에 RNA의 전사를 억제하는 것을 보여줍니다; 유사한 비교는 다른 항암제 후보 물질이 프로토콜을 이용하여 제조 될 수있다. 악 티노 마이신 D 일반적 임신성 융모 암, 고환암, Wilm의 종양, rhabdomyosacoma 치료에 사용 RNA 전사 억제제이며, 유잉 육종 6. 이 제 1964.Triptolide에 FDA에 의해 시험 관내에서 30 년 동안 다양 담암 동물 모델에서 연구되어왔다 선택적 전사 억제제 인 승인 된 이후 티노 마이신 D는 50여 년간 암 치료에 이용되고있다. (7)
corroles의 양친 거대 고리 성격은 작은 분자 나 생물학적으로 다른 약 종류에 비해 상당한 장점을 부여S. 8-14 마크로 문자 같은 큰 분자 예상보다 큰 셀룰러 투과성을 허용하고, 이들이 단백질의 것과 같은 거대 분자의 표면과 상호 작용하기에 충분히 크다. 8 Corroles 생체 분자와 엄격한 비공유 복합체를 형성하는 것으로 알려져있다 약물. corrole 워크의 고유 독성 외에도 10, 우리는 보여준 화학 요법 제를위한 담체 분자, 특히 DNA 인터 – 안트라 사이클린 약물 독소루비신 폰화 corrole 작용있다. 폰화 corrole가 독소루비신와 공동 투여되었을 때, 독소루비신의 IC (50)의 3 배 향상은 DU-145 세포에 대해 관찰 하였다.도 9 corrole 구조가 안정하고, 관능 때 고유 흡광도 변화를 겪는다 고유 흡광도 및 형광 특성을 갖는다 그는 특성에 사용할 수 있습니다. 비계의 10 기능화는 본질적으로 affec하지 않습니다선택적으로 실질적으로 생물학적 속성을 변경할 수 있습니다 corrole의 틀을 수정, 술 폰화 corrole으로 볼 때, corrole, 9-15의 광 물리 특성을 t하지만. (16) 우리는 이전에 일곱 사람의 암 세포주에 대한 여섯 metallocorroles을 평가 하였다. 결과는 인간의 암세포 독성을 향해 특정 금속 이온뿐만 아니라 관능기 교체에 의존하는 것을 나타낸다. 예를 들면, 설 폰화 갈륨 corroles 높은 세포 흡수를 경험 뇌 전이성 전립선 암 세포 (DU-145)의 핵으로 선택적으로 침투; 보다 그것이 다른 세포주의 핵 내로 침투하지 않더라도, 동일한 corrole는 유방암에 대한 더 큰 세포 독성을 나타낸다 (MDA-MB-231), 흑색 종 (SK-MEL-28), 난소 (OVCAR-3) 암세포 전립선 암. 9
초기 세포 기반 분석은 이들 화합물은 항암 치료제, 푸르트 장점으로 약속을 보여 나타냅니다작용 기전에 어 조사. 전사 억제는 특정 유기 금속 착물 17 ~ 27 관찰 그리고 우리는 corrole 가족의 세포 독성 행동에 대한 가능한 메커니즘으로이 과정을 검토하고자한다. 이 전사 분석은 살아있는 세포에서 이러한 분자의 효과에 대한 자세한 정보는 이어질 것 전사 억제를 평가하기위한, 간단 저렴하고 손쉬운 방법을 제공한다.
여기에, 갈륨의 전사 억제는 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (그림 1) 테스트됩니다. 일부 전이 금속 착물과 달리, 갈륨 (III) 산화 환원 비활성이므로 직접 산화 환원 계 대사 경로의 산화 환원 과정에 참여하지 않는다. (28)에 관계없이, 갈륨 (III) 세포 독성 특성을 나타내지 않으며, 치료 목적을 위해 연구되어왔다. 갈륨은 백금 후 항암 치료제에 대한 두 번째 가장 유망한 금속 많은 연구와 조사를 겪고있다; 질산과 염화 갈륨 염은 간암, 림프종, 방광암 및 기타 질병에 대한 임상 시험에서 평가되었다. 29 ~ 34 절은 갈륨 (III)이 항암 corrole 연구에 따라서 이상적입니다. 초기 데이터는 (도 2 참조)의 Ga (tpfc) 및 tpfc이 다양한 암 세포주 낮은 GI (50)의 최대 세포 증식을 50 % 억제하는데 필요한 약물 농도를 보여준다; 이것은 그들의 방청 특성을 결정하기 위해 이들 두 화합물에 대한 상기 실험의 유효성을 확증한다. 우리는 일반적인 항암제 티노 마이신 D 및 triptolide 이러한 화합물을 비교합니다. 악 티노 마이신 D하게 인터는 DNA, RNA 신장을 억제하고, 피코 몰 농도에서 특정 세포주에서 세포 자멸사를 유도 6,35-37 Triptolide가 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다.; 그것은 인간의 XPB / ERCC3, 서브 유닛 O를 결합F 전사 인자 TFIIH, RNA 중합 효소 II 활동의 저해로 이어지는. 6-7,38-40
그것은 일반적 corroles 세포 독성 특성을 보일 것으로 알려져 있지만, 작용으로부터 발생하는 다양한 메커니즘에 대한 약간의 정보가 존재한다. RNA 전사의 Corrole 억제는 생체 거대 분자와의 상호 작용에 더 큰 통찰력을 제공합니다. 같은 다이 로듐 등의 DNA에 결합하는 것으로 알려져 다른 단지, (II, II) 단지, 크롬 (III) 단지, 루테늄 (II) 폴리 피리 단지, 로듐 (III) 단지, 기타 다양한 분야, 18-, RNA 전사 분석을 실시 하였다 27 생체 거대 분자와의 상호 작용에 대한 이해의 결과. 이 손쉬운하고 널리 사용되는 실험은 주어진 분자의 세포 독성 특성을 평가하고 있는지 그 장점을 더 생물학적 테스트를 결정하는 좋은 초기 테스트입니다. RNA 전사 분석은 또한 varyin 많은 수정 가능g 사용되는 화합물 또는 효소의 양; 잠복기, 반응 시간 및 샘플 시점을 변화; 따라서 잠재적으로 많은 양의 데이터를 제공하고, 관심있는 다른 변수 중 DNA 템플릿 길이 및 서열을 변화. 구성 요소를 구입하고 개별적으로 제조 될 수 있지만이 전사 분석도 제공 필요한 모든 반응 구성 요소와 저렴한 키트로 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는, 높은 수율을 갖는 것으로 알려져 시판 키트를 사용한다. (41)
아가로 오스 겔 전기 영동 및 UV-마주 분광 : 전사 억제를 평가하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 사용합니다. 아가 로스 겔 전기 영동 분리, 식별하고, 정화 0.5 25 kb의 DNA 및 RNA 단편에 대한 간단하고 효과적인 방법이다. UV-42 비스 분광법 RNA의 농도 및 순도를 결정하기 위해 사용될 수있다. (43)
Protocol
Representative Results
Discussion
상기 분석의 Ga (tpfc)의 첨가는 공지 된 DNA 결합 항암제 복합체 티노 마이신 D와 대등 triptolide RNA의 전사를 억제하는 것을 보여준다. 조지아 (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 μM)의 세포 독성 동작은 방청 특성으로 인해 수 있습니다. 어떠한 전사 억제가 관찰되지 tpfc 이래 tpfc의 세포 독성은 RNA 전사 억제에 의한 것이 아니라 아직 조사되지 않은 다른 수단에 의해 발생된다.
수행 네 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 진심 겔 전기 영동에 대한 도움말 박사 신디 N. 애기를 감사하고, DNA 및 제한 효소의 관대 한 기부 앤디 저우와 마이클 Grodick. 우리는 기꺼이 장비 및 재료에 관대 한 접근을 위해 교수 J. 히스 교수 D. 프로 버를 인정합니다. 우리는 도움이 제안 박사 깐 Sorasaenee 감사합니다. 우리는 비디오의 개략도에 사용 된 그림을 만드는 메리 H. 당나라 감사합니다. 자금은 존슨 앤 존슨 (Johnson & Johnson)과 USC Y86786에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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