Une<em> In Vitro</em> Dosage enzymatique pour mesurer l'inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles
Summary
Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole et son analogue freebase présentent une faible cytotoxicité cellulaire micromolaire. Ce manuscrit décrit une réaction de transcription d'ARN, l'ARN de formation d'image avec un gel coloré au bromure d'éthidium et l'ARN quantifier avec spectroscopie UV-Vis, afin d'évaluer l'inhibition de la transcription par corroles et illustre une méthode simple d'évaluation des propriétés anticancéreuses candidates.
Abstract
La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques avec de nombreux effets secondaires et ciblage limité. Corroles sont une classe de macrocycles tétrapyrroliques qui présentent des propriétés cytostatiques et cytotoxiques différentielles dans des lignées cellulaires spécifiques, en fonction de l'identité du métal chélaté et des groupes fonctionnels. Le comportement unique de corroles fonctionnalisés envers des lignées cellulaires spécifiques introduit la possibilité d'une chimiothérapie ciblée.
De nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d'ARN. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la transcription d'ARN en présence d'inhibiteurs connus et potentiels. L'évaluation des produits d'ARN de la réaction de transcription par électrophorèse sur gel et spectroscopie UV-Vis fournit des informations sur les propriétés inhibitrices de candidats potentiels de médicaments anticancéreux et, avec les adaptations à l'essai, et plus de leur mécanisme d'action.
Peuest connu sur le mécanisme d'action moléculaire de la cytotoxicité corrole. Dans cette expérience, nous considérons deux composés corrole: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et analogique freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un essai de transcription d'ARN a été utilisé pour examiner les propriétés inhibitrices des corroles. Cinq réactions de transcription ont été préparés: ADN traité avec l'actinomycine D, triptolide, Ga (tpfc), à une tpfc [complexe]: [base de matrice d'ADN] rapport de 0,01, respectivement, et un témoin non traité.
Les réactions de transcription ont été analysés après 4 heures en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose et spectroscopie UV-Vis. Il est clair par inhibition Ga (tpfc), actinomycine D et triptolide.
Ce dosage de transcription d'ARN peut être modifié pour fournir des détails plus mécaniste en faisant varier les concentrations du complexe anticancéreux, ADN, polymérase ou une enzyme, ou par incubation de l'ADN polymerase ou à l'achèvementxes avant transcription de l'ARN; ces modifications seraient différence entre un mécanisme d'inhibition impliquant l'ADN ou l'enzyme. L'ajout du complexe ARN après transcription peut être utilisé pour tester si les complexes se dégradent ou se hydrolyser l'ARN. Ce dosage peut également être utilisé pour étudier les candidats anticancéreux supplémentaires.
Introduction
La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques à des effets secondaires indésirables et ciblage limitée, mais avec une plus grande compréhension de la biologie du cancer, il ya une demande croissante pour les agents anticancéreux avec plus d'efficacité sur le cancer-ciblage et moins d'effets secondaires. 1 cellules cancéreuses humaines deviennent souvent 2 Ainsi dépendant d'un seul oncogène activé ou surexprimé à la survie., de nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d'ARN. Les traitements qui bloquent l'expression de ces gènes transformants sont efficaces dans l'élimination des cellules cancéreuses et conduisent à la mort cellulaire. 3 Les cellules transformées sont plus sensibles aux perturbations de la transcription d'ARN que celles des cellules normales correspondantes. 4 Les médicaments anticancéreux qui inhibent la transcription devraient inhiber sélectivement le expression des oncogènes qui sont nécessaires à la cellule de cancer de survivre. 5 Par conséquent, la transcription d'ARN inhibition est un moyen utile pour identifier les candidats potentiels de médicaments anticancéreux et en apprendre davantage sur leur mécanisme d'action. Ce protocole démontre que Ga (tpfc) inhibe la transcription de l'ARN sur le même ordre que les médicaments de chimiothérapie actinomycine D et triptolide; comparaisons semblables peuvent être faites en utilisant ce protocole avec d'autres candidats de médicaments anticancéreux. L'actinomycine D est un inhibiteur de la transcription d'ARN utilisée pour traiter le cancer trophoblastique gestationnel, le cancer des testicules, la tumeur de Wilm, rhabdomyosacoma, et le sarcome d'Ewing 6. Actinomycine D a été utilisé dans le traitement du cancer depuis près de 50 années depuis qu'il a été approuvé par la FDA en 1964.Triptolide est un inhibiteur sélectif de la transcription qui a été étudiée in vitro et dans divers modèles animaux portant la tumeur pour 30 ans. 7
La nature macrocyclique amphiphile de corroles confère des avantages significatifs par rapport aux autres classes de médicaments tels que les petites molécules ou biologiques. 14.8 Le caractère macrocyclique permet de perméabilité cellulaire qui est plus grande que prévu pour ces grosses molécules, et ils sont assez grands pour interagir avec des surfaces macromoléculaires, telles que celles des protéines. 8 corroles sont connus pour former des complexes non covalents serrés avec des biomolécules et les médicaments. 10 En plus de la cytotoxicité inhérente du cadre corrole, nous avons démontré qu'une sulfonés corrole agit en tant que molécule porteuse pour les agents chimiothérapeutiques, en particulier l'anthracycline doxorubicine médicament d'intercalation d'ADN. Lorsque le corrole sulfoné a été administré en association avec la doxorubicine, une amélioration de 3 fois dans le IC 50 de la doxorubicine a été observée pour cellules DU-145. 9 Le cadre corrole est stable et a absorbance et de fluorescence propriétés inhérentes que, lorsque fonctionnalisé, subissent des changements d'absorbance uniques qui peut être utilisé pour la caractérisation. 10 La fonctionnalisation de l'échafaudage ne est pas intrinsèquement affect les propriétés photophysiques du corrole, 9-15, mais, comme on le voit avec une corrole sulfoné, modifier sélectivement le cadre de la corrole peuvent modifier considérablement ses propriétés biologiques. 16 Nous avons déjà évalué six métallocorroles contre sept lignées de cellules cancéreuses humaines. Les résultats indiquent que la toxicité envers les cellules cancéreuses humaines dépend de l'ion métallique spécifique, ainsi que la substitution du groupe fonctionnel. Par exemple, les corroles de gallium sulfonés connu absorption cellulaire élevée et pénètrent sélectivement dans le noyau des cellules du cancer de la prostate métastatique du cerveau (DU-145); les cellules de la même corrole, bien qu'elle ne pénètre pas dans le noyau d'autres lignées cellulaires, présente une plus grande cytotoxicité du cancer du sein (MDA-MB-231), le mélanome (SK-MEL-28), et de l'ovaire (OVCAR-3) cancer que pour cancer de la prostate. 9
Dosages à base de cellules initiales indiquent que ces composés prometteurs en tant qu'agents thérapeutiques anti-cancéreuses, ce qui mérite Furthenquête er dans le mécanisme d'action. inhibition de la transcription est observée avec certains complexes organométalliques 17-27 et nous a demandé d'examiner ce processus comme un mécanisme possible pour le comportement cytotoxique de la famille corrole. Ce dosage de transcription fournit une méthode simple, peu coûteux et facile pour évaluer l'inhibition de la transcription, ce qui conduira à des informations plus détaillées sur les effets de ces molécules dans les cellules vivantes.
Ici, l'inhibition de la transcription de gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et son analogue de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figure 1) sont testés. Contrairement à certains complexes de métaux de transition, le gallium (III) est redox inactive et donc ne est pas directement impliqué dans le processus d'oxydo-réduction de voies métaboliques en fonction redox. 28 Indépendamment, le gallium (III) ne présentent des propriétés cytotoxiques et a été étudié à des fins thérapeutiques. Gallium est le deuxième métal le plus prometteur pour les traitements anticancéreux après platine et a subi de nombreuses études et enquêtes; des sels à base de nitrate et de chlorure de gallium ont été évaluées dans des essais cliniques contre l'hépatome, le lymphome, les cancers de la vessie, et d'autres maladies. 29-34 Gallium (III) est donc idéal pour les études corrole anticancéreux. Les données initiales montrent Ga (tpfc) et tpfc avoir une faible IG 50, la concentration de médicament nécessaire pour inhiber 50% de la prolifération cellulaire maximale, avec diverses lignées de cellules cancéreuses (voir la figure 2); Cela confirme la validité des autres expériences sur ces deux composés pour déterminer leurs propriétés inhibitrices. Nous comparons ces composés avec les médicaments anticancéreux commune actinomycine D et triptolide. L'actinomycine D intercale ADN, ARN inhibe l'allongement, et induit une apoptose dans certaines lignées cellulaires à des concentrations picomolaires 6,35-37 Triptolide a montré à inhiber la croissance tumorale. il se lie à XPB / ERCC3 humain, une sous-unité of facteur de transcription TFIIH, conduisant à l'inhibition de l'ARN polymérase II activité. 6-7,38-40
Se il est bien connu que corroles présentent des propriétés cytotoxiques, il existe peu d'informations sur les différents mécanismes découlant de fonctionnalisation. Inhibition corrole de transcription de l'ARN offrirait une meilleure idée de leurs interactions avec les macromolécules biologiques. D'autres complexes connus pour se lier à l'ADN, tels que dirhodium (II, II), le chrome (III), le ruthénium (II) polypyridyl, le rhodium (III), et divers autres, ont été soumis à des essais de transcription d'ARN, 18- 27 entraîne une plus grande compréhension de leurs interactions avec biomacromolécules. Cette expérience facile et largement disponible est aussi un bon test initial pour évaluer les propriétés de cytotoxicité d'une molécule donnée et de déterminer se il mérite d'autres essais biologiques. Le dosage de transcription d'ARN permet également de nombreuses modifications, telles que varying la quantité de composé ou les enzymes utilisées; faire varier la période d'incubation, le temps de réaction et des instants échantillons; et faire varier la longueur de la matrice d'ADN et de la séquence, entre autres variables d'intérêt, ainsi potentiellement fournir une grande quantité de données. Ce dosage de transcription est également disponibles sous forme de kits abordables avec tous les composants de réaction nécessaires fournis, bien que les composants peuvent être achetés et préparés individuellement. Dans ces expériences, nous utilisons un kit disponible dans le commerce connu pour avoir un rendement élevé 41.
Pour évaluer l'inhibition de la transcription, nous utilisons deux méthodes: électrophorèse sur gel d'agarose et de spectroscopie UV-Vis. Électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode simple et efficace pour la séparation, l'identification, la purification et 0,5 à des fragments d'ADN et d'ARN de 25 kb. 42 spectroscopie UV-Vis peut être utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l'ARN. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet essai démontre que l'ajout de Ga (tpfc) inhibe la transcription de l'ARN comparable aux complexes anticancéreux de liaison à l'ADN connus actinomycine D et triptolide. Le comportement cytotoxique de Ga (tpfc) (IG = 50 58,1 à 154,7 M) peut en raison de ses propriétés inhibitrices. Étant donné qu'aucune transcription inhibition a été observée dans tpfc, la cytotoxicité de tpfc est pas due à la transcription d'ARN d'inhibition mais est causée par d'autres moyens non …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions sincèrement le Dr N. Cindy Chiu de l'aide pour électrophorèse sur gel, et Andy Zhou et Michael Grodick pour leur généreux don de l'ADN et l'enzyme de restriction. Nous tenons à remercier le professeur J. Heath et le Professeur D. Prober pour un accès généreux à l'équipement et des matériaux. Nous remercions le Dr Karn Sorasaenee suggestions utiles. Nous remercions Mary H. Tang pour créer l'illustration utilisée dans l'aperçu schématique dans la vidéo. Le financement a été fourni par Johnson & Johnson et USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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