<em> In Vitro</em> Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H<sub> 3</sub> 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles
Summary
Галлий (III), 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole и его свободное основание аналог обладают низкой микромолей цитотоксичность клеток. Эта рукопись описывает реакцию транскрипции РНК, РНК изображений с бромидом-окрашенных гел этидия, и количественной оценки РНК с помощью УФ-видимой спектроскопии, с тем чтобы оценить ингибирование транскрипции corroles и демонстрирует простой метод оценки свойств противораковое кандидатов.
Abstract
Химиотерапия часто включает в себя широкий спектр средств цитостатики со многими побочными эффектами и ограниченный характер адресности. Corroles представляют собой класс тетрапиррольных макроциклов, которые обладают дифференциальные цитостатические и цитотоксические свойства в определенных клеточных линий, в зависимости от тождеств хелатного металла и функциональных групп. Уникальное поведение функционализированных corroles по отношению к конкретным клеточных линий предусматривает возможность целенаправленного химиотерапии.
Многие противораковые препараты оценивали по их способности ингибировать транскрипцию РНК. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для транскрипции РНК в присутствии известных и потенциальных ингибиторов. Оценка РНК продуктов реакции транскрипции с помощью гель-электрофореза и UV-VIS-спектроскопии дает информацию о ингибирующих свойств потенциальных кандидатов противоопухолевого препарата и, при изменениях в анализе, более об их механизмом действия.
Немногоизвестно о молекулярном механизме действия Коррол цитотоксичности. В этом эксперименте мы рассмотрим два Коррол соединения: галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) и свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Транскрипции РНК-анализ используется для изучения тормозящее свойства corroles. Пять реакции транскрипции готовили: ДНК обрабатывают актиномицином D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc на [сложной]: [шаблона оснований ДНК] соотношении 0,01, соответственно, и с необработанным контролем.
Реакции транскрипции анализировали после 4 ч с помощью электрофореза в агарозном геле и УФ-видимой спектроскопии. Существует ясно ингибирование Ga (tpfc), актиномицин D, и triptolide.
Эта РНК транскрипции анализ может быть изменен, чтобы обеспечить более подробно механистическую путем изменения концентрации противоракового комплекса, ДНК-полимеразы, или фермент, или путем инкубации ДНК-полимеразы или с КомплексыРЭС До транскрипции РНК; эти модификации будут отличать механизма ингибирования с участием ДНК или фермент. Добавление комплекс после транскрипции РНК может быть использована для проверки ухудшить комплексы или гидролиза РНК. Этот анализ также может быть использован для изучения дополнительных кандидатов противоопухолевые.
Introduction
Химиотерапия часто включает в себя широкий спектр средств цитостатики с нежелательными побочными эффектами и ограниченный характер адресности, но с большим пониманием биологии рака, есть постоянно растущий спрос на противораковых агентов с высшим рака таргетирования эффективности и меньшим количеством побочных эффектов. 1 Раковые клетки человека часто становятся зависит от одного или активированного онкогена сверхэкспрессируется за выживание. 2 Таким образом, многие противораковые препараты оценивали по их способности ингибировать транскрипцию РНК. Процедуры, которые блокируют экспрессию этих трансформирующих генов являются эффективными в устранении раковых клеток и привести к гибели клеток. 3 Трансформированные клетки более чувствительны к сбоям в транскрипции РНК, чем являются соответствующие нормальные клетки. 4 Противораковые лекарственные средства, которые ингибируют транскрипцию, как ожидается, что они избирательно ингибируют выражение онкогенов, которые необходимы для раковых клеток, чтобы выжить. 5 Следовательно, транскрипции РНК яnhibition является способом выявления потенциальных кандидатов противоопухолевого препарата и узнать больше об их механизмом действия. Этот протокол показывает, что Ga (tpfc) ингибирует РНК-транскрипцию на том же порядке, что и химиотерапевтических препаратов Актиномицин D и triptolide; Аналогичные сравнения могут быть сделаны с помощью этого протокола с другими кандидатами противоопухолевого препарата. Актиномицин D является РНК транскрипции ингибитора обычно используется для лечения гестационного трофобластическую железы, рак яичка, опухоль Вильмса, rhabdomyosacoma и Юинга саркома 6. Актиномицин D был использован в лечении рака в течение почти пятидесяти лет, поскольку он был впервые одобрен в FDA в 1964.Triptolide является селективным ингибитором транскрипции, который был исследован в лабораторных и в различных животных моделях с опухолями на 30 лет. 7
Амфифильный макроциклический характер corroles придает значительные преимущества по сравнению с другими классами наркотиков таких, как небольшие молекулы или биологическихс. 8-14 макроциклического символов позволяет клеточной проницаемости, который больше, чем ожидалось для таких больших молекул, и они являются достаточно большими, чтобы взаимодействовать с макромолекул поверхностей, таких как белки. 8 Corroles, как известно, образуют жесткие нековалентных комплексов с биомолекул и лекарственных средств. 10 В дополнение к присущей цитотоксичности Коррол рамках, мы показали, что сульфированного Коррол действует как молекулой-носителем для химиотерапевтических агентов, в частности, ДНК-интеркалирующую антрациклина доксорубицина наркотиков. Когда сульфированный Коррол было больных с доксорубицином, 3-кратное повышение в IC 50 доксорубицин наблюдалось DU-145 клеток. 9 Коррол база устойчива и имеет присущие абсорбции и флуоресценции свойства, которые, когда функционализированный, подвергаются уникальные абсорбции сдвиги , которые могут быть использованы для определения характеристик. 10 Функционализация эшафот по своей природе не затрагиваемт фотофизические свойства Коррол, 9-15, но, как видно с сульфонированной Коррол, выборочно модифицировать рамки Коррол может существенно изменить его биологические свойства. 16 Мы ранее оценивали шесть metallocorroles против семи линий раковых клеток человека. Результаты показывают, что токсичность по отношению к раковым клеткам человека зависит от конкретного иона металла, а также замещение функциональных групп. Например, сульфированные галлия corroles наблюдается высокий клеточное поглощение и проникли выборочно в ядре головного мозга раковых клеток метастатического простаты (DU-145); то же самое Коррол, хотя это не проникает в ядра других клеточных линий, показывает большую цитотоксичность для груди (MDA-MB-231), меланома (SK-MEL-28) и яичников (OVCAR-3) раковые клетки, чем на рак предстательной железы. 9
Первоначальные анализы на основе клеток показывают, что эти соединения перспективными в качестве противораковых терапевтических средств, которые существу Furthэ расследование механизмом действия. Ингибирование транскрипции наблюдается при некоторых металлоорганических комплексов 17-27, и мы стремились изучить этот процесс в качестве возможного механизма цитотоксического поведения Коррол семьи. Это транскрипция анализ обеспечивает простой, недорогой и легкое метод оценки транскрипции ингибирование, что приведет к более подробной информации о последствиях этих молекул в живых клетках.
Здесь транскрипция ингибирование галлия (III) 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) и его свободное основание аналог 5,10,15- (трис) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Рисунок 1) тестируются. В отличие от некоторых комплексов переходных металлов, галлия (III), является окислительно-восстановительный неактивным и, следовательно, непосредственно не участвует в процессе окислительно-восстановительного окислительно-восстановительных основе метаболических путей. 28 Несмотря на это, галлия (III) не обладают цитотоксическими свойствами и была исследована в терапевтических целях, Галлия является вторым наиболее перспективным металлом для противораковых терапевтических после платины и претерпела множество исследований и расследований; нитрата и хлорида галлия соли были оценены в клинических испытаниях против гепатомы, лимфомы, рака мочевого пузыря, и других заболеваний. 29-34 галлия (III), поэтому идеально подходит для противораковых Коррол исследований. Исходные данные показывают, Ga (tpfc) и tpfc имеют низкую GI 50, концентрация лекарственного средства, необходимую для ингибирования 50% максимальной пролиферации клеток, с различных линий раковых клеток (рисунок 2); Это подтверждает обоснованность дальнейших экспериментов на этих двух соединений, чтобы определить их тормозящее свойства. Мы сравниваем эти соединения с общей противоопухолевых препаратов Актиномицин D и triptolide. Актиномицин D встраивается ДНК, ингибирует РНК удлинение и индуцирует апоптоз в определенной клеточной линии на пикомолярных концентрации 6,35-37 Triptolide показал ингибировать рост опухоли.; он связывается с человеческим XPB / ERCC3, субъединицы Oфактором транскрипции F TFIIH, что приводит к ингибированию РНК-полимеразы II активности. 6-7,38-40
В то время как это широко известно, что corroles обладают цитотоксическими свойствами, существует мало информации о различных механизмах, связанных с функционализации. Коррол ингибирование транскрипции РНК бы предложить более полное представление об их взаимодействии с биомакромолекул. Другие комплексы, которые известны для связывания с ДНК, такие как dirhodium (II, II) комплексы, хром (III), комплексы рутени (II), polypyridyl комплексы, родий (III), комплексы и различные другие, были подвергнуты транскрипции РНК анализах, 18- 27 в результате более глубокого понимания их взаимодействия с биомакромолекул. Это легкое и широко доступны эксперимент также хорошо первоначального испытания для оценки цитотоксичности свойства данной молекулы и определить, действительно ли он заслуживает дальнейшего биологического тестирования. Анализ транскрипции РНК также позволяет в течение многих модификаций, таких как varyinг количество соединения или ферментов, используемых; Изменяя инкубационный период, время реакции и точек отбора проб времени; и изменения длины ДНК шаблона и последовательность, среди других переменных, представляющих интерес, таким образом, потенциально обеспечивая большое количество данных. Это транскрипция анализ также легко доступны также доступных комплектов со всеми необходимыми компонентами реакции обеспечены, хотя компоненты могут быть куплены и подбирается индивидуально. В этих экспериментах мы используем коммерчески доступного набора, как известно, имеют высокую урожайность. 41
Для оценки ингибирования транскрипции, мы используем два метода: электрофорез в агарозном геле и УФ-Vis спектроскопии. Электрофорез в агарозном геле является простым и эффективным способом для разделения, идентификации и очистки 0,5- до 25-кб ДНК и РНК фрагментов. 42 УФ-видимой спектроскопии может быть использован для определения концентрации и чистоты РНК. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот анализ показывает, что добавление Ga (tpfc) ингибирует транскрипцию РНК сравнительно с известными ДНК-связывающих противоопухолевых комплексов Актиномицин D и triptolide. Цитотоксических поведение Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 мкм) может из-за его ингибирующих свойств. Поскольку ни ингибирован?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы искренне благодарим доктора Синди Н. Чиу за помощь гель-электрофореза, и Энди Чжоу и Майкл Grodick их щедрое пожертвование ДНК и рестриктазы. Мы выражаем глубокую признательность профессору Дж Хит и профессор Д. Prober щедрую доступа к оборудованию и материалам. Мы благодарим доктора Карн Sorasaenee за полезные предложения. Мы благодарим Мэри H. Tang для создания иллюстраций, используемых в схематический обзор в видео. Финансирование было предоставлено Джонсон & Джонсон и USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
Referências
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Pesquisa do Câncer. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Pesquisa do Câncer. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
- . . RNA quality control. , (2007).
- Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).
