アン<em>インビトロ</em>酵素アッセイは、ガリウム（III）とHによる転写阻害を測定する<sub> 3</sub> 5,10,15トリス（ペンタフルオロフェニル）corroles
Summary
ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorroleとその遊離塩基類似体は、低マイクロモル細胞の細胞毒性を示す。この原稿はcorrolesによる転写阻害を評価するために、UV-Vis分光法によるRNA転写反応、臭化エチジウム染色ゲルを有するイメージングRNA、および定量RNAを説明し、抗癌剤候補の特性を評価する簡単な方法を示す。
Abstract
化学療法は、しばしば、多くの副作用、限られた標的で広域スペクトルの細胞傷害性薬剤を含む。 Corrolesは、キレート化金属と官能基のアイデンティティーに応じて、特定の細胞株における差動細胞増殖抑制及び細胞毒性特性を示すテトラピロール大環状化合物のクラスである。特定の細胞株に向かって官能化corrolesのユニークな挙動は、標的化学療法の可能性を紹介します。
多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。ここでは、既知および潜在的な阻害剤の存在下で、RNA転写のためのステップバイステップのプロトコルを提示する。ゲル電気泳動およびUV-Vis分光法による転写反応のRNA産物の評価は、それらの作用機序についての複数のアッセイの改変を用いて、潜在的な抗癌剤候補の防錆特性に関する情報を提供し、。
リトルコロール細胞毒性の作用の分子メカニズムについて知られている。ガリウム（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））と遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）：この実験では、我々は2つのコロールの化合物を考える。 RNA転写アッセイcorrolesの防錆特性を調べた。五転写反応を調製した：アクチノマイシンD、トリプトリドで処理したDNA、ジョージア（tpfc）、[錯体]でtpfcを[テンプレートDNAベース]は、それぞれ0.01の比率、および未処理の対照。
転写反応は、アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光法を使用して4時間後に分析した。 GA（tpfc）、アクチノマイシンD、およびトライドによる明確な阻害があります。
このRNA転写アッセイは、抗癌複合体、DNA、またはポリメラーゼ酵素の濃度を変えることによって、または攻殻有するDNAまたはポリメラーゼをインキュベートすることにより、より機械的な詳細を提供するために修飾することができる前のRNA転写にXES。これらの変更は、DNAや酵素が関与する阻害機構との間を区別します。 RNAの転写複合体が劣化しているかどうかをテストまたはRNAを加水分解するために使用することができた後、複合体を加える。このアッセイはまた、付加的な抗癌剤候補を研究するために使用することができる。
Introduction
化学療法は、しばしば、望ましくない副作用、限られた標的を有する広いスペクトルの細胞毒性剤を含む、まだ癌生物学の理解と、より高い癌ターゲティングの有効性および副作用の少ない抗癌剤のためのこれまでの需要が高まっている。1ヒトの癌細胞が頻繁になって生存のための単一の活性化または過剰発現され、癌遺伝子に依存しているので2、多くの抗癌剤は、RNAの転写を阻害するそれらの能力により評価される。癌細胞を排除するのに有効であり、細胞死につながるこれらの形質転換遺伝子の発現を阻止する治療法。3形質転換された細胞は、正常細胞に対応しているよりも、RNA転写の混乱に対してより敏感である。転写を阻害する4抗がん薬を選択的に阻害することが期待されている癌細胞が生存するために必要な癌遺伝子の発現。5したがって、RNA転写のinhibitionは、潜在的な抗がん薬候補を同定し、その作用機序についての詳細を学ぶために便利な方法です。このプロトコルは、GA（tpfc）は化学療法薬アクチノマイシンDとトライドと同じ程度のRNA転写を阻害することを実証している。同様の比較は、他の抗癌薬物候補をこのプロトコルを使用して作製することができる。アクチノマイシンDは、一般的に妊娠性絨毛癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、rhabdomyosacomaを治療するために使用されるRNA転写阻害剤であり、ユーイング肉腫6。アクチノマイシンDは、それが最初に1964.TriptolideにFDAによって承認されてからほぼ50年間の癌治療に使用されてきた30年間、インビトロおよび種々の腫瘍を有する動物モデルで研究されている選択的な転写阻害剤である。7
corrolesの両親媒性大環状性質は、そのような小分子または生物のような他の薬剤クラスに対して重要な利点を与えるsの8-14大環状文字は、このような大きな分子に期待されるよりも大きい細胞透過性を可能にし、それらは、タンパク質のもののような巨大分子表面と相互作用するのに十分な大きさである。8 Corroles生体分子との緊密な非共有結合複合体を形成することが知られているおよび薬物。コロールフレームワーク固有の細胞毒性に加えて、10は、スルホン化コロール、化学療法剤のための担体分子、特にDNAインターカレーアントラサイクリンドキソルビシンとして作用することを実証した。スルホン化コロールドキソルビシンと同時投与したとき、ドキソルビシンのIC 50の3倍の増強は、DU-145細胞で観察された。9コロールフレームワークは、安定であり、官能化され、固有の吸光度および蛍光特性を有し、固有の吸光度のシフトを受けるその特徴付けのために使用することができる。足場の10官能化は、本質的にaffecないコロールの光物理的特性トン、9-15しかし、スルホン化コロールで見られるように、選択的にコロールの枠組みの修正は、実質的にその生物学的特性を変更することができます。16我々は以前7ヒト癌細胞株に対して6 metallocorrolesを評価した。結果は、ヒト癌細胞に対する毒性が特定の金属イオン、ならびに官能基の置換に依存していることを示している。例えば、スルホン化ガリウムcorrolesが高い細胞取り込みを経験し、脳の転移性前立腺癌細胞（DU-145）の核に選択的に浸透し、それは他の細胞株の核内に侵入しないものの同じコロール、乳癌（MDA-MB-231）、黒色腫（SK-MEL-28）、および卵巣（OVCAR-3）のためのより大きな細胞毒性を示すよりも、癌細胞前立腺癌9
初期の細胞ベースのアッセイは、これらの化合物は、抗癌治療薬、フュルトメリットとして有望であることを示している作用機序にER調査。転写阻害は、特定の有機金属錯体17-27で観察し、我々はコロール家族の細胞傷害行動のための可能なメカニズムとして、このプロセスを検討することが求められている。この転写アッセイは、生細胞におけるこれらの分子の影響についての詳細な情報につながる転写阻害を、評価するための、簡単で安価な、そして容易な方法を提供する。
ここでは、ガリウムの転写阻害（III）5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（GA（tpfc））とその遊離塩基アナログ5,10,15-（トリス）pentafluorophenylcorrole（tpfc）（ 図1）がテストされます。いくつかの遷移金属錯体とは異なり、ガリウム（III）、酸化還元に不活性であり、したがって、直接酸化還元系の代謝経路のレドックスプロセスに関与しない。28かかわらず、ガリウム（III）の細胞傷害性特性を示さず、治療目的のために検討されている。ガリウムは、プラチナの後に抗癌治療のための第二の最も有望な金属であり、多くの研究や調査を受けている。硝酸塩及び塩化ガリウム塩が肝癌、リンパ腫、膀胱癌、および他の疾患に対する臨床試験で評価されている。29-34ガリウム（III）、したがって抗がんコロール研究のための理想的です。初期データとして、Ga（tpfc）とtpfcは、様々な癌細胞株（ 図2参照）と、低GI 50、最大細胞増殖の50％を阻害するのに必要な薬物濃度を有し示す。これは、それらの抑制性の特性を決定するためにこれら2つの化合物に関するさらなる実験の正当性を肯定。私たちは、一般的な抗がん剤アクチノマイシンDとトライドとのこれらの化合物を比較する。アクチノマイシンDインターカレーDNAは、RNA伸長を阻害し、ピコモル濃度で、特定の細胞株においてアポトーシスを誘導する6,35-37トリプトライドは、腫瘍増殖を阻害することが示されている。人間XPB / ERCC3、サブoを特異的に結合するfの転写因子TFIIH、RNAポリメラーゼII活性の阻害につながる。6-7,38-40
それは一般的にcorrolesが細胞毒性を示すことが知られているが、機能化から生じる異なる機序についてはほとんど情報が存在する。 RNA転写のコロール阻害が生体高分子との相互作用に大きな洞察を提供するであろう。そのような二ロジウム（II、II）としてDNAに結合することが知られている他の複合体、複合体、クロム（III）錯体、ルテニウム（II）ポリピリジル錯体、ロジウム（III）錯体、および様々な他のものは、RNA転写アッセイに供した18-生体高分子との相互作用の理解になり27。この容易で広く利用可能な実験はまた、所定の分子の細胞毒性特性を評価し、それのメリット、さらに生物学的試験かどうかを判断するには良い初期テストです。 RNAの転写アッセイはまた、varyinなどの多くの修正、を可能にするG化合物または使用される酵素の量は、インキュベーション時間は、反応時間とサンプル時点を変える。したがって、潜在的に大量のデータを提供し、興味のある他の変数の中で、DNA鋳型の長さおよび配列を変化させる。コンポーネントが購入し、個別に調製することができるが、この転写アッセイもまた提供されるすべての必要な反応成分と手頃なキットとして容易に入手可能である。これらの実験では、高い収率を有することが知られている市販のキットを使用して図41
アガロースゲル電気泳動およびUV-Vis分光：転写阻害を評価するために、我々は2つの方法を使用しています。アガロースゲル電気泳動は、25 kbのDNA及びRNA断片に分離同定、および精製0.5-ための簡単で有効な方法である。42 UV-Vis分光法は、RNAの濃度および純度を決定するために用いることができる。43
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイは、ジョージア（tpfc）の添加が知られているDNA結合抗癌剤複合体アクチノマイシンDおよびトリプトライドと同等にRNAの転写を阻害することを実証している。 GA（tpfc）（GI 50 = 58.1から154.7μM）の細胞傷害性挙動は、その抑制的特性によることがあります。ない転写抑制がtpfc観察されなかったので、tpfcの細胞毒性は、RNA転写阻害によるものではないが、まだ研究されてい?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは心からゲル電気泳動のヘルプは博士シンディN.チウに感謝し、DNA及び制限酵素の彼らの寛大な寄付のためのアンディ周とマイケルGrodick。私たちは感謝の機器や材料への寛大なアクセスするための教授J·ヒースと教授D.プローバを認める。私たちは、役立つ提案博士カーンSorasaeneeに感謝。私たちは、ビデオ内の概略図で使用されるイラストを作成するためのメアリーH.唐に感謝。資金は、ジョンソン·エンド·ジョンソンとUSC Y86786によって提供されました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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