Introduction
この方法の目的は、単一のナノ粒子内の要素の三次元分布を正確に決意を提供することです。これは、走査型透過電子顕微鏡（STEM）で行われる断層撮影の再構築と関連したエネルギー分散型X線（EDX）分光法を使用することによって行われます。
エネルギー分散型X線分光法は、長い定量化と空間的に透過型電子顕微鏡の試料中に存在する元素をマッピングするための手法として用いられてきました。結晶性物質1の三次元イメージングのための高角度環状 暗視野（HAADF）STEM断層撮影法の出現により、エネルギー分散型X線断層撮影法は、三次元2中の元素の分布の決意を可能にする方法として提案されました。しかし、初期の研究は、伝送電子顕微鏡内のX線検出器の設計に限定されていました。具体的にこれらの伝統的なデtectorデザインは比較的低い収集効率を有しており、サンプルホルダー2,3からシャドーイングによる傾斜角の大きな範囲では信号を測定していません。 （走査）透過型電子顕微鏡内のX線検出器の新しい幾何学的デザインの導入は、エネルギー分散型X線断層撮影を実行可能な技術をした最近の研究4~6の数をもたらしました。
HAADF STEMのイメージングは、広く使用されている電子断層撮影モードで、HAADF信号強度の原子番号の感度に基づいて、特定の状況における組成情報を提供することができます。例えば、HAADF断層撮影法は、離散要素の領域、 例えば有するナノ粒子の研究に適している、明確に定義されたコア-シェル形態7が、要素は、より複雑な分布を持っている場合は使用できません。電子エネルギー損失分光法（EELS）三次元elemeを決定するための補完的なアプローチを提供しますSTEM 8内NTAL分布。この手法では、入射電子ビームのエネルギー損失は、試料の組成を決定するために使用され、これは、多くの場合、EDX分光法9によって得られるよりも高い信号対雑音比の利点を有します。 EELSの欠点は、多重散乱の考慮事項は、試験片の厚さに厳しい制限を課すことで、いくつかの状況での分析は、遅発性のエッジまたは重複するスペクトルの特徴の存在によって複雑になります。このように、EDX分光法は、多くの場合、より良いような、多くの場合、触媒やプラズモニックナノ粒子系9に関連するような重元素を研究するのに適しています。フルスペクトル画像は分光EDXに収集されるように加え、原因で重複または外側である要素情報の周波数にエネルギーを濾過透過型電子顕微鏡法（EFTEM）とEELSでより困難である、遡及的に予期しない要素を識別することは簡単ですデータセットのスペクトル範囲。
EDX断層撮影のための理想的なサンプル形状は、針状試料を真空中に懸濁し、断層の傾斜軸4に沿って配向で構成されています。この状況は、EDX検出器のないシャドウイングが試料または試料ホルダのいずれかによって、任意の傾斜角では存在しないことを保証します。しかし、ナノ粒子系のために必要な針状試料の組み立てが困難な10と試料調製は、通常、単に炭素薄膜のTEM支持グリッド上にナノ粒子を転送で構成されています。これらのグリッドは、特にそれが大きな角度（≈±75°）に傾斜させることができるように設計されたが、試料傾斜角度のこの範囲内でEDX検出器のシャドウイングが不可避であり、得られる断層像の画質を劣化させる可能性断層試料ホルダで使用され再建。このシャドウイングは、特定の顕微鏡検出器ホルダーのセットアップの特徴であるため、抑止することができます買収11前に適切なキャリブレーションサンプルの測定によって採掘されました。シングル球状ナノ粒子は、これらの試料からのX線カウントの強度として理想的なキャリブレーション試料はすべての傾斜角度にわたって一定のままであるべきです。検出器のシャドーイングは、その後のいずれかは、それぞれの角度で、またはデータ取得後の補正係数との乗算によって取得時間を変化させることによって補償することができます。信号対雑音比を最大化しながら、これは電子線量を最小化するように前者の方法が用いられます。
Protocol
1.ナノ粒子の合成
- RTでのエチレングリコール75mlのポリビニルピロリドン（PVP）（MW = 10,000グラム/モル）10gを溶解させます。この溶液に硝酸銀 400mgのを追加します。
- AgNO 3まで攪拌溶液を完全に1℃分の一定速度で溶解し、続いて100℃でホットプレート上で加熱され-1。反応物を1.5時間、100℃で進行しよう。
- 蒸留水175ミリリットルを加え、室温まで冷却します。 8000×gで遠心分離し、蒸留水50ミリリットルで上清と再分散ナノ粒子を除去します。 3回繰り返します。
- RTでエチレングリコール500mlにPVPの500mgの（55,000グラム/モル）を溶解させます。千ミリリットル丸底フラスコに、前工程からのこのソリューションとAgナノ粒子懸濁液の27.8ミリリットルを追加します。 10分間100℃でフラスコを加熱します。
- （水性） -のAuCl 4の0.2mMの溶液を形成するために水1000mlに水素テトラクロロ金酸三水和物を追加（、（水溶液）（％で金7％でのAg 93）平均組成Ag93Au7のAgAuナノ粒子を得るために、前工程で得られた溶液に滴下Ag82Au18を- 0.2 mMののAuCl 4のアリコートを100、200、300または400ミリリットルを追加します。それぞれ％のAu 18at％）、Ag78Au22（％％でのAu 22）とAg66Au34でのAg 78（％での％での銀66金18）でのAg 82。
- 、8000×gの遠心分離の連続ラウンドによって蒸留水で蒸留水50ミリリットルで上清および再分散の除去を3回洗浄後、室温まで冷却し。 DI水の10ミリリットルにナノ粒子溶液の0.05ミリリットルを追加します。
2. TEMサンプル調製
- ピペットで約0.05ミリリットル連続/ホーリー炭素TEMグリッド上へナノ粒子溶液の。サンプルのEDXスペクトル中のCuやAuとの利害の重なりピークが存在しない場合にCuやAuグリッドが十分であろうが、スプリアスX線を制限するために、ベリリウムのTEMグリッドに使用される金属支持体を使用してください。大きい私を使用してくださいSHのサイズ（ 例えば、200メッシュ）をグリッドからシャドウイングの可能性を最小限にします。
- ナノ粒子溶液が乾燥した後、純メタノールまたはエタノール中のグリッドを洗浄することにより、TEMグリッドを清掃。それは抗キャピラリークロスピンセットを使用して保持されている間、ピペット10月20日には、TEMグリッド上にドロップします。グリッドのエッジ上にそっと触れたろ紙を用いてグリッドから各ドロップした後に余分な液体を除去します。
- 残りの汚染を除去または固定化することにより、電子ビームの下で汚染を低減するために約80℃（好ましくは真空中）でアニールグリッド。
検出器シャドウイングの3キャラクタリゼーション
- 次に、負荷断層ホルダーへのTEM支持グリッド上のナノ粒子とTEMにホルダーを挿入します。
- （約1.8×10 -7トル未満）に適した安定した値に到達するために、顕微鏡の真空のを待ちます。オープンカラムバルブ、および電子ビーム顕微鏡、蛍光皮下で見ることができることを確認REEN。
- STEMを合わせます。
注：ここでは、タイタンのG2プローブ側の収差のためのアラインメントは、記載されている2020トモグラフィホルダーと一緒に200kVで操作しSTEM楽器を修正しました。他の顕微鏡のための最適なアライメント手順は記載されているものと多少異なる場合があります。- STEM回折モードでは、ユーセントリックの高さにサンプルをもたらすために、アウトフォーカス影の画像を使用しています。これを行うには、[検索]タブでアルファワブラーボタンを押して、±15°の間のステージを傾けると、Z高さを調整することにより、試料中の特徴の任意の動きを最小限に抑えます。
- ビームは、試料中の穴の上になるようにサンプルを移動し、下の開口部の影を中心にして、適切なコンデンサーの絞りが正しく整列されていることを確認するには、プローブの画像を集中しました。強度をウォブル集束プローブは、ビーム傾斜不整合をチェックするために移動しないようにします。
- アモルファスカーボンの面積が表示されているように、サンプルを移動して、焦点を合わせることロンチグラムを得るために、回折モードでいます。ウォブル焦点は、ロンチグラム内の異常を観察し、これらの（ 例えば、非点収差、軸上コマ）必要に応じてを補正します。
- [検索]タブの[表示はトラック」を選択し、撮影しながらグリッドの正方形の輪郭を追跡することによって、グリッドの正方形（グリッドの中心に近いもの）のアウトラインをトレースします。これは、単純な後続の測定が支持グリッドからのシャドウイングの可能性を低減するために、グリッドの正方形の中央にあるナノ粒子のために実行されることを保証することができます。買収が近いグリッドバーへの粒子上で実行されている場合は、検出器の1組は、試料の傾斜角度のはるかに広い範囲にわたってシャドウイングされます。
- グリッドの正方形の中央部内の代表粒を検索します。ホルダーの最大傾斜範囲に傾けナノ粒子はGRIによって隠されていないことを確実にするために撮影しながら（通常は70度を±）大型ホルダー傾くでDバー。
- 5-10°の間の角度増分を使用して（通常は70度を±）傾斜角度の全範囲にわたって一定の取得時間（ 例えば 、5分）を使用して、HAADFとEDXスペクトル画像を取得します。まず、イメージング・ペインで取得クリックして概要HAADF像を取得します。この画像を押し獲得の上にボックスをドラッグすることにより、ナノ粒子の周りにマッピングウィンドウを選択します。
- （RAWファイルとして）、画像処理ソフトウェアでスペクトルdatacubesを開くことにより、データ収集のための時間間隔を決定するために、EDXスペクトル画像からの特性X線の数を抽出します。そして、slice2Dと和関数を使用して、目的のピークのエネルギーのチャネルに対応するデータキューブのスライスの強度を合計、スクリプトは補足コード1-3として含まれています。
4. EDXトモグラフィー取得
- 繰り返しは、関心のナノ粒子試料のための3.1から3.5を繰り返します。
- HAADF aを取得ステップ3.6と同様に試料傾斜角度の範囲については、前のセクション（通常は70°、±）、の特性をシャドウ検出器から決定された時間間隔でND EDXスペクトル画像。
5.復興と可視化
- 次のいずれかの方法でMRCファイルフォーマットにHAADF像のチルトシリーズをコンパイルします。
- 「イメージシーケンス」としてHAADFののTIFをインポートした後、画像の可視化ソフトウェア12（[ファイル]> [名前を付けて保存> MRC・ライター）にMRCライターを使用してください。
- また、断層ソフトウェアパッケージ13にtif_to_mrc関数を使用します。
- チルトシリーズの大まかな位置合わせを得るために選択されたソフトウェアでHAADFイメージをクロス相関します。 .sftファイルのいずれかとして、またはファイルxcorr.txtとしてアライメントデータを保存します。トモグラフィーソフトウェアで相互相関ペインで最も鋭いピークを提供し、セットアップFilterウィンドウでフィルタを設定します。 <オール>
- 続いて、Enterキーを押して、計算アライメントに進み、全チルトシリーズの相互相関を実行するためにウィンドウを移動します。地元のシフトが1ピクセル未満になるまでテキストとして各工程において全てのシフトのファイルを保存するために確保し、位置合わせを繰り返します。
注：相互相関を実行する際に使用するフィルタを注意深く設定チルト系列データの良好な位置合わせを確実にするために時々必要です。
- オブジェクトプールし、右クリックで復元オブジェクトを選択し、orthosliceを抽出するためにorthosliceモジュールを選択します。ボリュームレンダリングを抽出するために、再構成を選択し、ボリュームレンダリングを右クリックします。復興と選択等値面を右クリックして等値面を抽出します。
注：しきい値による自動分割は、より堅牢な方法であるが、信号対雑音比が悪いマニュアルセグメンテーションは、等値面の可視化のためのナノ粒子容積の外側から騒々しいボクセルを削除する必要があるかもしれないです。
Representative Results
タイタンG2 ChemiSTEMで2020トモグラフィホルダーのためのシャドウイングの検出器の特性は、 図1Aに表示されます。ここで用いられる検出器は、4つの検出器が0.6 SR 14よりも大きいの検出立体角が得られ、光軸の周りに90度の同じ方位角で使用されているスーパー-X検出器のことです。検出器の特性は、 図1Bに表示された補償断層取得時間の決意を可能にしました。各傾斜角度におけるこれらの取得時間カウントを適用した後、図1（c）に示すように 、単一のナノ粒子のためにほぼ一定のままであるべきです。
ガルバニック置換反応によって合成されたバイメタルAgAuナノ粒子は、STEMでEDX断層撮影法を用いて調べました。この反応では、のAuCl 4の溶液を-です銀ナノ粒子の種子に加えました。 Auを初期シードのバイメタル組成及び空洞を生じ、酸化されたAgのようなナノ粒子の表面上に低減されます。以前は、それは、AgおよびAuをこのプロセスを通して、触媒および光学的特性の変化が原因で空洞化し、バルク組成の変化に単にあったことを均質な合金を形成していることが考えられました。しかし、三次元元素マッピングは、ガルバニック反応（ 図2）によって合成さAgAuナノ粒子内のEDX断層撮影明らかに表面偏析を用いて行きました。低金の組成物では、ナノ粒子は、明確なAu表面偏析を表示します。しかし、金の含有量が増加するにつれて、この表面偏析は透明銀表面偏析（ 図3）があるので、最高金コンテンツの切り替わり。表面偏析のこの切り替えは異なることにより合成三成分カップリング反応におけるプロパルギルアミンの収率の変化と相関しますこれらAgAuナノ粒子の耳鼻咽喉科組成物。
電子ビームの方向に対して垂直である復興を通じてスライスは、標準的な2次元元素マップとの比較を提供します。初期マップは、ビームの方向に沿って合計された組成に情報が含まれ、これは多くの場合、上部と底部を含めることに、ここで調べナノ粒子によるAgAuの場合には、異なる組成の領域をオーバーラップするかに解釈するのが難しいことができます投影中の面（ 図3A-C）。復興を通じてスライスを取ることは、粒子の上下面に関連付けられているため、この場合の表面偏析のより明確に表示（ 図3D-F）になる強度を除去することができます。
図2。 低Auの含有AgAuナノ粒子。（A）Orthosliceの再建 。 Agの再建を通じて（B）Orthoslice。このナノ粒子の明確なAu表面偏析を表示orthoslices（A）及び（B）を介して撮影した（C）ラインプロファイル。 AgおよびAuの再構成の（D）表面の可視化。スレーターら 15から。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
高い金コンテンツAgAuナノ粒子の 図3. 復興。金の（A）2D EDXマップとAgの（B）2D EDXマップ。 （C）ラインプロフィールEは、2D EDXマップ（A）を介して採取し、（B）は、単独で、2Dマップから、このナノ粒子における表面偏析を決定するのに困難を示します。金の再構築を通じて（D）Orthoslice。 Agの再建を通じて（E）Orthoslice。このナノ粒子の明確な銀表面偏析を表示orthoslices（D）及び（E）を介して撮影した（F）ラインプロファイル。 AgおよびAuの再構成の（G）表面の可視化。スレーターら 15から。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここに提示プロトコルは、三次元の任意の多元素のナノ粒子の元素分布を決定するための方法を提供します。ここに提示AgAuナノ粒子の場合には、両素子の表面偏析を明確に識別され、三成分カップリング反応における触媒収率に相関することが示されています。これは明らかに、ナノ粒子システムの物理的および化学的特性を説明するうえで、この技術の有用性を実証します。
常にTEMの場合のように、ケアは、可能な限り最高の結果を保証するために、試料調製に取られるべきです。徹底的な洗浄及びナノ粒子溶液を堆積した後のグリッドのアニーリングは、EDX断層撮影に必要な大規模な電子線量を介して炭素汚染の蓄積を避けるために特に重要です。採用大量投与はまた、特に、多くの場合、穴の間に見られる薄切片上であれば、ホーリーカーボン膜に重大な損傷をもたらす可能性がSが、窒化シリコン支持フィルムは、ナノ粒子16の酸化を支持することができます。
検出器のシャドーイング効果の補正技術は、将来の元素分布の定量的マッピングに適用される場合は特に、正確な再構成を生成することが重要です。これは、検出器シャドーイングし、その後ナノ粒子に電子線量の変化の正確な特徴付けを介して達成することができます。代替的に、シャドウイングは、取得した後、補正係数によりスペクトル画像を乗算することによって補償することができます。しかし、三次元での定量的情報を提供するためにこの技術を適用することは、各スペクトル画像における達成可能なX線数を制限するナノ粒子の電子線損傷をまだ不可能です。
較正は、特定の顕微鏡検出器ホルダの組み合わせの傾斜角の関数としてのシャドーイングEDX検出器を補償するために必要とされます。 SHadowingは、最初にその組成が傾斜を取得するために要する時間にわたって電子ビームの下で安定している場合、この基準を満たすことが期待される異なる試料傾斜角度と、個々の球状のナノ粒子のX線数には変化を与えないサンプルを用いて決定されるべきですシリーズ。また、結晶性ナノ粒子のために、電子ビームは、ナノ粒子の主要なゾーン軸に沿って配向された任意の傾斜角が除去されるべきであり、ナノ粒子は、かなりのX線吸収を回避するのに十分に小さくなければなりません。単一のナノ粒子のEDXスペクトル画像は一定の取得時間を使用して、可能な試料傾斜角度の全範囲にわたって取得されたときしたがって、測定された特性X線強度の任意の変化は、単独で、シャドウイングの検出器に起因するであろう。獲得時間、従って用量は、その後全信号数がコン約あることを意味シャドウイングを補償するために、後続の取得に変化させますチルトシリーズで取得したすべてのスペクトル画像に対して定。
HAADFまたはEELSの撮像モードと比較して、EDX断層データの取得は、その非常にまだ初期段階にあります。高い立体角を有するX線検出器の導入、多くの場合、二次元EDX画像の場合と同様にEDX断層撮影法の主な制限にもかかわらず、低信号です。これにもかかわらず、EDX分光法は、いくつかのナノ粒子系のためのEELSを渡って保持することができる一つの利点は、かなり大きなナノ粒子中の重元素を少量の決意です。彼らはより多くのカウントを提供し、少数の問題は、スペクトル重複をデコンボリューションであるとして、より大きな多成分ナノ粒子（> 100 nm）は、多くの場合、EDXの研究に適していますが、注意がほとんど吸収を起こす高エネルギーX線のピークを使用するように注意する必要があります。
全体として、EDX断層三次元のナノ粒子内の元素の分布を決定する優れた方法であり、althoぐふ重大な損傷を与えることなく、比較的高い電子線量に耐えることができ、ナノ粒子に限定されるもの。 STEM内のX線検出器の立体角及び断層試料ホルダーのさらなる最適化のさらなる増加は、この技術がさらに進め、個々のナノ粒子のキャラクタリゼーションにおける重要な方法になることができます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
TJASとSJHは資金援助のために英国の工学物理科学研究会議（グラント番号EP / G035954 / 1およびEP / L01548X / 1）をお願いいたします。著者らは、原子力先進製造プロセス研究センターの研究能力に関連付けられているタイタンG2 80-200 S / TEMのための資金を提供するためのHM政府（英国）からの支援を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Titan G2 80-200 STEM | FEI | With Super-X detector | |
| 2020 tomography holder | Fischione | ||
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | |
| EDX Acquisition software | Bruker | Esprit | |
| Tomographic alignment and reconstruction software | FEI | Inspect3D, alternatives available | |
| Tomographic alignment and reconstruction software package | University of Colorado | IMOD, alternatives available | |
| Visualisation software | FEI | Avizo, alternatives available | |
| Image processing software | Gatan | Digital Micrograph, alternatives available | |
| Image visualisation software | Open Source | Fiji, alternatives available | |
| Polyvinyl-pyrrolidone | Sigma-Aldrich | 856568 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | V900208 | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 209139 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75007200 | |
| Round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z41,452-2 | 1,000 ml |
| Hydrogen tetrachloroaurate trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 |
References
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96, 413-431 (2003).
- Mobus, G., Doole, R. C., Inkson, B. J.
- Kotula, P., Brewer, L., Michael, J., Giannuzzi, L. Computed Tomographic Spectral Imaging: 3D STEM-EDS Spectral Imaging. Microsc. Microanal. 13, 1324-1325 (2007).
- Lepinay, K., Lorut, F., Pantel, R., Epicier, T. Chemical 3D tomography of 28 nm high K metal gate transistor: STEM XEDS experimental method and results. Micron. 47, 43-49 (2013).
- Genc, A., et al. XEDS STEM tomography for 3D chemical characterization of nanoscale particles. Ultramicroscopy. 131, 24-32 (2013).
- Goris, B., Polavarapu, L., Bals, S., Van Tendeloo, G., Liz-Marzan, L. M. Monitoring galvanic replacement through three-dimensional morphological and chemical mapping. Nano Lett. 14, 3220-3226 (2014).
- Goris, B., et al. Three-dimensional elemental mapping at the atomic scale in bimetallic nanocrystals. Nano Lett. 13, 4236-4241 (2013).
- Jarausch, K., Thomas, P., Leonard, D. N., Twesten, R., Booth, C. R. Four-dimensional STEM-EELS: Enabling nano-scale chemical tomography. Ultramicroscopy. 109, 326-337 (2009).
- von Harrach, H., et al. Comparison of the Detection Limits of EDS and EELS in S/TEM. Microsc. Microanal. 16, 1312-1313 (2010).
- Tedsree, K., et al. Hydrogen production from formic acid decomposition at room temperature using a Ag-Pd core-shell nanocatalyst. Nat. Nanotechnol. 6, 302-307 (2011).
- Slater, T. J. A., Camargo, P. H., Burke, M. G., Zaluzec, N. J., Haigh, S. J. Understanding the limitations of the Super-X energy dispersive x-ray spectrometer as a function of specimen tilt angle for tomographic data acquisition in the S/TEM. J. Phys. Conf. Ser. 522, 012025 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- von Harrach, H., et al. An integrated Silicon Drift Detector System for FEI Schottky Field Emission Transmission Electron Microscopes. Microsc. Microanal. 15, 208-209 (2009).
- Slater, T. J. A., et al. Correlating Catalytic Activity of Ag-Au Nanoparticles with 3D Compositional Variations. Nano Lett. 14, 1921-1926 (2014).
- Lewis, E., et al. Real-time imaging and elemental mapping of AgAu nanoparticle transformations. Nanoscale. 6, 13598-13605 (2014).
