Summary
Astrocyter är en av de viktigaste nyckelspelare i det centrala nervsystemet (CNS). Här redovisar vi en praktisk metod för könsbestämmas hippocampus astrocyternas kultur protokoll för att studera mekanismerna bakom astrocyternas funktionen hos manliga och kvinnliga nyfödda valpar efter in vitro ischemi.
Abstract
Astroglios efter hypoxi / ischemi (HI) -relaterade hjärnskada spelar en roll i ökad sjuklighet och dödlighet hos nyfödda. Nyligen genomförda kliniska studier tyder på att graden av hjärnskada verkar vara sex beroende och att de manliga nyfödda är mer mottagliga för effekterna av HI-relaterade hjärnskador, vilket resulterar i mer allvarliga neurologiska utfall jämfört med kvinnor med jämförbara hjärnskador. Utvecklingen av tillförlitliga metoder för att isolera och bibehålla höganrikat populationer av könsbestämmas hippocampus astrocyter är viktigt att förstå den cellulära grund av könsskillnader i de patologiska konsekvenserna av neonatal HI. I denna studie beskriver vi en metod för att skapa sex specifika hippocampus astrocyternas kulturer som utsätts för en modell av in vitro-ischemi, syre-glukosbrist, följt av ny syresättning. Efterföljande reaktiv astroglios undersöktes av immunostaining för gliafibrillärt surt protein (GFAP) och S100B. Denna metod ger ett användbart verktyg för att studera rollen av manliga och kvinnliga hippocampus astrocyter efter neonatal HI, separat.
Introduction
Astrocyter är en av de viktigaste nyckelspelare i det centrala nervsystemet (CNS). Växande mängd bevis tyder på att roller astrocyter är mer än att ge neuronal stöd. I själva verket kan de roller astrocyter under fysiologiska förhållanden vara mycket komplex, såsom att styra migrering av utvecklings axoner 1, som reglerar CNS blodflöde 2, upprätthålla pH homeostas det synaptiska interstitialvätska 3, och deltar i blod-hjärnbarriären 4 och synaptisk transmission 5. Under patologiska tillstånd, astrocyter svarar på skada med en process som kallas reaktiv astroglios där morfologi, antal, plats, topografi (med avseende på avstånd från förolämpning) och funktion av astrocyterna kan förändras i en heterogen sätt 6,7. Astroglios sett efter neonatal hypoxisk ischemisk encefalopati kanske bidrar till sjuklighet och dödlighet hos nyfödda Senaste kliniska och experimentella studier visar att svårighetsgraden av hjärnskada verkar vara könsberoende och att de manliga nyfödda är mer mottagliga för effekterna av hypoxi / ischemi (HI) -relaterade hjärnskada, vilket resulterar i mer allvarliga neurologiska utfall jämfört med honor med jämförbara hjärnskador 9-11. Även lokalisering av skadan beror på gestationsålder och varaktigheten och svårighetsgraden av förolämpning, är hippocampus en av de mest verk regioner i CNS efter termen neonatal HI, och ökade hippocampus astroglios har bekräftats av uppreglering av den gliafibrillärt surt protein (GFAP) 3 d efter neonatal HI 7,10,12,13. Könsskillnader i astrocyternas funktion visades i både nyfödda och vuxna gnagare efter cerebral ischemi 14,15. Dessutom var manliga astrocytisk känslighet för in-vitro ischemi som visas av ökad cell död jämfört med kvinnliga kortikala astrocyter i kultur 16. Könsskillnader börjar in utero och fortsätter tills döden 17. Under det senaste årtiondet, har vikten av att inkludera könen i experimentella förhållanden i cellkultur och in vivo-studier varit betoningen av Institute of Medicine och NIH att söka grundläggande kunskaper i könsskillnader ses i fysiologiska och patologiska tillstånd 17,18 . Utveckling av tillförlitliga metoder för att isolera och bibehålla populationer av könsbestämmas hippocampus astrocyter är viktigt att förstå den cellulära grund av könsskillnader i de patologiska konsekvenserna av neonatal HI. Den aktuella studien var utformad för att ge tekniker för att framställa anrikat könsspecifika hippocampus astrocyternas kulturer från nyfödda möss för att bedöma roller GFAP-immunoreaktiva astrocyter efter syre / glukosbrist (OGD) och syresättningen (REOX), inducerarHI i cellodlingsmiljö. Denna teknik kan användas för att testa någon hypotes avseende hippocampala astrocyter i neonatala hanar och honor enligt normoxiska och ischemiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna studie genomfördes i enlighet med rekommendationen från Guide för skötsel och användning av försöksdjur av National Institute of Health. Djuret protokoll godkändes av University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care och användning kommittén. Primär astrocyternas kultur protokoll som presenteras här antas från de protokoll som lagts fram av Zhang Y 19 et al. Och Cengiz P 20 et al. Med vissa modifieringar.
1. hippocampus Dissection och astrocyter kultur
- Förbered alla nödvändiga reagenser och material, inklusive kirurgisk sax, släta fin pincett, platt spets pincett, pappershanddukar, sopsäck, 70% etanol och 2 dissekera rätter (3,5 cm diameter) på is fylld med 2 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) varje . Se till kirurgisk utrustning s är sterila (autoklav) före förfarandet och använda alla andra material (astrocyternas plätering medium: DMEM + 5% hästserum +1% penicillin-streptomycin, hästserum, HBSS, 0,25% trypsin, glas täck, petriskålar, 15/50 ml rör, T25-kolvar, etc.) som pre-steril.
- Håll försiktigt och spraya huvud och hals mus valp med 70% etanol och halshugga med vass steril sax [Bild 1 (1)].
- Gör en mittlinjen snitt från bakre till främre skalle med en liten sax längs hårbotten för att exponera hjärnan [Figur 1 (2-3)].
- Skär kraniet noggrant från halsen till näsan med en liten sax. sedan klippa kranium främre till lukt glödlampor och sämre än lillhjärnan att koppla kraniet från skallbasen.
- Gör ett litet snitt vid basen av skallen och skär längs mittlinjen. Använd sterila platt-tip pincett att skala bort skallen. Ta bort hjärnstammen med hjälp av en böjd tång. Ta hjärnan från kraniet och placera in den första dissekera skålen [Figur 1 (4-9)] 21.
- Med hjälp av en böjd pincett, vända hjärnan så att den ventrala ytan av hjärnan är vänd uppåt och sedan separera de båda halvkloten med en skarp steril kirurgiskt blad [Figur 1 (10,11)]
- Dra hjärnhalvorna och försiktigt bort utbuktande mitthjärnan och thalamus vävnad med en steril platta böjda pincett för att avslöja hippocampus, en liten, sjöhäst formad struktur i den mediala temporalloben [Figur 1 (12-14)].
- Ta bort både hippocampus lober [Figur 1 (15,16)] och försiktigt dissekera mening från lober genom att dra med fin pincett. Detta steg undviker kontaminering av den slutliga astrocyternas kultur genom meningeal celler och fibroblaster.
- Överför beredda hippocampus lober i den andra skålen fylld med HBSS och returnera den på is [Figur 1 (17,18)]. Pool både hippocampus lober från en enda mus (P0 - P2) för beredning av Hippocampal astrocyternas kulturer. Detta ger astrocyternas korrekt densitet. Finhacka hippocampus lober med hjälp av en vass steril kirurgiskt blad (ca 4 gånger).
- Aspirera HBSS från skålen med en steril spets fäst vid en 1 ml pipett och tillsätt 3 ml 0,25% trypsin, blanda, överför till en 15 ml sterilt koniskt rör och inkubera vävnaden vid 37 ° C under 20 min med försiktig skakning.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 5 min. Aspirera supernatanten försiktigt med en steril glaspipett ansluten till en vakuumledning. Tillsätt 10 ml astrocyternas plätering medium och finfördela (20 - 30 gånger) med en brand polerat glaspipett tills vävnadsbitar homogenisera.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 5 min. Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml färsk förvärmd astrocyternas plätering media. Pass celler genom en 70 pm nätfilter (cellfilter) i en ny 50 ml koniska rör.
- Platta hela cellsuspension på en Poly-D-lysin / laminin belagda sterilt T25 odlingskolv innehållande 3 mlastrocyternas plätering media, sedan inkubera kolven vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Aspirera hela media på dag- v-vitro (DIV) 1, DIV 3 och DIV 7, och ersätta med 2 ml färskt astrocyternas plätering media. Observera utvecklingen och astrocytisk sammanflödet under ljusmikroskop varje gång när du byter astrocyternas plätering media.
OBS: Vid DIV 1, är alla livskraftiga astrocyter fäst på ytan av odlingskolven och de döda eller döende celler som innehåller neuroner är flytande i supernatanten. Vid DIV 3, bifogade cellerna börjar dela sig för att bilda astrocytisk cellskikt. I avsaknad av stödjande förhållanden, är kultur nästan saknar neuronal tillväxt. Vid DIV 7, är astrocyt skikt av 80 - 90% sammanflytande och några mikroglia samt oligodendrocyt prekursorceller är närvarande på toppen av astrocytisk skiktet. - Aspirera plätering mediet från kolven, tillsätt 2 ml färsk förvärmd astrocyt plätering medium, skölj ennd ta igen på DIV 11, när astrocyter är sammanflytande och redo för sub odling.
- Tillsätt 2 ml 0,25% trypsin, rotera försiktigt kolven några gånger och aspirera trypsin med en steril glas pipett.
- Tillsätt 2 ml av 0,25% trypsin och låt kolven sitta i vävnadsodling huven under 4 - 5 min vid RT.
- Avlägsna trypsin och hålla kolven vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator under 10 min. Tillsätt 5 ml förvärmt astrocyternas plätering medium och lossa astrocytisk lagret genom att trycka kolven mot handflatan (3 - 4 gånger) följt av försiktig triturering att uppnå fullständig avskildhet och samla astrocyter i en 15 ml koniska rör.
- Centrifugera röret vid 300 xg under 5 min, aspirera supernatanten, och tillsätt 1 ml färskt astrocyt plating medium.
- Tillsätt 10 mikroliter av cellsuspensionen till en hemocytometer och räkna cellerna i den stora centrala inrutade ytan (1 mm 2) med användning av ett inverterat faskontrastmikroskop (10X objektiv). Multiply av 10 4 för att uppskatta antalet celler per ml. En T25 kolv kommer att ge ~ 1 x 10 6 totalt dissocierade celler. Utsäde ~ 1 x 10 5-celler i 2 ml astrocyt plätering medium på en 12 mm diameter Poly-D-Lysin förbelagda glastäckglas i brunnen av en 24-brunnars odlingsskål.
- Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Utför OGD / REOX vid DIV 12-14 (avsnitt 2).
- Behandla astrocyternas kulturer vid DIV 3 med 5 mM L-leucin-metylester (LME) hydroklorid tills DIV 11 om hippocampus kulturer saknar mikroglia önskas. Efter LME inkubation, till ämneskulturer till skakning (300 rpm under 1 h) avlägsna kontaminerande mikroglia.
OBS: LME är en microglial cytotoxiskt medel, som har använts i stor utsträckning som en metod för att eliminera prolifererande mikroglia 22.
2. OGD / REOX Behandling
- Aspirera media från täck innehållande vidhäftande astrocyternas kultur (DIV 12-14) och skölj 3 gångergenom att försiktigt rotera 24-brunnars odlingsskål som håller täckglas ett par gånger med 1 ml isoton OGD-lösning (pH 7,4) innehållande (i mM): 0 glukos, 21 NaHCOa 3, 120 NaCl, 5,36 KCI, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl2 och 0,81 MgSO 4.
- Lägga 0,2 mL OGD lösning på väl för att täcka täckglas och inkubera i 2 h i en hypoxisk inkubator innehållande 94% N 2, 1% O2 och 5% CO2. Blanda försiktigt med en orbital skakanordning (50 varv per minut) för den första 30 min av hypoxi för att underlätta gasutbytet.
- Inkubera normoxiska kontrollceller under 2 h i 5% CO2 och atmosfärsluft i en buffert identisk med den OGD lösning med undantag för tillsats av 5,5 mM glukos.
- För REOX, aspirera OGD lösning och tillsätt 2 ml av astrocyternas plätering medium. Inkubera i 5% CO2 och atmosfärisk luft vid 37 ° C under 5 h.
3. Immuncytokemiska Färgning </ P>
- Aspirera odlingsmediet med en steril glaspipett fäst vid en vakuumledning och snabbt skölja täckglas gång genom att tillsätta 1 ml av 0,1 M Tris-buffrad saltlösning (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) till brunnen. Aspirera och tillsätt 2 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inkubera under 15 min vid RT.
- Aspirera och tillsätt 1 ml av 0,1 M TBS, placera sedan på en gungande shaker i 2 min. Upprepa 3 ggr. Tillsätt 1 ml blockeringslösning (10% getserum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 i 0,1 M TBS) och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C på en gungande skakapparat.
- Aspirera blockerande lösning och tillsätt primära mus-monoklonal anti-GFAP-antikropp (0,2 ml av en 1: 500 spädning i blockeringslösning) och kanin-polyklonal anti-S100B (1: 500) eller polyklonal kanin-anti-HIF1α (1: 200) under 60 min vid 37 ° C på en gungande skakapparat.
- Alternativt är vissa astrocyter inkuberas med kanin polyklonal anti-IBA1 (1: 200) och mus monoclonal anti-MAP2 att få tillgång till kultur renhet.
- Aspirera primär antikropp och skölj täckglas genom att tillsätta 1 ml av 0,1 M TBS och placera på en gungande shaker i 2 min och sedan aspirera. Upprepa två gånger.
- Lägga 0,2 ml av en 1: 200 utspädning av sekundär get-anti-kanin 488-konjugerade och anti-mus-568-konjugerade antikroppar i blockerande lösningen under 60 min vid 37 ° C på en gungande skakapparat.
- Aspirera sekundär antikropp och skölj täckglas genom att tillsätta 1 ml av 0,1 M TBS och placera på en gungande shaker i 2 min och sedan aspirera. Upprepa två gånger.
- Ta bort täck från väl och torka genom att placera på en bild placerad på en slide-torrare. Mount täckglas på en ny bild genom att vända på en enda droppe Vectashield hardset monteringsmedium med DAPI (1,5 ng / l).
- Bildtäck på en konfokalmikroskop med antingen 20X torr eller 60X objektiv olja. Få bilder (512 x 512) för DAPI (405 nm ex / 450 nm em) och fluorokrom 488 märkta GFAP antikropp (488 nm ex / 515 nmem). Håll förvärvsparametrar konstant inom 20X och 60X grupper.
4. könsbestämning Använda PCR
- Värme pup tå eller finger urklipp vid 95 ° C under 45 min i 50 mM NaOH och neutralisera med lika stor volym av 1 M Tris, pH 6,8.
- Lägga en mikroliter av den extraherade DNA-lösningen till 19 mikroliter av följande blandning: 5 pmol av primers för de Myog och SRY gener, 1x reaktionsbuffert, 0,2 mM vardera deoxinukleotid och 8 U Taq-polymeras.
- Använd primers sekvenser; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3 "och Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3 '23.
- Utför följande PCR-protokoll: 95 ° C under 3 minuter och därefter 30 cykler av denaturering vid 95 ° C under 15 s, hybridisering vid 58 ° C under 15 sekunder, och förlängning vid 72 ° C under 1 min. Efter denna 30 cykler, avslutar reaktionen med en slutlig 72 ° C förlängning under 1 min.
- separat PCR produkter elektroforetiskt på en etidiumbromid-innehållande 2% agarosgel och visualisera under UV-belysning. (Figur 2A.) VARNING! Etidiumbromid är ett potentiellt cancerframkallande och måste hanteras varsamt och kasseras enligt institutionens föreskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förstå roller könsbestämmas astrocyternas fungerar under fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd har oerhört klar genom odling dessa celler under in vitro-betingelser. Den viktiga aspekten av att utföra könsbestämmas odling är att bestämma könet på mus pup före dess användning. Vi bestäms könet på mus genetiskt genom PCR och genom visuell bedömning (figur 2) 16. Metoden för könsbestämning med användning av PCR antogs med ändringar från McClive och Sinclair, är snabbt, enkelt och mycket reproducerbar metod 23. Figur 2A visar representativa resultat av könsbestämning med hjälp av PCR. PCR-produkter genererades med DNA från två representativa P1 manliga och kvinnliga svans klipp. Reaktionen innefattar multiplexerade primerpar för SRY och Myog gener som genererar manliga specifika band av 441 bp och kvinnliga specific band av 245 bp respektive. Visuell bestämning av neonatal (P 1-3) mus sex med blotta ögat bildades genom att leta efter förekomst av små mörkare plats mellan anogenital öppningar endast hos män (figur 2B) 16,24.
Även odling av astrocyter är bekvämt och relativt lätt att etablera under laboratorie inrättas, kan denna fördel hindras av sin förorening främst med mikroglia eller nervceller i mindre utsträckning. Kontaminering av astrocyter kan lätt bestämmas genom immunmärkningen av de odlade cellerna med cellspecifika markörer för antingen mikroglia (IBA1) eller neuroner (MAP2). I den aktuella studien var hippocampus astrocyter som växer i primära monoskiktsodlingar observerades ha ~ 6% av förorenande mikroglia vid DIV 14, som föreslagits av ett fåtal celler som uttryckte IBA1 (Figur 3). Tvärtom var ingen av cellerna befanns uttrycka MAP2 tyderkulturen var helt saknar neuronal kontaminering (Figur 3). Den mindre microglial förorening observerades i våra kulturer är i enlighet med andra rapporter, där författarna rapporterade en 5% microglial förorening i deras primära kortikala astrocyternas kulturer härledda 1-3 dagar gamla möss valpar 25. Astrocyter har en specifik cytoarchitecture som tillåter dem att svara på förändringar i deras mikro inklusive hypoxi. För att bestämma någon könsspecifik astrocytisk svar på in vitro ischemi, vi utsätts könsbestämmas hippocampus astrocyter till OGD / REOX. Framgångsrik induktion av OGD / REOX bestämdes genom den ökade nukleära uttrycket av hypoxi inducerbara faktor 1 alfa (HIF1α observerats i GFAP + astrocyter som utsätts för 2 h OGD följt av 5 h REOX jämfört med de HIF1α uttrycken i celler under normoxiska förhållanden (Figur 4 ).
(Figur 5). GFAP och S100B var samlokaliserades i cytoplasman och cellkropparna av astrocyter, som kännetecknar en mogen astrocytisk utvecklingsstadium där dessa celler tenderar att förlora sin Neural Stem Cell (NSC) potential 26. Morfologi och densitet GFAP eller S100B immunoreaktiviteter liknade i både manliga och kvinnliga astrocyternas kulturer observerades i deras respektive normoxiska och OGD / REOX behandlingsgrupperna. Under normoxiska förhållanden, hippocampus astrocyter presenterade en polygonal att spolformade och platt morfologi [figur 5A, B (normoxia 60X, pil)], som utvärderas med hjälp av konfokalmikroskopi. Dessa celler kunde dela upp tills sammanflytande i ungefär två veckor före induktionen av OGD / REOX. Efter 2 timmar OGD och 5 h REOX, astrocyter uppvisade klassiska Reactive astrocyternas morfologi visar tillbakadragna primära processer, hypertrofi av soma och processer, och ökat uttryck av GFAP eller S100B [figur 5A, B (OGD / REOX, 60X, pilspets)]. Efter den OGD / REOX, GFAP / S100B färgning uppvisade också en omfattande meshwork som sträcker sig tvärs cytoplasman i både manliga och kvinnliga hippocampus astrocyter. Brist på GFAP-färgning observerades i de odlade hippokampala astrocyter från GFAP null möss tjänade som en negativ kontroll (figur 5B, inlägg). Ovanstående resultat ger direkta bevis för att morfologi GFAP / S100B-immunoreaktiva astrocyter genomgår stora förändringar när de utsätts för OGD-REOX.
Figur 1. Illustrationer av hippocampus Removal teknik från P1 möss. 1. Decapitate pup för att avlägsna huvudet.2, 3. Med fin sax, gör en mittlinje snitt i huden, till bakre främre och dra tillbaka huden med hjälp av en platt-tip pincett. 4, 5, 6. Gör ett litet snitt vid basen av skalle. Skär skallen längs mittlinjen och skala bort två halvor för att exponera hjärnan. 7, 8. Avlägsna lillhjärnan med hjälp av en böjd pincett. 9. Försiktigt bort hjärnan från kraniet och plats i en steril petriskål. 10, 11. Vänd på hjärnan så att den ventrala ytan av hjärnan är vänd uppåt med hjälp av en böjd pincett, sedan separera de båda halvkloten med en skarp steril kirurgisk kniv. 12, 13, 14. Avlägsna utbuktande mitthjärnan och thalamus vävnad lämnar intakt underliggande halvklotet och avslöjar hippocampus. 15, 16. Ta hippocampus (liten C-formad struktur). 17 18. placera omedelbart hippocampus lober som erhållits från båda halvklot i ett separat petriskål med steril HBSS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sex Bestämning av neonatala möss. A. Mus kön var genetiskt betingade av PCR med primers specifika för Myog (X-kromosom) och Sry (Y-kromosom) gener med hjälp av DNA extraherat från finger eller tå Urklipp (F 1, M 1). Banden av PCR visualiserades på en 2% agarosgel med etidiumbromid under UV-belysning. F 2 och M 2 tjänade som positiva kontroller för kvinnliga och manliga respektive. B. Visuell bestämning av manlig från kvinnor bildades genom att identifiera ett mörkt ställe mellan anogenital öppningar (pil).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. renhet Primary Mouse hippocampus astrocyternas kultur. Immunfärgning av astrocyternas kultur med neuronal markör MAP2 (röd) och mikroglia markör IBA1 (grön). Kärnor färgades med 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Pilen indikerar förorening mikroglia. Skala bar. 50 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. HIF1α Uttryck Iskrynkliga i odlade hippocampus Astrocyter Utsatt för OGD / REOX. Representativa immunofluorescerande bilder som visar GFAP (röd) och HIF1α (grön) märkning astrocyter utsatts för (A) normoxi eller (B) OGD (2 h) / REOX (5 h). Kärnor färgades med 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Pil, låg HIF1α uttryck; pilspets, förhöjda HIF1α kärn uttryck. Skala bar. 25 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Uppreglering av S100B eller GFAP Expression i könsbestämmas hippocampus astrocyter kulturer efter OGD-REOX. Könsbestämmas odlade hippocampus astrocyter färgades för S110b eller GFAP uttryck under normoxiska betingelser eller sedan tvåh OGD följt av 5 h REOX (OGD / REOX). Infällt: 60X bild från hippocampus astrocyter odlade från GFAP null möss. Skala bar: 30 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att studera könsskillnader i egenskaper och funktion hos astrocyter under fysiologiska och patologiska tillstånd, är framställningen av könsbestämmas primära astrocyter i cellkultur ett viktigt verktyg för att utnyttja. I den aktuella studien rapporterar vi en mycket effektiv och reproducerbar metod att odla en höganrikat homogen befolkning könsbestämmas hippocampus astrocyter från nyfödda (P0-P2) C57Bl / 6 (vildtyp) eller K19F (GFAP null) mus valpar in vitro. Upprättande denna metod hjälper utredarna förstå de fysiologiska och patologiska funktioner könsbestämmas hippocampus astrocyter efter in vitro ischemi.
Det finns två viktiga steg i upprättandet av denna metod, inklusive upprätthållandet av sterilitet och tillräcklig nedbrytning av hippocampus lober under trypsinering följt av finfördelning av den nedbrutna vävnaden i syfte att uppnå en enda cell suspension. Förebyggande av primära astrocyter frånfå förorenat är en av de största utmaningarna under hela odlingsprocessen. Bakteriell och / eller svamp är två vanliga former av föroreningar som kan återge de odlade cellerna värdelösa om lämplig vård inte antas när de utför tekniken. Därför, i syfte att säkerställa experimentell framgång, är det absolut nödvändigt att genomföra processen under en steril arbets inställning som omfattar desinficering arbetsplatsen före användning, med hjälp av steril kirurgisk utrustning och material, undvika kontakt av sterila material med sterila ytor med hjälp av en laminärt flöde huva och undvika att ta icke-begränsade odlingsflaskor av den laminära huva. Dessutom, under enzymatisk dissociation, kan längre inkubation av hippocampus vävnad med trypsin följt av omfattande fysiska rivning leda till att över matsmältningen resulterar i dålig cellviabilitet och ineffektiv fastsättning av dissocierade celler till odlingsflaskor.
Tvärtom erbjuder otillräcklig underdigestion av hjärnvävnaddissociation av gliaceller och därigenom resulterar i dåligt utbyte och sådd av celler som stora klumpar. Därför, i syfte att erhålla friska astrocyternas kulturer är det nödvändigt att optimera trypsinkoncentration, inkubationstid och triturering för att uppnå optimal nedbrytning av hippocampusvävnad. I våra händer, inkubation av hippocampus lober med arbetskoncentration av 0,25% trypsin under 20 min vid RT följt av försiktig triturering under 20 - 30 gånger gav starkt vidhäftande, friska och mycket reproducerbara astrocyternas kulturer. Även upprepad frysning och upptining av reagens före användning varje gång kan minska deras effektivitet. Därför är det mycket viktigt att delmängder reagens i små önskvärda mängder och frysa. Till exempel, lagra trypsin, penicillin / streptomycin som 5 ml alikvoter och fetalt bovint serum som 50 ml alikvoter i talrika sterila koniska rör vid -20 ° C fram till användning. Vi rekommenderar att inte använda antibiotika efter utgångsdatum.
GFAP är awell karakteriserad markör av reaktiva fibrösa astrocyter. Efter OGD / REOX, uppreglering av GFAP uttryck som svar på reaktiv astroglios har rapporterats 20. Även om det har föreslagits att GFAP överuttryck skulle kunna användas som specifikt mål för neuronal reparation strategier 27 dess roll i hippocampus skador efter Hl hos nyfödda är fortfarande oklart. Immunhistokemisk färgning av astrocyter med GFAP ger oss möjlighet att identifiera och karakterisera dessa celler under fysiologiska och patologiska tillstånd. GFAP färgning som alla andra markör har vissa begränsningar som måste erkännas. En av begränsningarna i GFAP färgning av astrocyter är att inte alla astrocyter uttrycker GFAP under fysiologiska förhållanden. Speciellt omogna astrocyternas uttryckshastighet GFAP inte överstiger 40% under fysiologiska förhållanden 28. Beroende på ålders- och typ-specifika användningen av astrocyter, kan andra markörer för val betraktas såsom GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 och S100B 29.
Dessutom närvaro av NSCs förklädd till astrocyter i primära kulturer inte kan uteslutas. Dessa NSCs har visat sig medföra fenotypiska och ultra egenskaper som liknar mogna astrocyter inklusive uttryck av GFAP. Därför är identifiering av molekylära markörer som är specifika för fullt differentierade och mognat astrocyter ett måste. Astrocyter rapporterades uttryckt S100B vid sina senare fullständigt differentierade utvecklingsstadier. Nyligen har det rapporterats att neonatal kortikala GFAP + astrocyter förlorar sin föregångare stamcells potential med uppkomsten av S100B uttryck som händer runt DIV 15 26. Även i våra odlingsbetingelser på DIV 14, var 91% av GFAP-uttryckande celler befanns samuttrycker S100B, som tyder på att kulturerna består av främst terminalt differentierade mognade hippocampus astrocyter.
Det är nästan omöjligt att erhålla rena primära hippocampala astrocyternas kulturer helt saknar kontaminerande mikrogliaceller som bor över och under astrocyternas monolager. Därför är det viktigt att veta hur stor andel av kontaminerande mikroglia i astrogliala kulturer och även att hålla denna proportion så låg som möjligt. I den aktuella studien färgade vi astrocyternas kulturer med mikroglia specifik markör IBA1 eller neuronal markör MAP2 i syfte att fastställa förekomst av mikroglia eller nervceller som potentiella föroreningar. Andelen mikroglia i gnagare astrocyt kultur kan variera från 1% till 30% beroende på flera faktorer som inkluderar djur ålder, art, region, odlingsmedium, subodling metod och skakning 30. I våra kulturer observerade vi cirka 6% av microglial förorening som är jämförbar med andra rapporter 25. Om den avsedda användningen av astrocyternas kultur är att studera betydelsen av hippocampus astrocyter i inflammation är det absolut nödvändigtatt behandla kulturerna med 5 mM LME under 10 d för att eliminera eventuell microglial förorening i astrocyternas kulturer börjar från DIV 3. LME är en microglial cytotoxiskt medel som har använts i stor utsträckning som en metod för att avlägsna prolifererande mikroglia 20,22. Dessutom bör LME-behandlade kulturer utsättas för en skakning protokollet (300 rpm under 1 h).
En annan teknisk utmaning att utföra OGD / REOX är att avgöra om en tillräcklig grad av hypoxi har uppnåtts för att inducera astroglios. Markörer för hypoxi i astrocyter inkluderar uppreglering av GFAP och induktion av HIF-1α. Således, i denna studie hypoxi bekräftades genom ökningen i GFAP-immunreaktivitet (data ej visat) och uppregleringen av HIF1-α-färgning (figur 4).
Sammanfattningsvis resultaten från könsbestämmas neonatal hippocampus astrocyternas kulturer visade framgångsrik cellbindning med friska homogent astrocyternas skikt displaying typisk morfologi på täckglas och uttrycket av den huvudsakliga reaktiva astrocytisk markörer GFAP och S100B vid induktion av in-vitro-ischemi. Vi tror att det protokoll som antogs här har potential att besvara viktiga mekanistiska och translationella frågor som rör rollen av astrocyter i utvecklingen av manliga och kvinnliga hjärnor. Hela odlingsförfarandet i motsats till de flesta existerande tekniker genererar mogna och sammanflytande könsbestämmas hippocampus astrocyter i två veckor, ge en snabb vändning av experiment och enkelheten i tekniken kommer att underlätta användningen av astrocytisk odlingsmetod som ett verktyg för att studera kön specifika roll gliaceller i växande hjärnan vilket möjliggör att dess spridning i hjärnforskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande eller motstridiga intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V.
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M.
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
