Summary
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. Burada, sonra in vitro iskemi erkek ve kadın yeni doğan yavrular astrosit fonksiyonu altında yatan mekanizmaları araştırmak için cinsiyetli hipokampal astrosit kültürü protokolünün pratik bir yöntem bildiriliyor.
Abstract
hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarını takiben astrogliasis yenidoğanlarda artmış morbidite ve mortalite bir rol oynar. Son klinik çalışmalar beyin hasarının şiddeti seks bağımlı gibi görünen gösterir ve erkek yenidoğanlarda karşılaştırılabilir beyin hasarı olan kadınlara kıyasla daha ciddi nörolojik sonuçlara yol açan, HI-ilişkili beyin hasarının etkilerine daha duyarlı olduğunu. yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit zenginleştirilmiş popülasyonları korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışmada, reoksijenasyonun ardından in vitro iskemi, oksijen glukoz yoksunluk bir model maruz cinsiyete spesifik hipokampal astrosit kültürleri oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Daha sonra reaktif astrogliasis immunostai ile incelendiGlial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100B için Ning. Bu yöntem ayrıca, yenidoğan HI aşağıdaki erkek ve kadın hipokampal astrositler rolünü incelemek için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. kanıt Büyüyen vücut astrositlerin rolleri nöronal destek sağlama daha olduğunu gösterir. Aslında, fizyolojik koşullar altında astrositlerin rolleri gibi, merkezi sinir sistemi, kan akışını düzenleyen 2, gelişmekte olan aksonlar 1 göçünü yol sinaptik dokulararası sıvının 3 pH homeostazını sürdürmek ve kan-beyin bariyerinin katılmak gibi çok karmaşık olabilir 4 ve sinaptik iletim 5. Patolojik koşullar altında, astrositler astrositler ve fonksiyon (zedelenmesinden mesafeye göre) morfolojisi, sayı, yer, topografya heterojen bir şekilde 6,7 değişebilir olan reaktif astrogliasis adı verilen bir işlem ile hasara yanıt. belki yenidoğanların morbidite ve mortalite katkıda yenidoğan hipoksik iskemik ensefalopati aşağıdaki görüldü astrogliasis Son klinik ve deneysel çalışmalar, beyin hasarı şiddeti ile karşılaştırıldığında erkek yenidoğanlarda daha ciddi nörolojik sonuçlara neden hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarı etkilerine daha duyarlı olduğunu seks bağımlı gibi görünüyor ve olduğunu göstermektedir karşılaştırılabilir beyin yaralanması 9-11 ile kadın. Yaralanma lokalizasyonu gestasyonel yaş ve süresi ve hakaret şiddetine bağlıdır rağmen, hipokampus dönem yenidoğan HI sonra MSS en çok etkilenen bölgelerden biri olan ve hipokampal astrogliasis up-regülasyonu ile teyit edilmiştir arttı Glial fibriller asidik protein (GFAP) yenidoğan HI 7,10,12,13 sonra 3 gün. Astrosit fonksiyonunda cinsiyet farklılıkları serebral iskemi 14,15 sonrasında yenidoğanlarda ve yetişkin kemirgenlerde gösterilmiştir. Buna ek olarak, in vitro iskemi erkek astrositik hassasiyeti yükselttiği cel ile gösterilmiştirKültür 16 dişi kortikal astrositler göre l ölümü. Cinsiyet farklılıkları in utero başlar ve ölüm 17 kadar devam eder. Son on yılda, hücre kültürü ve in vivo çalışmalarda deneysel koşullarda cinsiyete dahil önemi Tıp ve NIH Enstitüsü vurgu fizyolojik ve patolojik durumlarda 17,18 görülen cinsiyet farklılıkları temel bilgiyi aramak olmuştur . yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit popülasyonlarının korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışma Oksijen / Glikoz Yoksunluk (OGD) ve reoksijenasyon (REOX), indükleyici aşağıdaki GFAP-immünoreaktif astrositler rollerini değerlendirmek için yeni doğmuş farelerden zenginleştirilmiş cinsiyete özgü hipokampal astrosit kültürleri hazırlamak için teknikler sağlamak için tasarlanmıştırHücre kültürü ortamı, HI. Bu teknik normoksik ve iskemik koşullarda yenidoğan kadın ve erkeklerde hipokampal astrositler ile ilgili tüm hipotezi test etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım için Kılavuz önerisi ve Kullanımına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. hayvan protokolü Wisconsin-Madison, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Burada sunulan birincil Astrosit Kültür protokolü Zhang Y 19 vd. Ve Cengiz P 20 vd tarafından sunulan protokolleri kabul edilir. Bazı değişikliklerle.
1. Hipokampal Diseksiyon ve Astrosit Kültür
- 2 ml Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) her ile dolu buz üzerinde cerrahi makas, düz ince forseps, düz uçlu forseps, kağıt havlu, çöp torbası,% 70 etanol ve 2 diseksiyon yemekler (3.5 cm çapında) de dahil olmak üzere gerekli tüm reaktifleri ve materyalleri hazırlamak . Emin olun cerrahi aletler en vardır (otoklav) prosedür öncesinde ve Astrosit orta kaplama (tüm diğer malzemeleri kullanın steril: DMEM +% 5 at serumu +% 1 ön steril olarak penisilin-streptomisin, at serumu, HBSS,% 0.25 tripsin, cam lamelleri, petri, 15/50 ml tüpler, T25 şişeleri, vs.).
- Yavaşça tutun ve% 70 etanol ile baş ve fare yavru boyun sprey ve keskin steril makas kullanarak decapitate [Şekil 1 (1)].
- Beyin [Şekil 1 (2-3)] maruz derisi boyunca küçük makas ile kafatası anterior posterior orta hat kesi gerçekleştirin.
- küçük makas ile burun boyun dikkatle kafatası kesti. Sonra kafa tabanı kafatası kesmek için beyincik için kafatası koku ampuller anterior ve inferior kesti.
- Kafatasının dibinde küçük bir kesi yapmak ve orta hat boyunca kesilir. kafatasını uzak soyma steril düz uçlu forseps kullanabilir. kavisli bir forseps yardımıyla beyin sapı çıkarın. Kafatası beyin çıkarın ve birinci diseksiyon çanak içine yerleştirin [Şekil 1 (4-9)] 21.
- Kavisli bir forseps kullanarak, beynin ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde beyin çevirin ve daha sonra keskin bir steril cerrahi bıçak [Şekil 1 (10,11)] ile her iki yarımkürede ayrı
- Peel geri serebral hemisfer ve dikkatle hipokampus, medial temporal lob [Şekil 1 (12-14)], küçük bir denizatı şeklindeki yapıyı ortaya çıkarmak için steril bir düz kavisli bir forseps ile şişkin orta beyin ve talamik doku kaldırmak.
- Hem hipokampal lobu [Şekil 1 (15,16)] çıkartın ve dikkatlice ince forseps ile çekerek lob gelen meninksler incelemek. Bu adım Meningeal hücreleri ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültürü kirlenmesini önler.
- HBSS ile dolu ikinci çanak içine hazırlanmış hipokampal lobları aktarın ve buz [Şekil 1 (17,18)] üzerine geri. hippo hazırlanması için - tek bir fare Pool hem hipokampal lob (P2 P0)campal astrosit kültürleri. Bu astrosit uygun yoğunluğunu verir. Keskin steril cerrahi bıçak (yaklaşık 4 kat) kullanarak hipokampal lobları kıyma.
- Aspire HBSS, 15 ml steril konik tüp transferi ve yavaşça çalkalanarak 20 dakika boyunca 37 ° C'de doku inkübe, karıştırın, çanak 1 ml pipet bağlanmış bir steril bir ucunu kullanarak ve% 0.25 tripsin 3 ml.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj tüpü. Aspire süpernatan dikkatle bir vakum hattına bağlanmış bir steril bir cam pipet kullanılarak. (- 30 kez 20) doku parçaları homojenize kadar yangın parlatılmış cam pipet kullanarak orta ve çiğnemek kaplama 10 ml astrocyte ekleyin.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj tüpü. Süpernatant aspire ve taze önceden ısıtılmış astrosit kaplama medya 2 mL ekleyin. Yeni 50 ml konik tüp içine 70 mikron örgü filtre (hücre süzgecinden) aracılığıyla hücrelere geçerler.
- 3 mL içeren bir poli-D-Lisin / laminin kaplanmış steril T25 kültür şişelerinde Plaka tüm hücre süspansiyonuastrosit kaplama ortamı, daha sonra bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir balon inkübe edin.
- Gün-de aspire tüm ortam i, n-vitro (DIV) 1, DIV 3 ve DIV 7 ve taze astrosit kaplama medya 2 mL ile değiştirin. astrosit kaplama medya değiştirirken ışık mikroskobu altında her zaman ilerlemesi ve astrositik izdiham gözlemleyin.
Not: DIV 1 'de, tüm canlı astrositler kültür şişesi yüzeyi ve sinir yüzer yüzen dahil ölü veya ölmekte hücrelere eklenir. DIV 3 at, ekli hücreler astrositik hücre tabakası oluşturmak için bölünmeye başlar. elverişli koşullar yokluğunda, kültür bir nöronal büyüme hemen yoksundur. % 90 konfluent ve birkaç mikroglia olarak oligodendrosit ön-madde hücreleri, astrositik tabakanın üstünde bulunan edilir - DIV 7 'de, astrosit tabaka yaklaşık 80'dir. - durulama, şişesi kaplama orta aspire taze önceden ısıtılmış astrosit kaplama orta 2 mL eklemekastrositler birleşen ve kültürü alt hazır olduğunda nd, DIV 11 tekrar kaldırın.
- yavaşça şişeye birkaç kez döndürmek ve aspire tripsin steril bir cam pipet kullanarak,% 0.25 tripsin 2 mL ekleyin.
- % 0.25 tripsin 2 mL ekleyin ve şişe 4 doku kültürü kaputu bekletin - oda sıcaklığında 5 dakika.
- Tripsin çıkarın ve 10 dakika boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir balon tutun. 5 ml orta kaplama astrocyte prewarmed ekleyin ve avucunuzun karşı balon dokunarak astrositik katmanı ayırmak - tam dekolmanı sağlamak ve bir 15 ml konik tüp astrositler toplamak için yumuşak ezilerek (3 4 kez).
- Santrifüj tüp, 5 dakika boyunca 300 x g'de, süpernatanı havalandırın, ve 1 mL taze astrosit kaplama ortamı ilave edin.
- Bir hemasitometre hücre süspansiyonu 10 mcL ekleyin ve ters bir faz kontrast mikroskobu (10X objektif) kullanarak büyük merkezi Gridlenmiş alana (1 mm 2) hücreleri saymak. Multiply 10 4 tarafından mL başına hücre sayısını tahmin etmek. Bir T25 şişesi ~ 1 x 10 6 toplam ayrışmış hücreleri verecektir. Tohum ~ 1 x 10, 24 oyuklu bir kültür kabı oyuk bir 12 mm çaplı poli-D-Lisin önceden kaplanmış cam lamel 2 mL astrosit kaplama ortamı içinde 5 hücreleri.
- % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. 14 (bölüm 2) - DIV 12, OGD / REOX gerçekleştirin.
- mikroglia yoksun hipokampal kültürleri isteniyorsa DIV 11 kadar, 5 mM L-lösin metil ester (LME) hidroklorür ile DIV 3 de astrosit kültürleri tedavi edin. LME inkübasyondan sonra (1 saat 300 rpm) sallayarak tabi kültürler mikroglia kirlenmesine neden kaldırmak için.
Not: LME mikroglia 22 çoğalan ortadan kaldırmak için bir yöntem olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır, bir mikroglial sitotoksik maddedir.
2. OGD / REOX Tedavisi
- Aspire yapışık astrosit kültürü içeren lamel medya (DIV 12 - 14) ve durulama 3 kezhafifçe lamel (mM olarak) 1 ml izotonik OGD çözeltisi (pH 7.4) bir kaç kez tutarak 24 oyuklu kültür çanak döndürerek 0 glükoz, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5.36 KCI, 0.33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl2 ve 0.81 MgSO 4.
- CO2 lamel kapak ve% 94 N2,% 1 O 2 ihtiva eden bir hipoksik inkübatörde 2 saat boyunca inkübe ve% 5 oyuğa 0.2 ml OGD solüsyonu eklenir. Yavaşça gaz değişimini kolaylaştırmak için hipoksi ilk 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı (50 rpm) ile karıştırın.
- 5.5 mM glukoz eklenmesi dışında OGD solüsyonuna denk bir tampon içinde% 5 CO2 ve atmosferik hava içinde, 2 saat boyunca normoksik kontrol hücrelerini inkübe edin.
- ve REOX, aspirat OGD çözümü için orta kaplama astrosit 2 mL ekleyin. 5 saat boyunca 37 ° C 'de% 5 CO2 ve atmosferik hava içinde inkübe edin.
3. İmmünositokimyasal Boyama </ P>
- bir vakum hattına bağlanmış bir steril cam pipet kullanılarak kültür ortamı aspire ve hızlı bir şekilde 0.1 M Tris tamponlu tuz (TBS) içinde 1 ml ekleyerek lamel kez yıkayın (154 mM NaCI, 16 mM Trizma bazı, 84 mM Tris-HCI, pH 7.4) kuyusuna. Aspire edin ve 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) 2 ml. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- Aspire ve 0.1 M TBS 1 ml, daha sonra 2 dakika süreyle sallanan bir sallayıcı üzerinde yerleştirin. 3 kez tekrarlayın. çözeltisi (% 10 keçi serumu, 0.1 M TBS içerisinde 10 mg / ml BSA,% 0.025 Triton X-100) bloke 1 ml ilave edilir ve sallanan bir sallayıcı üzerinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Aspire bloke etme çözeltisi ve primer fare monoklonal anti-GFAP antikoru ilave 60 dakika boyunca: Anti-HIF1α (200 1) veya tavşan poliklonal (1 0.2 mL: bloke etme çözeltisi 500 seyreltme) ve tavşan poliklonal anti-S100b (500 1) sallanan çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de ilave edildi.
- ve fare Pazartesi: Alternatif olarak, bazı astrositler tavşan poliklonal anti-IBA1 (200 1) ile inkübe ediliroclonal anti-MAP2 Kültür saflığı ulaşmak için.
- Aspire birincil antikor ve 0.1 M TBS 1 mL eklenmesini ve 2 dakika sonra aspirasyon için bir sallanan çalkalayıcı üzerinde koyarak lamel durulayın. İki kez tekrarlayın.
- sallanan çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 60 dakika süre ile çözelti bloke sekonder keçi anti-tavşan 488-konjuge anti-fare 568-konjüge edilmiş antikor 200 seyreltme: 1 0.2 ml ekleyin.
- Aspire sekonder antikor ve 2 dakika sonra aspirasyon için bir sallanan çalkalayıcı üzerinde 0.1 M TBS 1 mL eklenmesini ve yer ile lamel durulayın. İki kez tekrarlayın.
- Bir slayt-kurutucu üzerinde konumlandırılmış bir slayt üzerinde koyarak iyi ve kuru lamel çıkarın. Vectashield tek bir damla tersini yeni bir slayt Mount lamel DAPI (1.5 ng / ml) ile montaj orta hardset.
- ya 20X kuru ya da 60X petrol hedefi kullanarak bir konfokal mikroskop görüntü lamelleri. DAPI (405 nm ex / 450 nm em) ve florokrom 488 görüntüleri (512 x 512) Edinme GFAP antikoru etiketli (488 nm ex / 515 nmem). 20X ve 60X grup içinde sürekli elde etme parametrelerini tutun.
PCR kullanarak 4. Cinsiyet Tayini
- Isı yavru ayak ya da 50 mM NaOH, 45 dakika boyunca 95 ° C de parmak kırpıntıları ve 1 M Tris, pH 6.8 eşit hacmi ile nötralize.
- Myog, Sry genleri için primerler 5 pmol, 1 x reaksiyon tamponu, 0.2 mM deoksinükleotid 8 U Taq polimeraz: Aşağıdaki karışım 19 uL edilen DNA çözeltisi 1 uL ekleyin.
- primerleri dizilerini kullanın; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 '5'CATGACCACCACCACCACCAA3 "ve Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3' 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3 '23.
- 1 dakika boyunca 72 ° C'de 15 saniye boyunca 58 ° C 'de 15 saniye, tavlama için 95 ° C' de 3 dakika boyunca denatürasyon, sonra 30 döngü 95 ° C, ve uzama: Aşağıdaki PCR protokolü gerçekleştirin. Bu 30 döngü sonra, reaksiyon 1 dakika boyunca son bir 72 ° C uzatma ile son bulur.
- ayrı PCR ürünleri elektroforetik etidyum bromür ihtiva eden% 2 agaroz jeli üzerinde ve UV aydınlatması altında görselleştirmek. (Şekil 2A.) DİKKAT! Ethidium bromür potansiyel bir kanserojen ve dikkatle ele ve kurumun düzenlemelerine uygun olarak düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fizyolojik veya patofizyolojik koşullarda cinsiyetli astrosit fonksiyonlarının rolleri anlamak gayet in vitro koşullarda bu kültür hücreleri tarafından da elde edilmiştir. cinsiyetli Kültürleme gerçekleştirme önemli yönü önce kullanımına fare yavru seks belirlemektir. Biz genetik olarak PCR ile ve görsel değerlendirilmesi (Şekil 2) 16 ile fare seks belirlendi. PCR kullanılarak cinsiyet tayini metodolojisi McClive ve Sinclair gelen değişikliklerle kabul edildi, hızlı, basit ve yüksek tekrarlanabilir bir yöntemdir 23. Şekil 2A PCR kullanılarak cinsiyet tayini temsilcisi sonuçlarını gösterir. PCR ürünleri iki temsilci P1 erkek ve kadın kuyruk snips çıkarılan DNA ile üretilmiştir. Reaksiyon 441 bp ve dişi Belir erkek belirli bantlar oluşturur Sry ve Myog genleri için birden fazla mesaj primer çiftleri içerirsırasıyla 245 bp, bir ic bantlar. Yenidoğan (P 1-3) Görsel belirlenmesi çıplak gözle fare seks sadece erkeklerde (Şekil 2B) 16,24 anogenital açıklıkları arasındaki küçük Darkened nokta varlığı arıyor tarafından kurulmuştur.
astrositlerin kültür kurmak laboratuvara altında kurmak kolay ve nispeten kolay olmakla birlikte, bu avantaj öncelikle bir dereceye kadar mikroglia veya nöronlar ile kontaminasyon tarafından engellenmiş olabilir. astrositlerin kirlenmesi kolayca ya mikroglia (IBA1) ya da nöron (MAP2) hücre özel işaretleri ile kültürlenmiş hücrelerin immün belirlenebilir. IBA1 (Şekil 3) olarak ifade edilmiştir, bir kaç hücre tarafından önerilen Bu çalışmada, primer tek tabakalı kültürler içinde büyüyen hipokampal astrositler, DIV 14 de kirletici mikroglia ~% 6 sahip olduğu gözlenmiştir. Tam tersine, hücre yok öne MAP2 ifade bulunmuşturKültür herhangi nöronal kontaminasyon (Şekil 3) tamamen yoksun oldu. 3-günlük fare yavrular 25 - eden kültürlerde gözlenen küçük mikroglial kirlenme yazarlar 1 türetilmiş birincil kortikal astrosit kültürlerinde% 5 mikroglial kirlenme rapor olup, burada, diğer raporlar doğrultusunda yer almaktadır. Astrositler onlara hipoksi dahil olmak üzere mikroçevresinin değişikliklere yanıt izin belirli bir hücre mimarisini sahiptirler. In vitro iskemi herhangi bir cinsiyet özel astrositik yanıtı belirlemek için biz OGD / REOX için cinsiyette hipokampal astrositler tabi tutuldu. Normoksik koşullar altında hücrelerde HIF1α ifadeleri (Şekil 4 ile karşılaştırıldığında OGD / REOX başarıyla indüksiyon hipoksi indüklenebilir faktör 1 alfa artan çekirdek ifade ile tespit edildi (HIF1α 5H REOX ardından 2 saat OGD'ye tabi GFAP + astrositler gözlenen ).
(Şekil 5). Bu hücreler Nöral Kök Hücre (MGK) 26 potansiyel kaybetmek eğilimindedir nerede GFAP ve S100B olgunlaşmış astrositik gelişimsel aşaması karakterize, astrositlerde sitoplazma ve hücre gövdelerinde kolokalize bulundu. kendi normoksik ve OGD / REOX tedavi gruplarında görüldüğü gibi morfoloji ve GFAP veya S100B immunreaktivitelerinin yoğunluğu hem erkek hem de dişi astrosit kültürlerde benzerdi. Konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirilen; normoksik koşullar altında, hipokampal astrositler bir fuziform yapıda Polygonal ve düz morfolojisi [(ok 60X normoxia) Şekil 5A, B] sundu. Bu hücreler, önceden OGD / REOX indüksiyonuna yaklaşık 2 hafta içinde, birbirine karışana kadar bölmek mümkün. 2 saat OGD ve 5 saat REOX sonra astrositler klasik Reacti sergilediastrosit geri primer işlemleri gösteren morfolojisi, soma ve süreçleri hipertrofi ve GFAP nin arttırılmış ifadesi ve S100B ziyaretinde [Şekil 5A, B (OGD / REOX, 60X, ok başı)]. OGD / REOX sonra, GFAP / S100B boyama, erkek ve dişi hipokampal astrositler hem de sitoplazma boyunca uzanan geniş bir ağ örgüsü sergilemiştir. GFAP boş farelerden kültürlenen hipokampal astrositler gözlenen GFAP boyama olmaması negatif bir kontrol (Şekil 5B, ek) olarak görev yaptı. Yukarıdaki sonuçlar OGD-REOX maruz kaldığında GFAP / S100B-immünoreaktif astrositler morfolojisi önemli değişiklikler uğradığını doğrudan kanıtlar sunmaktadır.
Şekil P1 fareler ile Hipokampal Kaldırma Tekniği 1. illüstrasyonlar. 1. baş kaldırmak için yavruyu başını kesmek.Ince makas kullanarak 2, 3. cilt orta hat kesi yapmak, arka ön ve düz uçlu forseps yardımı ile cildi geri soyma. 4, 5, 6. Dibinde küçük bir kesi yapmak kafatası. Orta hat boyunca kafatası kesin ve beyin maruz uzakta iki yarısı soyun. 7, 8. Kavisli bir forseps yardımıyla beyincik çıkarın. 9. Dikkatle.. Steril bir Petri kabı içine 10, 11 kafatası ve yerden beyin kaldırmak beynin ventral yüzeyi kavisli bir forseps kullanarak yukarı bakacak şekilde, sonra keskin bir steril cerrahi bıçak. 12 her iki yarımkürede ayrı, böylece beyin çevirin, 13, 14. şişkin orta beyin ve talamik dokusu zedelemeden yarımkürede yatan ve hipokampus açığa çıkarın. 15, 16. kaldır hipokampus (küçük C şeklinde yapı). 17, 18. Hemen her ikisi elde edilen hipokampal lobları yer bir de hemisfer Steril HBSS içeren ayrı Petri kabı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yenidoğan Farelerde Şekil 2. Cinsiyet Tayini. A. (M 1 F 1) Fare seks genetik Myog (X kromozomu) ve parmak ve ayak kırpıntılardan ekstre edilmiş DNA kullanılarak Sry (E kromozomu) gen spesifik primerler ile PCR ile tespit edilmiştir. PCR bantları UV ışıması altında etidyum bromür ile bir% 2 agaroz jeli üzerinde görüntülenmiştir. F 2 ve M 2, sırasıyla, kadın ve erkek için pozitif kontrol olarak görev yaptı. B. kadından erkeğin görsel belirlenmesi anogenital açıklıkları (ok) arasında karanlık bir nokta belirleyerek tarafından kurulmuştur.urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil nöronal belirteç map2 (kırmızı) ve mikroglia işaretleyici IBA1 (yeşil) ile astrosit kültürü İlköğretim Fare Hipokampal Astrosit Kültür. Immün 3. Saflık. Çekirdekler 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanır. Ok mikroglia kirlenme gösterir. Ölçek çubuğu:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. HIF1α İfade olarak miydiGFAP (kırmızı) ve (A) normoxia veya (B) OGD'ye (2 saat) / REOX (5 saat) maruz astrositler HIF1α (yeşil) etiketleme gösteren OGD / REOX Maruz Kültür Hipokampal Astrositler katlanmış. Temsili immunofluorescent görüntüler. Çekirdekler 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanır. Düşük HIF1α ifadesini ok; ok ucu, HIF1α nükleer ifade yükselmiş. Ölçek çubuğu:. 25 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. üste düzenleme OGD-REOX aşağıdaki Cinsiyeti Belirli Hipokampal Astrosit Kültürlerinde S100B veya GFAP İfade. Cinsiyeti Belirli kültürlenmiş hipokampal astrositler normoksik koşullar altında ya da 2 sonra S110b ya GFAP ekspresyonu için boyandıH OGD REOX 5 saat (OGD / REOX) eklenmiştir. Ankastre: hipokampal astrosit 60X görüntü GFAP boş farelerden alınan kültüre. Ölçek çubuğu: 30 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fizyolojik ve patolojik koşullar altında astrositlerin cinsiyet özelliklerinin farklılıkları ve fonksiyon çalışma için, hücre kültürü içinde cinsiyette primer astrositler hazırlanması kullanılması için önemli bir araçtır. Bu çalışmada in vitro yenidoğan cinsiyetli hipokampal astrosit yüksek zenginleştirilmiş homojen nüfus (P0-P2) C57BL / 6 (vahşi tip) veya K19F (GFAP null) fare yavrular bir yüksek verimli ve kültürüne bir tekrarlanabilir bir yöntem sunduk. Bu metodoloji oluşturulması araştırmacılar in vitro iskemi sonrası cinsiyetli hipokampal astrosit fizyolojik ve patolojik fonksiyonları anlamamıza yardımcı olur.
tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için sindirilmiş doku toz haline getirildi tripsinizasyonla sterilitenin ve hipokampal loblar yeterli sindirim bakım dahil olmak üzere, bu yöntem kurulmasında iki kritik adım vardır. birincil astrositler önlenmesikontamine alma kültür süreci boyunca en büyük zorluklardan biridir. uygun bakım kabul değilse tekniği yaparken kültür hücreleri işe yaramaz hale gelebilir kontaminasyon iki ortak mod bakteriyel ve / veya mantar vardır. Bu nedenle, deneysel başarı sağlamak için, bir kullanarak, önce steril cerrahi ekipman ve malzemeler kullanılarak, kullanmak için çalışma yeri dezenfekte içeren bir steril çalışma ayarı altında işlemini gerçekleştirin steril olmayan yüzeylerle steril malzemelerin temasını önlemek için zorunludur laminer akış kaput laminer kaput dışında kapatılmamış kültür şişeleri alarak önlemek ve. Buna ek olarak, enzimatik ayrılma sırasında geniş bir fiziksel toz haline getirilerek, ardından tripsin ile hipokampal dokuların uzun inkübasyon kötü hücre canlılığı ve kültür şişeleri ayrışmış hücrelerin yetersiz bağlanma, böylelikle aşırı sindirim yol açabilir.
Aksine, beyin dokusunun underdigestion yeterli içerirböylece kötü verim ve büyük topaklar olarak hücrelerin tohumlama sonucu glia hücrelerinin ayrışma. Bu nedenle, sağlıklı bir astrosit kültürleri elde etmek amacıyla, hipokampal dokuların uygun sindirim elde etmek için tripsin konsantrasyonunun, inkübasyon süresi ve öğütme optimize etmek için gereklidir. Elimizde olanlar, 20 dikkatlice toz haline getirilerek, ardından oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 0.25 tripsin çalışma konsantrasyonu ile hipokampal lobların inkübasyon - 30 kat güçlü bir yapışık sağlıklı ve yüksek oranda çoğaltılabilir astrosit kültürleri elde edildi. Ayrıca, dondurma ve bunların etkinliğini azaltabilir her zaman kullanmadan önce reaktiflerin çözülme tekrarladı. Bu nedenle, küçük istenen miktarlarda ve dondurularak kısım reaktifler için çok önemlidir. Örneğin, kullanılana kadar -20 ° C'de çeşitli steril konik tüplerde 50 ml alikotları olarak 5 ml alikotları ve fetal bovin serum gibi mağaza tripsin, penisilin / streptomisin. Biz son kullanım tarihinden sonra antibiyotik kullanmayı tavsiye.
GFAP aw olduğunuReaktif elyaflı astrosit işaretleyici ell-ile karakterize edilir. Aşağıdaki OGD / REOX reaktif astrogliyozun yanıt olarak GFAP ekspresyonunun yukarıya doğru düzenlemesi 20 bildirilmiştir. O GFAP ekspresyonu yenidoğanlarda HI sonra nöronal onarım stratejileri için belirli bir hedef olarak hipokampal hasar 27 rolünü kullanılabileceği ileri sürülmüştür rağmen hala belirsizdir. GFAP'nin ile astrositlerin immünohistokimyasal boyama fizyolojik ve patolojik koşullar altında bu hücreleri belirlemek ve tanımlamak için bize sağlar. başka herhangi bir belirteç gibi GFAP boyama tanınan gereken bazı sınırlamalar vardır. astrosit GFAP boyama sınırlamalar biri değil tüm astrositler fizyolojik koşullar altında GFAP ifade olmasıdır. Özellikle GFAP'nin olgunlaşmamış astrosit ifadesi oranı fizyolojik koşullar altında 28 40% aşmaz. astrositlerde yaş ve tip-spesifik kullanıma bağlı olarak, tercih edilen diğer göstergeleri gibi GLAST ALD olarak kabul edilebilirH1L1, BLBP, Aquaporin-4 ve S100B 29.
Primer kültürlerinde astrositler göz ardı edilemez Dahası, NSC'lerde varlığı örtülü. Bu NSC'lerde GFAP ekspresyonuna dahil astrositler olgun içindeki fenotipik hem de ince özelliklerini mevcut olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, tamamen farklılaşmış ve olgunlaşmış astrositler için spesifik olan moleküler belirteçlerin tanımlanması şarttır. Astrositler onların daha sonra tamamen farklılaşmış gelişim aşamalarında ifade S100B bildirildi. Son zamanlarda, neonatal kortikal GFAP + astrositler yaklaşık DIV 15 26 meydana S100B ifadesinin başlangıcı ile progenitor kök hücre potansiyeli kaybolabilir bildirilmiştir. Aynı şekilde, DIV 14 bizim kültür koşullarında, GFAP ifade eden hücrelerin% 91 bulunmuştur kültürler öncelikle terminal farklılaşmış olgunlaştı hipokampal astrosit oluşur öneririz birlikte açığa S100B.
Astrosit tek tabaka üstünde ve altında bulunan mikroglial hücreleri kirlenmesine neden tamamen yoksun saf primer hipokampal astrosit kültürleri elde etmek neredeyse imkansızdır. Nedenle, astroglial kültürlerde mikroglia kirletici ve mümkün olduğu kadar düşük, bu oran tutmak için oranı bilmek önemlidir. Bu çalışmada potansiyel kirletici herhangi bir mikroglia veya nöronların varlığını belirlemek amacıyla mikroglia özel işaretleyici IBA1 veya nöronal belirteç map2 ile astrosit kültürleri boyandı. Kemirgen astrosit kültürü mikroglia oranı hayvan yaşı, türler, bölge, kültür ortamı, yöntem alt kültüre ve 30 sallayarak dahil çeşitli faktörlere bağlı olarak% 1 ila 30% değişebilir. Bizim kültürde diğer raporlar 25 ile karşılaştırılabilir mikroglial kontaminasyon yaklaşık% 6 gözlendi. astrosit kültürü kullanım amacı iltihabı hipokampal astrosit rolünü incelemek ise bu zorunludurDIV 3. LME başlayarak astrosit kültürlerde mümkün mikroglial kirlenmeyi elimine etmek için 10 gün boyunca 5 mM LME kültürleri tedavisinde mikroglia 20,22 çoğalan kaldırmak için bir yöntem olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır, bir mikroglial sitotoksik maddedir. Buna ek olarak, LME muamele edilmiş kültürler, bir çalkalama Protokol (1 saat boyunca 300 rpm) tabi olmalıdır.
OGD / REOX gerçekleştirmede başka teknik zorluk hipoksi yeterli bir derece astrogliasis ikna etmek için elde edilmiştir olmadığını tespit etmektir. astrositler hipoksi markerleri GFAP yukarı düzenlemesi ve HIF-1α indüklenmesini içerir. Bu nedenle, bu çalışma hipoksi GFAP bağışıklık tepkimesi artış ile teyit edilmiştir (Şekil 4) (veriler gösterilmemiştir) ve HIF1-α boyama upregülasyonu.
Özetle, cinsiyetli yenidoğan hipokampal astrosit kültürlerinden elde edilen sonuçlar sağlıklı homojen astrosit tabakası di başarılı hücre eki gösterdiIn-vitro iskemi indüksiyonu üzerine tipik lamelleri morfoloji ve büyük reaktif astrositik belirteçler GFAP ifade ve S100B eğimlendirme. Biz burada benimsenen protokol erkek ve kadın beyinleri gelişmekte olan astrositlerin rolüne ilişkin önemli mekanik ve translasyonel soruları cevaplamak için bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz. Mevcut tekniklerin çoğunluğu aksine tüm kültür prosedürü seks incelemek için bir araç olarak astrositik kültür yönteminin kullanımını kolaylaştıracak deneyler hızlı bir dönüş ve tekniğin basitliği verilmesi, iki hafta içinde olgun ve konfluan cinsiyetli hipokampal astrositler oluşturur böylece beyin gelişmekte olan beyin araştırmalarında geniş yayılmasını sağlayan glia hücrelerinin spesifik rolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
yazarların hiçbiri rakip veya çakışan çıkarları var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V.
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M.
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
