Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم غير الغازية لاختصاص البويضيه التنموية التي يتم إجراؤها أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال إلى المرحلة الثانية الطورية. يجمع هذا الأسلوب بين الوقت الفاصل بين التصوير الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV) وتحليل الشبكات العصبية.
Abstract
عيادات العقم ستستفيد من القدرة على تحديد تنمويا المختصة مقابل بويضات غير كفء باستخدام إجراءات غير الغازية، وبالتالي تحسين نتائج الحمل الشاملة. ونحن مؤخرا بوضع طريقة تصنيف استناداً إلى الملاحظات حية مجهرية من بويضات الماوس أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال (GV) إلى المرحلة الثانية الطورية، يليها تحليل تحركات هيولى وتحدث خلال هذه الفترة الزمني الفاصل. نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة من هذا الإجراء. بويضات معزولة عن المسام antral شجيرة ومثقف ح 15 داخل مجهر مجهزة لتحليل الوقت الفاصل بين شركة 37 درجة مئوية و 5%2. التقاط الصور في فواصل زمنية 8 دقيقة. ويتم تحليل الصور باستخدام الأسلوب فيلوسيميتري صورة الجسيمات (PIV) يحسب لكل البويضات، التشكيل الجانبي من "هيولى حركة السرعات" (متجهات) التي تحدث طوال فترة الثقافة. وأخيراً، يتم تغذية متجهات البويضات كل واحد من خلال أداة تصنيف رياضي (شبكات عصبونية اصطناعية تغذية إلى الأمام، والفن) التي تتوقع احتمال مشيج تنمويا مختصة أو غير مختصة بدقة 91.03%. يمكن اختبار هذا البروتوكول، تم إعدادها للماوس، الآن على بويضات أنواع الأخرى، بما فيها البشر.
Introduction
العقم الإناث هو أمراض التي تؤثر على عدد متزايد من النساء. ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، حوالي 20% أزواج المصابين بالعقم، مع 40% بسبب العقم الإناث. وبالإضافة إلى ذلك، أكثر من ثلث النساء تمر علاجات السرطان (300,000 في السنة والسنة 30,000 في الولايات المتحدة الأمريكية أو إيطاليا، على التوالي) وضع سابق لأوانه فشل المبيض.
استراتيجية لمنع العقم لدى مرضى السرطان هو عزلة ونعد جريبات المبيض قبل علاج الأورام، تليها في المختبر النضج (ناقلات) من بويضات غف إلى مرحلة صناعة المعلومات (مرحلة انتقالية غف للوزارة). أن تحسين توافر علامات غير الغازية الكفاءة الإنمائية البويضيه التسميد والعمليات الإنمائية ونجاح الحمل الشاملة1،2.
استناداً إلى التكوين الخاص بها الكروماتين ولاحظ بعد تلطيخ مع فلوروتشرومي سوبرافيتال هويشت 33342، بويضات الثدييات شجيرة تصنف أما محاطة نوية (SN) أو لا تحيط نوية (تسويق)3. بالإضافة إلى منظمتهم الكروماتين مختلفة، عرض هذين النوعين من بويضات العديد من الاختلافات المورفولوجية والوظيفية3،،من45،،من67،8 ،9، بما في ذلك اختصاصها هو والإنمائية. عندما عزل من المبيض ونضجت في المختبر، كل نوع من بويضات الوصول إلى مرحلة صناعة المعلومات، وبعد التلقيح الحيوانات المنوية، تطوير إلى مرحلة 2-الخلية، ولكن فقط تلك مع منظمة الكروماتين SN قد وضع لمدة9. على الرغم من أن جيدة كطريقة تصنيف لاختيار المختصة مقابل بويضات غير كفء، العيب الرئيسي هو تأثير مطفرة فلوروتشرومي نفسها، وقبل كل شيء، الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة للكشف عنها قد يكون على الخلايا.
ولجميع هذه الأسباب، بحثنا عن علامات أخرى غير الغازية المرتبطة بتكيف الكروماتين التعطيل أو تسويق التي يمكنها أن تحل محل استخدام هويشت مع المحافظة على دقة عالية التصنيف نفسه. ملاحظة الوقت الفاصل بين "سرعات الحركة هيولى" (متجهات) تبرز كسمة مميزة لحالة خلية. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الأخيرة سجلت الرابطة بين متجهات وقت الإخصاب وقدرة الماوس و zygotes البشري الجيني الكامل والتنمية الكاملة ومدتها10،11.
وبناء على هذه الدراسات السابقة، يصف لنا هنا منبرا للاعتراف بالماوس تنمويا المختصة أو غير كفء بويضات شجيرة5،6،،من78. يقوم المنهاج على ثلاث خطوات رئيسية: 1) تصنف بويضات معزولة عن المسام antral أولاً استناداً إلى تكوين الكروماتين أما نوية محاطة (SN) أو نوية يحيط عدم (تسويق)؛ 2) تؤخذ صور الوقت الفاصل بين متجهات التي تحدث أثناء فترة الانتقال غف للوزارة لكل واحدة من البويضات وتحليلها مع الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV)؛ و 3) يتم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع PIV مع تغذية إلى الأمام مصطنعة العصبية شبكة (الفن) لتصنيف أعمى12،13. يمكننا إعطاء تفاصيل عن الخطوات الأكثر أهمية من الإجراءات المصممة للماوس لجعلها جاهزة متوفرة يمكن اختبارها واستخدامها لأنواع الثدييات الأخرى (مثل الأبقار، والقرد والبشر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام واللجان الأخلاقية في جامعة بافيا. وأبقى على الحيوانات تحت ظروف من 22 درجة مئوية، والرطوبة الجوية 60% ودورة الضوء/الظلام من 12:12 ح.
1. عزل المبيض
- حقن إينترابيريتونيلي 2 أربع إلى عشر أسبوع CD1 الإناث الفئران مع 10 يو من المسام تنشيط هرمون مع حقنه الأنسولين معقمة 1 مل.
- انتظر ح 46-48.
- وزن الماوس وتخدير مع حقن العضل 50 مغ/كغ من زوليتيل (كلوريدراتي تيليتامينا وزولازيبان). Euthanize بخلع عنق الرحم.
- فهم الجلد الذي يغطي جدار البطن باستخدام زوج من ملقط تشريح. قطع الجلد وفتح جدار الجسم مع زوج من مقص وسحب الشق بالملقط.
- استخدام زوج من ملاقط، نقل الشجاعة جانبا، تحديد قرون الرحم وتعريب المبايض في أقصى ما.
- بلطف عقد المبيض باستخدام الملقط الساعاتي واستخدام مقص لقطع في أربطة الرحم. كرر مع المبيض الأخرى.
- نقل المبيض التي جمعت في طبق بتري ثقافة خلية 35 ملم يحتوي على 1 مل متوسطة العزلة M2 استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 في الهواء.
- إزالة الدهون وقناة استخدام مقص جيد تحت ستيريوميكروسكوبي.
2-عزل مجمعات البويضيه Cumulus
- ثقب سطح المبيض باستخدام ملاقط معقمة وابرة الأنسولين معقمة ز 1 حتى يتم تحرير مجمعات البويضيه cumulus أنترال (COCs) سلبية.
- جمع COCs مع أكثر من ثلاث طبقات من الخلايا الركام باستخدام يسيطر عليها الفم سحبت يد باستور ميكروبيبيتي (200 ميكرومتر في القطر) وتحويلها إلى قطره 300 ميليلتر من جديد M2 المتوسطة.
- إزالة الركام الخلايا المحيطة ببويضات استخدام سحب اليد على باستور ميكروبيبيتي (80 ميكرومتر في القطر) بلطف بيبيتينج والخروج لبضع ثوان،
- مرارا وتكرارا نقل بويضات من قطره 20 ميليلتر المتوسطة M2 إلى واحد آخر، حتى يتم القضاء تماما على خلايا الركام.
3-الكروماتين البويضيه المستندة إلى منظمة التصنيف
- إعداد الحل هويشت 33342 المصبوغة بتركيز 0.05 ميكروغرام/مل في M2 المتوسطة بدءاً من حل أم 5 ملغ/مل مخففة في برنامج تلفزيوني 1 x نهائي.
- ضع 3.5 قطرات مايكرو ميليلتر من هويشت تلطيخ الحل في الجزء السفلي من غطاء صحن بتري 35 ملم.
- نقل كل البويضات واحدة في هويشت تلطيخ قطره، ضع الطبق على لوحة تدفئة حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) وتغطية ذلك مع غطاء الظلام لتجنب المعرض الضوء.
- بعد 10 دقائق من حضانة في درجة حرارة الغرفة، التقيد بويضات مع مجهر الأسفار في 10 X التكبير تحت الأشعة فوق البنفسجية (330-385 nm)، لا يزيد عن 1-2 s.
- تصنيف بويضات نوية محاطة (SN) (الشكل 1A)، إذا فإنها تعرض حلقة من الكروماتين هويشت الإيجابية المحيطة نوية.
- تصنيف بويضات نوية لا محاطة (تسويق)، إذا لا محاط بهم نوية هويشت إيجابية الكروماتين ويظهر تفريق البقع heterochromatic داخل النواة (الشكل 1B).
4. تصنيف العصبية البويضيه المستندة إلى شبكة الاتصال
- إعداد أربعة 2 ميليلتر قطرات من المتوسطة α-الفنزويلية تستكمل مع إبطال الحرارة 5% الجنين المصل البقري، 2 مم L-الجلوتامين، توراين 5 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين، 75 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وبيروفات 23.5 ميكروغرام/ميليلتر الصوديوم في كوب 35 ملم أسفل طبق بيتري وغطاء لهم مع المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) والزيوت المعدنية قبل متوازن لتجنب التبخر متوسطة.
ملاحظة: إذا كان استخدام نظام فحص الخلايا حية، تبقى القطرات على مسافة معينة باستخدام شبكة تعادل 7 مم × 7 ملم كمبدأ توجيهي. - نقل 3-4 بويضات لكل قطره.
- ضع أسفل الزجاج طبق بيتري في نظام فحص الخلية حية، مجهزة بتسجيل الوقت الفاصل بين البرامج (انظر الجدول للمواد)، والذي يسمح مراقبة نضوج البويضات في بيئة ذات درجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية) وشركة2 تركيز (5%).
- فتح تسجيل الوقت الفاصل بين البرامج. على الشاشة تظهر نافذة برصاصة حية البويضيه على الجانب الأيسر وجميع الأزرار الإعداد على الجانب الأيسر.
- حدد مركز البويضيه لوضعه في مركز الشاشة. ضبط التركيز إذا لزم الأمر.
- حدد الزر الأس الهيدروجيني وتعيين ضياء المصباح إلى 192؛ زمن التعرض إلى 1/125 s؛ الحصول إلى 1.99؛ و القرار 1600 ×1200.
- حدد FL2 وتعيين ضياء المصباح إلى 5؛ زمن التعرض إلى 3 ق؛ الحصول على 2.37؛ و القرار 1600 ×1200.
- حدد الزر نقطة جديدة من أجل تسجيل موقف البويضات داخل قطره الثقافة. كرر نفس الروتينية لكل البويضات داخل قطره الثقافة.
- حدد الوقت وتعيين دورة اقتناء 8 دقيقة و الوقت الإجمالي الذي ح 15.
- حدد تاريخ بدء الوقت الفاصل بين لبدء دورة تسجيل.
- فتح برنامج MATLAB وكتابة >>cell_piv؛ ثم قم بتحديد أداة PIV.
- اختر المجلد الذي يحتوي فيلم مسجل وقم بتحديد أي من ملفات.jpeg لتحميل تسلسل الصورة بأكملها. لكل البويضات، حدد المنطقة التي تهم (ROI) بواسطة النقر فوق حدد أداة المساحة.
- حدد PIV العملية في القائمة ملف. حدد الزر أداة عارض .
ملاحظة: البرنامج سيقوم بحساب متجهات السرعة في العائد على الاستثمار وينتج تلقائياً ملف بيانات، يتم حفظها كملف.mat. - حدد الملف.mat لفتح. حدد الزر أداة "تحديد العائد على الاستثمار" ، ورسم دائرة حول الخطوط العريضة للبويضات. انقر فوق حفظ ضمن القائمة ملف.
ملاحظة: يتم الآن عرض ناقلات المرض في هذه المنطقة، وتحديث البيانات حجم متوسط في نافذة الرسم البياني لهذا العائد على الاستثمار الجديد. - فتح البيانات المجمعة متوسط حجم الإطارات الوقت الفاصل بين كل سجلت في جدول بيانات، مع، في الصفوف، تسلسل الإطار، وعلى الأعمدة، كل البويضات واحدة تحليل.
- تنظيم بيانات بويضات الزلزالين والتعطيل إلى 10 مجموعات فرعية.
- استخدام 9 مجموعات فرعية لتدريب الشبكة العصبية الاصطناعية تغذية إلى الأمام تكراري (الفن) والفرعي 1 لاختبار أعمى.
- تكرار آخر 9 مرات، تغيير نموذج اختبار أعمى (إذ الصليب-التحقق من الصحة).
- MATLAB بفتح وتشغيل برنامج نصي مخصص الصنع الرئيسية ، وبناء على طلبها، بإدراج اسم الملف مع البيانات التدريب (train.txt)، عدد بويضات الزلزالين والتعطيل التي تستخدم للتدريب والفاصل الزمني للوقت الفاصل لتحليل (عادة، من الإطار رقم 1-2 الإطار # 112-113).
- اضغط إدخال لأداء التدريب.
- إدراج اسم الملف الذي يحتوي بيانات الاختبار (test.txt).
- فتح متجه test_outputs_cyt في MATLAB مساحة العمل.
ملاحظة: تظهر نافذة على شاشة عرض، في الصف الأول، أن احتمال الحصول على إيجابيات حقيقية (TP أو تسويق الحقيقية) والمغلوطة (FP أو تسويق كاذبة) لبويضات الزلزالين والتعطيل، على التوالي؛ بدلاً من ذلك، في الصف الثاني، أن احتمال الحصول على سلبيات كاذبة (FN أو التعطيل كاذبة) والسلبيات الحقيقية (TN أو التعطيل الحقيقي) لبويضات الزلزالين والتعطيل، على التوالي. - باستخدام الصيغة: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)، حساب دقة الفن، معبراً عنه بنسبة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 البويضيه تنمويا المختصة وغير كفء ممثل، على التوالي في البداية (GV) وفي نهاية الإجراء ناقلات الأمراض (الوزارة). ناقلات الأمراض بويضات الماوس شجيرة يحدث خلال الثقافة ح 15. ملاحظة الوقت الفاصل بين سجلات تقدم الانقسام والكشف عن الأحداث هو الرئيسية، بما في ذلك جفبد وقذف الجسم القطبي الأول.
وأظهر تحليل ومقارنة تنمويا المختصة مقابل أكثر من 200-بويضات غير كفء فروق التوقيت في التقدم للانقسام. على وجه التحديد، في بويضات الزلزالين، جفبد هو تأخير كبير الإطارات الوقت الفاصل بين 1-2، بينما يحدث قذف PB1 مع تأخير 15 لقطة. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، التباين مرتفعة للغاية للسماح بتصنيف واحد البويضيه. ولهذا السبب، تم تنفيذ الإجراء مع أداة تصنيف رياضي.
ويبين الشكل 3 مخطط لأداة تصنيف الرياضية المستخدمة، المسماة تغذية إلى الأمام مصطنعة العصبية شبكة (الفن). للبويضات كل بنك الاحتياطي الفيدرالي من خلال، يعطي الفن في نفس الوقت احتمالية المشيج مختصة تنمويا واحتمال أنها البويضات غير كفء. في تجاربنا، تصنف الفن بويضات الماوس مع دقة يعني 91.03%.
الشكل 1 . الممثل بويضات التعطيل والزلزالين ملطخة هويشت 33342- وبعد عزلة وتلطيخ مع fluorochrome هويشت 33342، تصنف بويضات شجيرة أما كما حاصرت نوية (SN) (A) أو لا تحيط نوية (تسويق) (ب)، اعتماداً على وجود (سهم) أو عدم وجودها، على التوالي، من عصابة من Heterochromatin هويشت الإيجابية المحيطة نوية. شريط الحجم: 5 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تحليل "فيلوسيميتري صورة" الجسيمات من الوقت الفاصل بين الصور- فيما يلي نتائج التحليل PIV الصورة المشرقة الميدانية لكل من الإطارات الوقت الفاصل بين 113 حلل. ويوضح الشكل (GV) البداية والنهاية (الوزارة) عملية التسجيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . التمثيل التخطيطي "الشبكة العصبية الاصطناعية" تغذية إلى الأمام. الفن هو أداة رياضية تستخدم لتصنيف بويضات تنمويا المختصة أو غير كفء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك عدة خطوات حاسمة واحدة يجب العناية أثناء تنفيذ هذا البروتوكول مع بويضات الماوس وكذلك مع تلك الأنواع الأخرى. مرة واحدة معزولة عن تلك المسام، بويضات ينبغي نقلها فورا إلى قطرات التسجيل، كما الفصل من الركام رفيق الخلايا المشغلات بداية الانتقال غف لوزارة صناعة المعلومات. إمكانية إدخال تعديل على هذا البروتوكول يمكن إضافة 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) M2 الوسيلة المستخدمة لعزل COCs. إيبمكس يمنع تحريك فوري الانتقال غف لصناعة المعلومات ويسمح لمزامنة مجموعة تجريبية كاملة من بويضات.
نظام فحص الخلية الحية المستخدمة في تجاربنا (انظر الجدول للمواد) يحد من عدد قطرات النضج إلى 4 مع 4 بويضات كل قطره ماء، وهكذا إلى ما مجموعة 16 بويضات كل تجربة. ويمكن التغلب على هذا القيد استخدام أخرى نظم فحص خلية يعيش الوقت الفاصل بين، المتاحة تجارياً ومجهزة بدوائر الثقافة عدة.
استناداً إلى تجربتنا، تسجيل الفاصل الزمني بين إطار وما يلي نقطة حرجة. وبعد عدد من التجارب الأولية، أخذنا الصور كل دقيقة 8 لأن هذا هو الحد الأدنى من الوقت الإطار الذي يسمح بمراقبة واضح من الأحداث الكبرى التي تحدث خلال الفترة الانتقالية غف لوزارة صناعة المعلومات، مثل انهيار فيسسيكلي جيرمنال وقذف الجسم القطبي الأول. قد تحتاج هذه النافذة الزمنية يكون درسه عند مراقبة بويضات أنواع الأخرى.
عيب هذه الطريقة هي ثقافة بويضات في غياب تلك الخلايا الركام المحيطة بها، كما هي معروفة لزيادة تحسين الانتقال غف لوزارة صناعة المعلومات. في هذا الصدد، هو اختبار المختبر الآن تعديلاً طفيفا على المبلغ عنها البروتوكول قبل بما في ذلك ثقافة خالية من الركام بويضات عند طبقة تغذية خلايا الركام.
بحكم طبيعته، الفن بعدد ثابت من المدخلات (عدد الوحدات النمطية لتحليل CMV) والمخرجات (أما البويضات تنمويا مختصة أو غير مختصة) الخلايا العصبية، ولكن عدد الخلايا العصبية المخفية يتم اختياره من قبل المحقق من خلال المحاكمة وتصحيح نهج للحصول على أفضل أداء التنبؤ. في حالتنا، جربت مع أرقام مختلفة من الخلايا العصبية الخفية، ووجد أن ثلاثة يعطي نتائج أفضل. أيضا، تتطلب تحليلات الفن عدد كبير من بيانات الإدخال (بوحدات CMV 112 لدينا تجارب) للحصول على إحصاءات قوي. تحسين ممكنة التي يمكن أن تقلل من العدد من الضروري إدخال البيانات هو استخدام أدوات التصنيف بديلة، مثل "دعم مكافحة ناقلات آلة"، حقيبة شجرة، أو مصنفات KNN. عند تحليل الفن يدل على متانة، يمكن القضاء على الخطوة 1 من هذا الإجراء.
ويمكن اختبار هذا البروتوكول، تم إعدادها للماوس، على بويضات أنواع الأخرى بما فيها البشر. وعلاوة على ذلك، المزيج من الوقت الفاصل بين تسجيل مع PIV والشبكات العصبية تحليلات يمكن استغلالها لمراقبة متجهات في10،زيجوتيس11 وفي الأجنة بريمبلانتيشن لتقييم المزيد الإمكانات التنموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقدم هذا العمل ممكناً بفضل دعم من: جامعة بافيا الغواتيمالية عام 2016؛ جامعة بارما سن الفيل عام 2014، عام 2016؛ و Kinesis لتوفير بلاستيكواري اللازمة للاضطلاع بهذه الدراسة. ونحن نشكر الدكتور شين وندسور (كلية الهندسة، جامعة بريستول، المملكة المتحدة) لتوفير البرمجيات Cell_PIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
