الثقافة وتعداء الخلايا الابتدائية الزرد
Summary
نقدم بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الثقافات الخلية الابتدائية الأجنة الزرد تعداء وتصوير الخلايا الحية، فضلا عن بروتوكول لإعداد الخلايا الأولية من الدماغ الزرد الكبار.
Abstract
وتتطور بسرعة خارج الأم، مما يسمح لتصوير ممتازة في فيفو للعمليات البيولوجية الحيوية في فقاريات سليمة والنامية الأجنة الزرد تتسم بالشفافية. ومع ذلك، تصوير مفصل مورفولوجيس من أنواع مختلفة من الخلايا والهياكل سوبسيلولار محدودة في يتصاعد كله. ولذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام للثقافة الحية الأولية الخلايا من الأجنة الزرد والأنسجة الكبار.
وباختصار، 2 أجنة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية ديتشوريوناتيد، دييولكيد، تعقيم، وفصلها إلى الخلايا المفردة مع كولاجيناز. بعد خطوة ترشيح، هي الخلايا الأولية مطلي على الأطباق أسفل الزجاج والمزروعة لعدة أيام. يمكن استخدام الطازجة الثقافات، قدر طويل الأجل ديفيرينسياتيد منها، [كنفوكل] دراسات التصوير عالية الدقة. الثقافة تحتوي على أنواع الخلايا المختلفة، مع striated myocytes ويجري بارزة في طلاء بولي-L-يسين من الخلايا العصبية. على وجه التحديد تسمية الهياكل سوبسيلولار بالبروتينات علامة نيون، أنشأنا أيضا بروتوكولا انهانسر الذي يسمح تعداء بلازميد الحمض النووي إلى أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. وهكذا، حضور المشغل حوافز محددة وسلوك الخلية المعقدة، والديناميات داخل الخلية من الخلايا الأولية الزرد يمكن تقييم مع عالية الدقة المكانية والزمانية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام الدماغ الزرد الكبار، علينا أن نظهر أن الأسلوب وصف الانفصال، فضلا عن تثقيف الشروط الأساسية، تعمل أيضا للأنسجة الزرد الكبار.
Introduction
الزرد (دانيو rerio، ريريو دال) نموذج شعبية فقاريات للعديد من المجالات للبحوث الطبية الحيوية والأساسية1. الزرد الأجنة تتطور بسرعة خارج الرحم، وتتسم بالشفافية، وتناسب تحت مجهر، وبالتالي توفير المتطلبات الأساسية ممتازة لدراسة تطوير الفقارية في حي. سبب الصوبة الوراثية لالزرد2، أنشئت خطوط مراسل المعدلة وراثيا مستقرة العديد من الخلية المحددة بنوع التعبير عن مختلف علامات مضيئة السماح لمراقبة السكان خلية معينة. المجتمع الزرد مجموعة متنوعة واسعة من ما يسمى خطوط Gal4–السائق الذي حمل التحوير الإعراب عن Kal4TA4 الاصطناعية (أو جالف ما يعادل KalTA3) الجينات مع المجال Gal4-الحمض النووي-ملزم للخميرة تنصهر فيها تفعيل الترانسكربتي الفيروسية المجالات الخاضعة للخلية المحددة بنوع معززات. وعبرت هذه الخطوط برنامج تشغيل لخطوط المستجيب التي تحمل المتسلسلات تتألف من معرفة المنبع تفعيل تسلسل (UAS) تنصهر فيها جين مراسل. بروتين Kal4TA4 يربط عنصر UAS، وبالتالي تنشيط الخلية التعبير نوع الجنين من3،4الجينات مراسل. ويسمح هذا النهج للدراسات اندماجي شديدة التنوع من تقريبا جميع العناصر المتاحة محسن ومراسل في الحيوانات المحورة وراثيا مزدوجة.
ومع ذلك، محدودة تصوير حية متعمقة مع التركيز على خلايا فردية أو محتوياتها سوبسيلولار في جنينا كامل والمتغيرة باستمرار. ولمعالجة المسائل البيولوجية خلية محددة بدقة أعلى، غالباً ما الأفضل استخدام الثقافات الخلية. توجد بعض خطوط الخلايا من الزرد، ولكن تعتبر بشكل كبير المحدد5،،من67 وما نشر في كثير من الأحيان مضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، جميع خطوط الخلية المتوفرة هي تنتجها الخلايا الليفية المشتقة، يحد من تجارب باستخدام زراعة الخلايا إلى نوع واحد من الخلايا. لذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الخلايا الابتدائية مباشرة من الدماغ الكبار الزرد، جنبا إلى جنب مع اتباع نهج لزيادة طول عمر الثقافة وتوسيع تنوع المزروعة والأجنة الزرد أنواع الخلايا. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم إجراء ترانسفيكت الخلايا الجنينية الأولية مع ثوابت التعبير عن علامات عضية الفلورسنت. وهكذا، يمكن تحليل مورفولوجيس الخلوية وهياكل سوبسيلولار مع عالية الدقة المكانية والزمانية في أنواع الخلايا المتميزة التي تحتفظ بملامحها الرئيسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم اثنين من البروتوكولات المختلفة لثقافة الخلايا الأولية من إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد الأجنة أو الدماغ الزرد الكبار.
إعداد الثقافات الخلية الأولية من 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد من السهل نسبيا لإجراء لأي شخص لديه خبرة في مجال تقنيات ثقافة الخلية الأساسية. لل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر فريتش ت. وينده أولاً وألف وولف-عاصيبورج س. م. توكارسكي للرعاية الحيوانية الممتازة والدعم التقني. ونحن ممتنون لجميع الأعضاء في مختبر Köster لإجراء مناقشات مكثفة ومفيدة. ونعترف مع الامتنان التمويل الأوقيانوغرافية ألماني (كو عام 1949/5-1) والدولة الاتحادية من ساكسونيا السفلي، Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Biologia do Desenvolvimento. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Biologia do Desenvolvimento. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Biologia do Desenvolvimento. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
