תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה
Summary
אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.
Abstract
דג זברה עוברי שקופים ולפתח במהירות החוצה האמא, ובכך מאפשר עבור מעולה ויוו הדמיה של תהליכים ביולוגיים דינמי ב חוליות שלמים ולא המתפתח. עם זאת, ההדמיה מפורט של מורפולוגיות של סוגי תאים נפרדים ומבנים subcellular מוגבל כל טעינות. לכן, הקמנו פרוטוקול יעיל, קל לשימוש לתאים הראשי חיים בתרבות של דג זברה עוברי ורקמות למבוגרים.
בקצרה, 2 dpf דג זברה העוברים הם dechorionated, deyolked, עיקור, חלופה מועדפת על תאים בודדים עם collagenase. לאחר שלב סינון, התאים הראשי מצופה על גבי כלי הזכוכית התחתונה וטיפח במשך מספר ימים. תרבויות טריים, ככל ארוך המונח differenciated אלה, יכול לשמש עבור מחקרי הדמיה קונאפוקלית ברזולוציה גבוהה. התרבות מכיל סוגי תאים שונים, עם נייטרלים מפוספס, נוירונים להיות בולט על ציפוי פולי-L-ליזין. במיוחד תווית subcellular מבנים על-ידי סמן פלורסנט חלבונים, הקמנו גם פרוטוקול אלקטרופורציה המאפשר תרביות של תאים של פלסמיד DNA לתוך לסוגי תאים שונים, לרבות נוירונים. לפיכך, בנוכחות המפעיל מוגדר גירויים בהתנהגות התא מורכבת, הדינמיקה תאיים של ראשי דג זברה תאים יכול להידרש עם רזולוציה גבוהה יכולות. בנוסף, באמצעות המוח דג זברה למבוגרים, נדגים את הטכניקה המתוארת דיסוציאציה, וכן את התנאים הבסיסיים culturing, גם עובד בשביל דג זברה בוגרת רקמות.
Introduction
דג זברה (רזבורה rerio, rerio ד) הוא מודל פופולרי חוליות עבור שדות רבים של מחקר ביו-רפואי בסיסי1. דג זברה עוברי לפתח במהירות לשעבר עם רחם, שקוף, ובכושר תחת מיקרוסקופ, ובכך לספק תנאים מוקדמים מעולה ללימוד פיתוח חוליות אורגניזם חי. עקב ללקוחות שלנו גנטי של דג זברה2, קווים רבים כתב מהונדס יציב עם תא ביטוי ייחודיים לסוג של סמני פלורסנט שונים שהוקמו המאפשר התבוננות אוכלוסיות תאים מסוים. הקהילה דג זברה מציעה מגוון רחב של קווי Gal4-נהג כביכול הנושאות של transgene לבטא את Kal4TA4 סינתטי (או את GalFF KalTA3-שוות-ערך) ג’ין עם התחום Gal4-הדי-איגוד של שמרים התמזגו להפעלה תעתיק ויראלי דומיינים תחת השליטה של מוצרי טיפוח טבעיים ייחודיים לסוג התא. קווים אלה הנהג הם חצו לקווים אפקטור הנושאות transgenes המכיל המוגדר במעלה הפעלת רצף (UAS) דבוקה של גן מדווח. החלבון Kal4TA4 מאגד לרכיב UAS, ולכן מפעיל את הביטוי סלקטיבית סוג תא של3,גן4לכתב. גישה זו מאפשרת ללימודי קומבינטורית מאוד מגוונת של כמעט כל זמינות enhancer וכתבת אלמנטים בבעלי חיים כפול-הטרנסגניים.
עם זאת, מעמיק הדמיה בשידור חי עם דגש על תאים בודדים או התוכן subcellular שלהם מוגבל של העובר כל ומשתנה כל הזמן. כדי לטפל השאלות הביולוגיות תא ספציפי עם הרזולוציה הגבוהה, השימוש של תרביות תאים עדיפה לעיתים קרובות. כמה שורות תאים של דג זברה קיימים, אבל הם נחשבים בכבדות שנבחר5,6,7 , הפצת שלהם הוא לעתים קרובות גוזלת זמן. יתר על כן, כל הקווים תא זמינים הם פיברובלסט נגזר, הגבלת ניסויים באמצעות תרבית תאים לסוג אחד של תאים. לכן, הקמנו שתי פרוטוקול קל לשימוש ויעיל להכין ראשי תאים ישירות מן העוברים דג זברה והמוח דג זברה למבוגרים, יחד עם גישות להגדיל את תוחלת החיים של התרבות, להרחיב את המגוון של מעובדים סוגי תאים. בנוסף, אנו מציגים את הליך transfect תאים עובריים ראשי עם ביטוי בונה עבור סמני אברון פלורסנט. לפיכך, מורפולוגיות הסלולר ומבנים subcellular ניתן לנתח עם רזולוציה גבוהה יכולות סוגי תאים נפרדים אשר שומרים על תכונות המפתח שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן מוצגים שני פרוטוקולים שונים לתאים ראשי תרבות 2 dpf דג זברה עוברי או דג זברה בוגרת המוח.
הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה dpf 2 קל יחסית לבצע עבור מישהו עם ניסיון בטכניקות התרבות התא הבסיסי. עם זאת, כדי להשיג תוצאות טובות לשחזור, מספר מספיק של עוברי כמתחילה חומר חיוני (100 הוא ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Fritsch ט, א וולף-Asseburg, אני לינדה, ש- M. Tokarski טיפול בבעלי חיים מעולה ותמיכה טכנית. אנו אסירי תודה לכל חברי המעבדה Köster לדיונים אינטנסיבי ויעיל. אנו להכיר בהכרת תודה ממימון של פתוח (KO 1949/5-1) ובין המדינה הפדרלית סקסוניה התחתונה, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Biologia do Desenvolvimento. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Biologia do Desenvolvimento. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Biologia do Desenvolvimento. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
