Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish
Summary
Vi presentiamo un protocollo efficiente e facile da usare per la preparazione di colture cellulari primarie di embrioni di zebrafish per la transfezione e live cell imaging nonché un protocollo per preparare cellule primarie dal cervello di zebrafish adulto.
Abstract
Embrioni di zebrafish sono trasparenti e sviluppano rapidamente di fuori della madre, consentendo in tal modo eccellente in vivo imaging dei processi biologici dinamici in un vertebrato intatto e in via di sviluppo. Tuttavia, le immagini dettagliate delle morfologie di tipi distinti delle cellule e strutture subcellulari sono limitato in tutto monta. Quindi, abbiamo stabilito un protocollo efficiente e facile da usare per coltura primaria di cellule vive da embrioni di zebrafish e tessuto adulto.
In breve, di 2 embrioni di zebrafish dpf sono dechorionated, deyolked, sterilizzato e dissociato di singole cellule con collagenasi. Dopo una fase di filtrazione, cellule primarie sono piastrate su piatti di vetro inferiore e coltivate per diversi giorni. Colture fresche, per quanto a lungo termine differenziata quelli, possono essere utilizzati per studi di imaging confocale ad alta risoluzione. La cultura contiene diversi tipi di cellule, con miociti striati e neuroni essendo prominente sul rivestimento di poli-L-lisina. A label specificamente le strutture subcellulari di proteine marker fluorescente, abbiamo anche stabilito un protocollo di elettroporazione che permette la transfezione del DNA del plasmide in tipi differenti delle cellule, compresi i neuroni. Così, in presenza di operatore stimoli definiti, comportamento delle cellule complesse e dinamiche intracellulare delle cellule zebrafish primario può essere valutata con elevata risoluzione spaziale e temporale. Inoltre, utilizzando il cervello adulto zebrafish, dimostriamo che la tecnica descritta dissociazione, come pure le condizioni di coltura di base, funzionano anche per il tessuto di zebrafish adulto.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio, d. rerio) è un modello popolare vertebrato per numerosi campi della ricerca biomedica di base1. Embrioni di zebrafish ex uterosi sviluppano rapidamente, sono trasparenti e si adattano al microscopio, fornendo così eccellenti prerequisiti per lo studio di sviluppo vertebrato in un organismo vivente. A causa della genetica trattabilità di zebrafish2, molte linee di reporter transgenici stabile con espressione di tipo specifico delle cellule di vari marcatori fluorescenti sono state stabilite consentendo l’osservazione di popolazioni cellulari specifici. La comunità di zebrafish offre un’ampia varietà di cosiddette linee Gal4-driver che trasportano un transgene esprimendo il Kal4TA4 sintetico (o il GalFF di KalTA3-equivalente) gene con il dominio di legame del DNA, Gal4 di lievito fusa per attivazione trascrizionale virale domini sotto il controllo di rinforzatori di tipo specifico di cellule. Queste linee di driver sono incrociate alle linee dell’effettore che trasportano transgeni che consiste di una sequenza d’attivazione a Monte definita (UAS) fusa a un gene reporter. La proteina Kal4TA4 si lega all’elemento UAS, attivando così l’espressione di tipo selettivo delle cellule del reporter gene3,4. Questo approccio consente studi altamente diversificati combinatoriali di quasi tutti gli elementi disponibili enhancer e reporter in animali transgenici doppio.
Tuttavia, approfondita formazione immagine dal vivo con focus su singole celle o del loro contenuto subcellulare è limitata in un embrione intero e in costante evoluzione. Per rispondere a domande biologiche cellulari specifici con risoluzione più alta, l’uso di colture cellulari è spesso preferibile. Alcune linee di cellule di zebrafish esistono, ma sono considerati come fortemente selezionato5,6,7 e la loro propagazione è spesso richiede molto tempo. Inoltre, tutte le linee cellulari disponibili sono dei fibroblasti derivati, limitando esperimenti utilizzando colture cellulari per un tipo di cellule. Quindi, abbiamo stabilito un protocollo sia efficiente e facile da usare per preparare cellule primarie direttamente da embrioni di zebrafish e cervello di zebrafish adulto, insieme ad approcci per aumentare la longevità della cultura e di ampliare la diversità di coltivato tipi di cellule. Inoltre, presentiamo una procedura per transfect cellule embrionali primari con costrutti di espressione per i marcatori fluorescenti organello. Così, cellulari morfologie e strutture subcellulari possono essere analizzati con elevata risoluzione spaziale e temporale in tipi distinti delle cellule che mantengono le loro caratteristiche chiave.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo due differenti protocolli di cellule di coltura primaria da 2 embrioni di zebrafish dpf o cervello adulto zebrafish.
La preparazione di colture cellulari primarie da 2 dpf zebrafish è relativamente facile da eseguire per qualcuno con esperienza in tecniche di coltura cellulare di base. Tuttavia, per ottenere risultati buoni e riproducibili, è cruciale un numero sufficiente di embrioni come materiale di partenza (100 è il minimo). Durante la raccolta degli embrioni, tutte le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde e S.-M. Tokarski per eccellente cura degli animali e supporto tecnico. Siamo grati a tutti i membri del laboratorio Köster per discussioni intense e utili. Noi riconosciamo con gratitudine il finanziamento da parte del Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) e lo stato federale della Bassa Sassonia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
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